在此，我们介绍一种诱导移植耐受的方案，并对其进行评估 体外 和 体内 受者不同细胞亚群的抑制能力以及受者对供者或外源性抗原的免疫状态。
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本文内容
摘要
摘要
移植领域的主要关注点是通过诱导调节性细胞来实现特异性耐受。对耐受机制的理解需要可靠的模型。本文描述了通过阻断共刺激信号或通过基因转移上调免疫调节分子而在大鼠中建立的心脏同种异体移植物耐受模型。这些模型中的每一种均允许 体内 调节性细胞（如调节性T细胞（Tregs）、调节性B细胞（Bregs）或调节性髓系细胞（RegMCs））的生成。在本文中，我们描述了两种互补的实验方案，用于鉴定和定义 体外 和 体内 调节性细胞活性，以确定其在耐受诱导与维持中的作用. 首先，一个 体外 抑制性实验能够以剂量依赖的方式快速鉴定出对效应免疫应答具有抑制能力的细胞，并可用于进一步分析，如细胞因子检测或细胞毒性测定。其次，将耐受处理受者体内的细胞过继转移至新近经照射并接受移植物的受者体内，可凸显这些细胞在调控移植物定向免疫应答以及/或者诱导新生调节性细胞（称为传染性耐受）方面的耐受诱导特性。这些方法不限于具有已知表型标志物的细胞，可推广应用于任何细胞群体。此外，可通过使用第三方供体细胞或移植物来评估调节性细胞对供体特异性的同种反应性（该目标是本领域的重要研究方向） 体外 或 体内最后，为了确定这些调节性细胞特异性的耐受诱导能力，我们提供了评估受体体液抗供体抗体反应，以及受体针对新抗原或既往已知抗原产生体液免疫应答能力的实验方案。所述的耐受模型可用于进一步表征调节性细胞，鉴定新的生物标志物和免疫调节分子，并可适用于啮齿类动物或人类的其他移植模型及自身免疫性疾病研究。
引言
大鼠心脏同种异体移植是一种可靠的器官移植模型，可用于评估耐受诱导治疗、解析耐受诱导与维持的机制，并具有诱导功能完整且具主导性的调节性细胞的潜力。以下方案描述了一种完全错配的异位心脏移植，即将Lewis 1W供体大鼠（LEW.1W，RT1u）的心脏移植至Lewis 1A受体大鼠（LEW.1A，RT1a）体内。在此移植组合中，急性排斥反应发生迅速（约7天），可通过触诊腹部评估移植物搏动情况来简便判断排斥状态。本文提出三种在大鼠中诱导心脏同种异体移植物耐受的方案。在这些模型中，耐受由不同类型的调节性细胞诱导和/或维持。首先，使用编码CD40Ig的腺病毒（AdCD40Ig）阻断CD40-CD40L相互作用，可诱导产生CD8+ Treg细胞，这类细胞在过继转移至二次移植受体后能够诱导耐受1。此外，在AdCD40Ig处理的受体中通过抗CD8α抗体耗竭CD8+细胞，可诱导产生Breg细胞和RegMCs2。对CD8+ Treg细胞特性的深入分析揭示了多种免疫调节分子的关键作用，其中包括白细胞介素-34（IL-34）和纤维素样白细胞介素-2（FGL-2）3,4,5
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方案
注意：本文所有实验方案均已通过伦理委员会批准，且应以无菌方式操作。
1. 大鼠心脏异体移植模型中耐受性的建立
- LEW.1W 至 LEW.1A 同种异体移植操作
- 使用异氟烷-O2 吸入麻醉一只雄性 LEW.1W 供体大鼠，并在 5 分钟后补充 1% N2O。将动物置于仰卧位，用聚维酮碘对腹部进行消毒，实施胸廓切开术（即，切开胸腔的胸膜腔）。
- 夹闭下腔静脉和上腔静脉，结扎并切断。随后切断肺动脉和主动脉，将移植物保存于冷的 0.9% NaCl 溶液中。
- 使用异氟烷-O2 吸入麻醉一只体重 250 g 的雄性 LEW.1A 受体大鼠（8–12 周龄），并在 5 分钟后补充 1% N2O。将动物置于仰卧位，用聚维酮碘对腹部进行消毒，实施剑突至耻骨联合的剖腹手术（即，从剑突至耻骨联合的大切口）。
- 将肠管移出体外，夹闭腹部血管，在移植物主动脉与腹主动脉之间、肺动脉与下腔静脉之间分别行端侧吻合术（即，将一个管道的末端与另一个管道的侧壁连接），然后移除血管夹。
- 缝合肌肉层和皮肤，并用聚维酮碘消毒。
- 使用异氟烷-O2 吸入麻醉一只雄性 LEW.1W 供体大鼠，并在 5 分钟后补充 1% N2O。将动物置于仰卧位，用聚维酮碘对腹部进行消毒，实施胸廓切开术（即，切开胸腔的胸膜腔）。
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结果
抗原呈递细胞分选后抑制活性的评估（图1），效应T细胞和调节性T细胞同时图2），或单独地（图4），以及其他任何假定的调节性细胞（图3），可以完成 体内 通过直接注射调节性细胞 体外 通过CFSE荧光强度的测定（图5）。受者对供者体液免疫反应的状态（图6）或外源性抗原（图7 和 8）也可以进行评估 体外 随后 体内 如图所示进行免疫。
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讨论
将总脾细胞过继性转移至新移植的受体是检测某种治疗是否诱导或增强调节性细胞存在的有效方法。宿主经照射后产生的短暂性淋巴细胞减少可促进细胞在转移后的存活以及耐受的建立。此外，亚致死剂量照射为具有耐受原性特性的细胞在免疫重建过程中转化为新的调节性细胞提供了时间，这一现象称为传染性耐受34。通常在观察到耐受现象时，首先研究的是特征明确的CD4+CD25highFoxp3+CD127low Treg细胞。然而，转移阴性组分（即去除CD4+ Treg的脾细胞）有时可突破已知调节性细胞的范畴，从而鉴定出新的细胞群体1,2,3,4。在AdCD40Ig诱导的耐受模型中，将去除CD4+
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作是在 Labex IGO 项目（n°法国国家研究局（ANR）管理的“未来投资”政府项目（ANR-11-LABX-0016-01）以及同样由“未来投资”政府项目资助、法国国家研究局（ANR）管理的IHU-Cesti项目（ANR-10-IBHU-005）。IHU-Cesti项目还获得了南特都市区和卢瓦尔河地区大区政府的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物 | |||
| LEW.1W 和 LEW.1A 大鼠 | Janvier Labs，法国 | 8 周龄， | |
| BN 第三方供体大鼠 | Janvier Labs，法国 | 8 周龄， | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 试剂 | |||
| AdCD40Ig | 法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室 | 自制质粒 | |
| IL34-AAV | 法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室 | 自制质粒 | |
| FGL2-AAV | 法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室 | 自制质粒 | |
| 抗 TCRab | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | R7/3 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 CD25 | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | OX39 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 CD8 | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | OX8 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 CD45RA | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | OX33 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 CD161 | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | 3.2.3 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 CD11b/c | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | OX42 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 TCRgd | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | V65 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 CD45RC | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | OX22 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 CD4 | 欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株 | OX35 克隆 | 自制培养、纯化及荧光偶联 |
| 抗 CD45R | BD Biosciences，加利福尼亚州山景城 | #554881，His24 克隆 | |
| 抗大鼠 IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC，巴尔的摩，美国 | #112-096-071 | |
| 抗大鼠 IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
| 抗大鼠 IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
| 抗大鼠 IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
| 抗大鼠 IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC，巴尔的摩，美国 | #115-095-164 | |
| 链霉亲和素 HRP | BD Biosciences，加利福尼亚州山景城 | #554066 | |
| KLH | Sigma Aldrich，圣路易斯，美国 | #9013-72-3 | |
| PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | 无钙镁磷酸盐缓冲液， | |
| Tween 20 | Sigma，圣路易斯，美国 | #9005-64-5 | |
| TMB 显色试剂盒 | BD Biosciences，加利福尼亚州山景城 | #555214 | |
| CellTraceTM CFSE 细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | #C34554 | |
| RPMI 1640 培养基 1X | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | #31870-025 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | #15140-122 | |
| Hepes 缓冲液 | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | #15630-056 | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | #11140-035 | |
| 丙酮酸钠 | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | #11360-039 | |
| 2-β-巯基乙醇 | Sigma，圣路易斯，美国 | #M3148 | |
| Cell Proliferation Dye eFluor® 450 细胞染料 | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | #65-0842-85 | |
| 谷氨酰胺 | Sigma，圣路易斯，美国 | #G3126 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | #D1306 | |
| 胶原酶 D | Roche Diagnostics，德国 | #11088882001 | |
| EDTA | Sigma，圣路易斯，美国 | #E5134 | |
| 0.9% NaCl | Fresenius Kabi | #B230561 | |
| 磁性 Dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | 羊抗小鼠 IgG |
| One Comp eBeads | Ebiosciences，圣地亚哥，美国 | #01-1111-42 | |
| 聚维酮碘 | 参照机构指南 | ||
| 异氟烷 | 参照机构指南 | ||
| 纳布啡 | 参照机构指南 | ||
| 土霉素 | 参照机构指南 | ||
| 丁丙诺啡 | 参照机构指南 | ||
| 美洛昔康 | 参照机构指南 | ||
| 完全弗氏佐剂 | |||
| 隆朋 | 参照机构指南 | ||
| 乳酸林格液 | 参照机构指南 | ||
| 氯胺酮 | 参照机构指南 | ||
| 红细胞裂解液 | 将 8.29 g NH4Cl（Sigma，圣路易斯，美国 A-9434）、1 g KHCO3（Prolabo 26 733.292）和 37.2 mg EDTA（Sigma，圣路易斯，美国 E5134）溶于 800 ml H2O 中，调节 pH 至 7.2–7.4，加水定容至 1 L。 | ||
| 胶原酶 D | 将 1 g 胶原酶溶于 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS 中 | ||
| PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | 向 1 ml PBS 1X 中加入 5 ml EDTA 0.1 M（Sigma，圣路易斯，美国 E5134）和 20 ml FCS | ||
| CFSE（Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen） | 将 50µg（=1 管）CFDA SE（组分 A）溶于 90μl DMSO（组分 B）中，配制成 10 mM 储存液。然后将储存液用 PBS 1X 稀释 20,000 倍，得到 0.5μM 溶液 | ||
| 共培养完全培养基 | 500 ml 完全 RPMI-1640 培养基，含 5 ml 青霉素（80 单位/ml）-链霉素（80 mg/ml）、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml 非必需氨基酸（100X）、5 ml 丙酮酸钠（100 mM）、5 ml HEPES 缓冲液（1 M）、2.5 ml β-巯基乙醇（7 ml 2-巯基乙醇原液稀释于 10 ml RPMI 中）、10% FCS | ||
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 50 ml 离心管 | BD Biosciences，加利福尼亚州山景城 | #227261 | |
| 15 ml 离心管 | BD Biosciences，加利福尼亚州山景城 | #188271 | |
| 筛网 | |||
| Corning 塑料培养皿 | VWR，佩萨克 | #391-0439 | |
| 100µm 和 60µm 组织滤网 | Sefar NITEX，海登，瑞士 | #03-100/44 和 #03-60/35 | |
| 共培养用 96 孔圆底板 | Falcon 圆底组织培养板，无菌，Corning | #353077 | |
| FACS 染色用 96 孔 V 底板 | ThermoScientifique，丹麦 | #249570 | |
| ELISA 用 96 孔平底板 | Nunc Maxisorb | ||
| 脾脏研磨用注射器 | BD Biosciences，加利福尼亚州山景城 | #309649 | |
| ELISA 阅读仪 | SPARK 10M，Tecan，瑞士 | SPARK 10M，Tecan，瑞士 | |
| 离心机 | |||
| 水浴锅 | |||
| X 射线辐照仪 | Lincolshire，英国 | Faxitron CP160 | |
| 旋转摇床 | |||
| FACS Canto II | BD Biosciences，加利福尼亚州山景城 | ||
| FACS Aria II | BD Biosciences，加利福尼亚州山景城 | ||
| 磁力架 | Thermo Fisher Scientific Inc，美国 | 12302D |
参考文献
- Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
- Bézie, S., et al.
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