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方法文章

体外 与 体内 评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

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DOI：

10.3791/55510

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2017年8月12日

 ,  , 
1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种诱导移植耐受的方案，并对其进行评估 体外 和 体内 受者不同细胞亚群的抑制能力以及受者对供者或外源性抗原的免疫状态。

摘要

移植领域的主要关注点是通过诱导调节性细胞来实现特异性耐受。对耐受机制的理解需要可靠的模型。本文描述了通过阻断共刺激信号或通过基因转移上调免疫调节分子而在大鼠中建立的心脏同种异体移植物耐受模型。这些模型中的每一种均允许 体内 调节性细胞（如调节性T细胞（Tregs）、调节性B细胞（Bregs）或调节性髓系细胞（RegMCs））的生成。在本文中，我们描述了两种互补的实验方案，用于鉴定和定义 体外 和 体内 调节性细胞活性，以确定其在耐受诱导与维持中的作用. 首先，一个 体外 抑制性实验能够以剂量依赖的方式快速鉴定出对效应免疫应答具有抑制能力的细胞，并可用于进一步分析，如细胞因子检测或细胞毒性测定。其次，将耐受处理受者体内的细胞过继转移至新近经照射并接受移植物的受者体内，可凸显这些细胞在调控移植物定向免疫应答以及/或者诱导新生调节性细胞（称为传染性耐受）方面的耐受诱导特性。这些方法不限于具有已知表型标志物的细胞，可推广应用于任何细胞群体。此外，可通过使用第三方供体细胞或移植物来评估调节性细胞对供体特异性的同种反应性（该目标是本领域的重要研究方向） 体外 或 体内最后，为了确定这些调节性细胞特异性的耐受诱导能力，我们提供了评估受体体液抗供体抗体反应，以及受体针对新抗原或既往已知抗原产生体液免疫应答能力的实验方案。所述的耐受模型可用于进一步表征调节性细胞，鉴定新的生物标志物和免疫调节分子，并可适用于啮齿类动物或人类的其他移植模型及自身免疫性疾病研究。

引言

大鼠心脏同种异体移植是一种可靠的器官移植模型，可用于评估耐受诱导治疗、解析耐受诱导与维持的机制，并具有诱导功能完整且具主导性的调节性细胞的潜力。以下方案描述了一种完全错配的异位心脏移植，即将Lewis 1W供体大鼠（LEW.1W，RT1u）的心脏移植至Lewis 1A受体大鼠（LEW.1A，RT1a）体内。在此移植组合中，急性排斥反应发生迅速（约7天），可通过触诊腹部评估移植物搏动情况来简便判断排斥状态。本文提出三种在大鼠中诱导心脏同种异体移植物耐受的方案。在这些模型中，耐受由不同类型的调节性细胞诱导和/或维持。首先，使用编码CD40Ig的腺病毒（AdCD40Ig）阻断CD40-CD40L相互作用，可诱导产生CD8+ Treg细胞，这类细胞在过继转移至二次移植受体后能够诱导耐受1。此外，在AdCD40Ig处理的受体中通过抗CD8α抗体耗竭CD8+细胞，可诱导产生Breg细胞和RegMCs2。对CD8+ Treg细胞特性的深入分析揭示了多种免疫调节分子的关键作用，其中包括白细胞介素-34（IL-34）和纤维素样白细胞介素-2（FGL-2）3,4,5,6。其中，IL-34的过表达（通过AAV载体）通过诱导RegMCs生成Treg细胞，而FGL-2的过表达则诱导Breg细胞，表明调节性细胞之间存在复杂的调控网络。

由于慢性排斥反应发展缓慢且持续时间较长，因此需要进行深入分析以区分耐受与慢性排斥反应。通常通过免疫组织化学方法评估移植物的细胞浸润、纤维化、血管壁增厚以及补体C4d的沉积情况7。尽管组织学方法需要牺牲动物或进行移植物活检，本文中我们描述了一种简便的方法，用于评估耐受性同种异体移植物的不同特征：通过流式细胞术（此处使用荧光激活细胞分选技术，FACS）检测血液样本中调节性细胞的出现及其功能，以及抗供体特异性抗体反应。

在停止治疗后维持对同种异体移植物的耐受性通常与诱导调节性细胞有关8。近几十年来，针对CD4+ Treg的研究一致将其关键标志物定义为Foxp3+、CD25high和CD127-9,10,11。类似地，CD8+ Treg也被赋予多种标志物，如CD122+、CD28-、CD45RClow、PD1+和Helios+1,12,13,14,15,16,17。此外，随着时间推移，GITR、CTLA4以及细胞因子（IL-10、TGFβ、IL-34、IL-35、FGL-2）的表达也被认为与Treg表型相关3,4,6,13,18,19,20,21。然而，新出现的调节性细胞群体，如Breg、RegMC或NKTreg，尚缺乏明确的特异性标志物。事实上，Breg主要被报道为未成熟的CD24+细胞，CD27表达具有不确定性，并有时产生IL-10、TGFβ或颗粒酶B22,23,24。髓系细胞谱系的复杂性要求联合使用多种标志物来界定其调节性或促炎性表型，例如CD14、CD16、CD80、CD86、CD40、CD209a或CD16325,26。最后，已有研究报道某些标志物可用于识别NKTreg，如CD11b+、CD27+、TGFβ+，但仍需更多研究以进一步明确其表型特征27,28,29,30,31,32。因此，必须提供抑制功能的证据，以支持对新型生物标志物、新型免疫调节介质的鉴定，并拓展至新型细胞治疗的应用范围。

我们提出两种互补的方法来评估细胞的抑制活性。首先，体外方法包括将抑制性细胞与经同种异体供体抗原呈递细胞（APCs）刺激并标记的效应T细胞按不同比例共培养6天，随后分析反映供体特异性免疫抑制的效应T细胞增殖情况。经处理的大鼠来源的细胞可直接与未经处理的正常大鼠或未经治疗的移植大鼠来源的细胞（或任何其他调节性细胞群体）在一系列抑制细胞：效应细胞比例下比较其抑制活性。此外，该方法无需进行任何移植操作，结果可在6天内获得。其次，体内方法包括将来自经处理大鼠的待测调节性细胞转移至新近经照射处理的移植受体中。通常情况下，来自未经处理的正常大鼠的B细胞、髓系细胞或T细胞在过继转移后往往无法抑制急性排斥反应或延长移植物存活时间，而来自经处理受体、具有增强抑制活性的细胞则具备这些特性1,2,3,4,33。建议通过照射受体诱导淋巴细胞减少，以确保过继转移的细胞不受血液稳态的影响，并更有效地调控抗供体免疫应答。对于这两种方法，使用体外同种异体第三方APCs，或体内将抑制性细胞过继转移至接受第三方心脏移植的受体中，均可用于分析抗供体特异性。尽管体内方法需要大量细胞，但数量稀少的细胞亚群的抑制活性更易于通过体外方法进行评估33。

也可通过检测体液免疫反应来评估耐受状态以及对供体抗原特异性抗体反应的控制情况。事实上，免疫耐受的特征表现为受体对供体不产生体液免疫反应，但仍保留针对新抗原产生体液免疫反应的能力，同时维持免疫记忆应答。首先，同种异体抗体检测的基本原理是将供体细胞类型与移植后受体的血清共同孵育，通过受体抗体对供体细胞的识别来进行检测。其次，可通过在完全弗氏佐剂中乳化的钥孔戚血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH）刺激长期耐受受体，以评估其对外源性抗原的体液免疫应答。免疫后第4天和第13天分别可采用酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测针对抗原的特异性IgM和IgG抗体的存在34。第三，可通过在移植前7天（-7天）和移植后3天（+3天）注射异种红细胞（RBCs），并在移植后8天和17天采集受体血清进行红细胞染色，以评估免疫记忆应答的保留情况。上述所有方法均可利用特异性二抗鉴定免疫球蛋白亚型，并通过FACS染色在1.5小时内快速获得结果，或通过ELISA在数小时内完成检测。

最后，这些方案旨在用于移植模型的表征，在一定程度上也可应用于自身免疫疾病模型。该方法的原理可推广至所有物种。

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方案

注意：本文所有实验方案均已通过伦理委员会批准，且应以无菌方式操作。

1. 大鼠心脏异体移植模型中耐受性的建立

  1. LEW.1W 至 LEW.1A 同种异体移植操作
    1. 使用异氟烷-O2 吸入麻醉一只雄性 LEW.1W 供体大鼠，并在 5 分钟后补充 1% N2O。将动物置于仰卧位，用聚维酮碘对腹部进行消毒，实施胸廓切开术（即，切开胸腔的胸膜腔）。
      1. 夹闭下腔静脉和上腔静脉，结扎并切断。随后切断肺动脉和主动脉，将移植物保存于冷的 0.9% NaCl 溶液中。
    2. 使用异氟烷-O2 吸入麻醉一只体重 250 g 的雄性 LEW.1A 受体大鼠（8–12 周龄），并在 5 分钟后补充 1% N2O。将动物置于仰卧位，用聚维酮碘对腹部进行消毒，实施剑突至耻骨联合的剖腹手术（即，从剑突至耻骨联合的大切口）。
      1. 将肠管移出体外，夹闭腹部血管，在移植物主动脉与腹主动脉之间、肺动脉与下腔静脉之间分别行端侧吻合术（即，将一个管道的末端与另一个管道的侧壁连接），然后移除血管夹。
    3. 缝合肌肉层和皮肤，并用聚维酮碘消毒。
    4. 皮下注射（s.c.）纳布啡（镇痛药）6 mg/kg，肌肉注射（i.m.）土霉素（抗生素）；将动物置于加热灯下直至苏醒。在移植当天及术后第一天，分别肌肉注射（i.m.）丁丙诺啡（阿片类药物）（50 µg/kg）和皮下注射（s.c.）美洛昔康（非甾体抗炎药）（0.3 mg/kg）。
  2. 通过阻断共刺激相互作用诱导耐受
    1. 执行步骤 1.1.1 至 1.1.2。
    2. 在动物设施的生物安全二级（A2 级）区域中，将 2 × 1010 个感染性颗粒的 AdCD40Ig（一种编码 CD40Ig 的腺病毒，CD40Ig 是一种可阻断 CD40-CD40L 相互作用的嵌合分子）溶于乳酸林格液中，终体积为 150 µL，并分 3 点（每点 50 µL，共 3 × 50 µL）注射至移植物心尖部心室壁。
    3. 执行步骤 1.1.3 至 1.1.4。
      注：AdCD40Ig 治疗可联合抗 CD8α、抗 ICOS 或抗 CD28 抗体注射2,35,36。
  3. 通过重组蛋白过表达诱导耐受
    1. 将 1 × 1012 个病毒基因组的重组腺相关病毒（AAV）携带的大鼠 IL34（rAAV-IL34）溶于乳酸林格液中，终体积为 100 µL。使用异氟烷-O2 吸入麻醉一只 150 g 的 LEW.1A 大鼠，并通过阴茎静脉进行静脉注射（i.v.）。
    2. 在 AAV-IL34 注射后一个月，按照方案 1.1 对该 LEW.1A 受体大鼠实施 LEW.1W 移植。

2. 体外 通过混合淋巴细胞反应（MLRs）评估细胞抑制活性

注意：应将来自经处理的耐受大鼠的细胞抑制活性与来自同系移植受体或未处理大鼠的相应细胞群进行比较。

  1. 异基因抗原提呈细胞的分离：浆细胞样树突状细胞（pDCs）
    1. 使用异氟烷-氧混合气体麻醉一只雄性LEW.1W未致敏供体大鼠2 吸入，补充1% N25 分钟后，将动物置于仰卧位，用聚维酮碘消毒腹部以进行脾切除术。通过横断血管的方式切除脾脏，将脾脏保存于冰冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并缝合动物。
    2. 将脾脏转移至培养皿中，吸除1×PBS，加入5 mL 0.2%胶原酶D进行灌注。为提高酶消化效果，将脾脏剪成小块，于37 °C孵育15分钟。
    3. 加入500 µL 0.1 M乙二胺四乙酸（EDTA），将脾组织转移至筛网中，用注射器活塞碾压脾组织以解离细胞。将细胞悬液转移至离心管中，加入15 mL 1× PBS洗涤细胞，430 × g离心10 min。弃去上清液。
    4. 为去除红细胞和血小板，将脾细胞沉淀重悬于10 mL低渗溶液中，室温孵育5分钟。用1×PBS洗涤，190 × g离心10分钟。弃上清液。
    5. 使用100 µm细胞滤网过滤以去除胶原纤维。计数细胞并调整细胞浓度至5 x 107 细胞/mL，置于1×PBS/2% 胎牛血清（FCS）/0.5 mM EDTA中
      注意：脾细胞的数量应在 4 x 108 和 7 x 108 细胞
    6. 通过阴性选择富集目标细胞，再进行细胞分选。在 4 °C 下孵育 15 分钟，加入针对 T 细胞（抗 TCRαβ，R7/3 克隆，和抗 TCRγδ，V65 克隆）、B 细胞（抗 CD45RA，OX33 克隆）以及 NK 细胞（抗 CD161，3.2.3 克隆）的特异性纯化一抗，抗体工作浓度为 2 µg/mL。用 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 洗涤，430 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。
    7. 用1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤磁珠3次，每次使用3.5 µL磁珠/106 脾细胞，加入30 mL 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤，置于磁铁上1分钟，弃去上清液，重复两次。将磁珠重悬于10倍体积的1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA中（例如，35 µL磁珠加入350 µL 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA）。
    8. 通过在4 °C下振荡孵育10分钟，将脾细胞与磁珠混合以去除不需要的细胞，将试管置于磁铁上1分钟，转移上清液至新试管中，重复两次。计数细胞并调整细胞浓度至5 × 10⁶7 细胞/mL，置于1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA中
      注意：富集后的脾细胞数量应介于 5 x 107 和 9 × 107.
    9. 使用标记抗体对细胞进行染色，以进一步分选pDCs：排除残留的T细胞（抗TCRαβ，R7/3克隆）或B细胞（抗CD45RA，OX33克隆），并分选CD4+ （抗CD4，OX35克隆）CD45R+ 细胞（抗-CD45R，His24 克隆）。用每种抗体标记微珠，以在流式细胞仪上建立补偿矩阵。4 °C 孵育 15 分钟，用 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 洗涤。
    10. 以 5 x 10 的浓度重悬细胞7 细胞/mL，使用60 µm细胞滤网过滤，并通过加入DAPI至终浓度0.1 µg/mL标记死细胞。使用70 µm喷嘴的流式细胞分选仪，依据DAPI染色信号进行分选-TCR-CD45RA-CD4+CD45R+ 如图所示 图1.
  2. 分离应答效应T细胞（CD4 + CD25 - T细胞
    1. 从未经处理且未进行移植的 naive LEW.1A 大鼠中取出脾脏，并将其保存在冷的 1× PBS 中。
    2. 将脾脏转移至置于培养皿中的筛网内，加入10 mL 1×PBS。用注射器活塞研磨脾脏以解离细胞。将细胞转移至50 mL离心管中，用1×PBS洗涤，于430 × g离心10分钟。弃去上清液。
    3. 为去除红细胞和血小板，将脾细胞沉淀重悬于10 mL低渗溶液中，室温孵育5 min，然后用1×PBS洗涤，并在190 × g离心10 min。弃去上清液。
    4. 通过100 µm细胞滤网过滤以去除胶原纤维。计数细胞并调整细胞浓度至5 x 107 细胞/mL，置于1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA中
      注意：脾细胞数量应在 3 x 108 和 5 × 108 细胞
    5. 在分选前富集目标细胞。加入针对CD8细胞（抗CD8α，OX8克隆）、B细胞（抗CD45RA，OX33克隆）、NK细胞（抗CD161，3.2.3克隆）、髓系细胞（抗CD11b/c，OX42克隆）和γδ T细胞（抗TCRγδ，V65克隆）的特异性纯化抗体（终浓度2 µg/mL），4 °C孵育15分钟。随后用1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤，430 × g离心10分钟。弃去上清液。
      注意：为了分选天然CD8+ 与CD4同时从幼稚大鼠分离Tregs+ 效应T细胞，在去除过程中不要加入抗-CD8α抗体。
    6. 按照步骤2.1.7所述，用1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA将磁珠洗涤3次。
    7. 通过在4 °C下振荡孵育10分钟，将脾细胞与磁珠混合以去除不需要的细胞，然后将试管置于磁铁上1分钟，收集上清液转移至新试管中。重复此步骤两次。计数细胞，并将细胞浓度调整至5 × 10⁶ cells/mL。7 细胞/mL，置于1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA中
      注意：脾细胞数量应介于 5 x 10 之间7 和 8 x 107 细胞
    8. 加入标记抗体以分选CD4+CD25- T细胞：加入抗TCRαβ（R7/3克隆）、抗CD4（OX35克隆）、抗CD25（OX39克隆）抗体，4 °C孵育15分钟。用于同时分选CD8+CD45RC低 Tregs，加入抗CD45RC抗体（OX22克隆）。用每种抗体标记微珠，以建立用于后续流式细胞术分析的补偿矩阵。用1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤细胞，弃去上清液。
    9. 重悬细胞至 5 x 107 细胞/mL，使用60 µm细胞滤网过滤，并通过加入DAPI至终浓度0.1 µg/mL标记死细胞。使用70 µm喷嘴的流式细胞分选仪，根据DAPI信号设门进行细胞分选 -TCR+CD4+CD25- 细胞作为应答细胞（如需要可使用 DAPI） -TCR+CD4-CD45RC低 如 CD8+ Tregs（调节性T细胞）的抑制作用，如图所示 图2.
  3. 抑制性细胞的分离
    注意：将脾脏分为两份，一份用于分选B细胞、髓系细胞和NK细胞，另一份用于分选CD4+ 和 CD8+ CD45RC低 T细胞，以评估其抑制功能。
    注意：进行过继细胞转移时，保留 1 x 108 如有需要，可将脾细胞用作过继转移耐受性的阳性对照。
    1. B细胞、髓系细胞和NK细胞的分选
      1. 按照步骤 2.1.1 至 2.1.5 进行操作。
      2. 4 °C 条件下，加入终浓度为 2 µg/mL 的 T 细胞特异性未标记抗体（抗 TCRαβ，R7/3 克隆，和抗 TCRγδ，V65 克隆），孵育 15 分钟，随后用 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 洗涤，并在 430 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。
      3. 用1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 重悬磁珠，洗涤3次，操作同2.1.7步骤所述。
      4. 将脾细胞与磁珠混合，以去除不需要的细胞，在4 °C下振荡孵育10分钟，然后将试管置于磁铁上1分钟，收集上清液转移至新试管中。重复此步骤两次。计数细胞，并将细胞浓度调整至5 × 10⁶ cells/mL。7 细胞/mL，置于1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA中
      5. 将标记的抗体加入脾细胞中，以分选具有潜在抑制活性的细胞，如髓系细胞（抗CD11b/c，OX42克隆）、B细胞（抗CD45RA，OX33克隆）或NK细胞（抗CD161，3.2.3克隆）。用每种抗体标记微珠，用于在流式细胞仪上建立补偿矩阵。4 °C孵育15分钟，用1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤。
      6. 以 5 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度重悬细胞7 细胞/mL，使用60 µm细胞滤膜过滤，并通过添加DAPI至终浓度0.1 µg/mL对死细胞进行标记。使用70 µm喷嘴的分选仪，根据DAPI信号设门分选细胞-CD11b/c+ 用于髓系细胞，CD45RA+ 用于B细胞和CD161+ 如自然杀伤细胞所示 图3.
    2. CD4分选 + 和 CD8 + CD45RC 低 T细胞
      1. 按照步骤 2.2.1 至 2.2.4 进行操作。
      2. 在磁性柱上进行阴性筛选时，将细胞与针对B细胞（抗CD45RA，OX33克隆）、NK细胞（抗CD161，3.2.3克隆）、髓系细胞（抗CD11b/c，OX42克隆）和γδ T细胞（抗TCRγδ，V65克隆）的特异性纯化抗体（2 µg/mL）在4 °C孵育15分钟，用1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤，然后在430 × g离心10分钟。弃去上清液。
      3. 按照步骤2.1.7所述，用1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤磁珠3次。
      4. 通过在4 °C下振荡孵育10分钟，将脾细胞与磁珠混合以去除不需要的细胞，然后将试管置于磁铁上1分钟，收集上清液转移至新管。重复此步骤两次。计数细胞，并将细胞浓度调整至5 × 10⁶7 细胞/mL，置于1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA中
      5. 向细胞中加入标记抗体以分选Treg细胞：抗TCRαβ（R7/3克隆）、抗CD4（OX35克隆）、抗CD45RC（OX22克隆）。用每种抗体标记微珠，用于在流式细胞仪中建立补偿矩阵。4 °C孵育15分钟，然后用1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤。
      6. 以 5 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度重悬细胞7 细胞/mL，使用60 µm滤膜过滤组织，并通过加入DAPI至终浓度0.1 µg/mL标记死细胞。使用70 µm喷嘴的流式细胞分选仪，根据DAPI信号设门进行细胞分选 -TCR+CD4+CD45RC低 如 CD4+ 调节性T细胞和DAPI -TCR+CD4-CD45RC低 如 CD8+ 调节性T细胞（Tregs） 图4).
        注意：如果从 CD4 中区分 T 细胞，可使用抗 CD8α 抗体（OX8 克隆）替代抗 CD4 抗体+ 通过抗TCR标记排除非T细胞。CD4过量+ 应考虑到细胞增殖染料（CPD）标记可能导致细胞死亡，因此需预先对Treg细胞进行分选。
  4. 用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记反应细胞以检测增殖
    1. 分选应答细胞后，用1× PBS洗涤细胞两次。
    2. 以 1 x 10 的浓度重悬细胞7 细胞/mL重悬于1×PBS中，加入终浓度为0.5 µM的CFSE，避光室温孵育5分钟。加入1.5倍体积的FCS终止反应，4 °C、430 × g离心10分钟。弃上清。
    3. 用完全培养基洗涤细胞两次，并计数细胞。
      注意：此步骤预计有30%的细胞死亡。
  5. CD4的CPD标记 + 用于CD4抑制性实验的Treg细胞 + 效应细胞
    注意：此步骤旨在区分CFSE-CD4+ CFSE 中的 Tregs- 增殖的应答性CD4+ 共培养第6天通过CPD设门的T细胞- 细胞
    1. CD4之后+ Tregs 细胞分选，用 1X PBS 将细胞洗涤两次。
    2. 将细胞重悬至浓度为 1 x 107 细胞/mL，加入10 µM CPD V450，避光室温孵育20分钟。
    3. 用完全培养基洗涤细胞两次，并计数细胞。
      注意：此步骤预计有30%的细胞死亡。
  6. 共培养建议
    1. 使用含有以下成分的培养基进行培养：RPMI 1640 培养基，添加 β-巯基乙醇（5 × 10⁻⁵ M）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mM）、丙酮酸钠（1 mM）、非必需氨基酸（0.1 mM）和 HEPES（10 mM）-5 M）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（0.1 mg/mL）、丙酮酸钠（1 mM）、谷氨酰胺（2 mM）、HEPES缓冲液（1 mM）、非必需氨基酸（1×）、胎牛血清（10%）。
    2. 在96孔U型底培养板中培养细胞。
    3. 按以下顺序加入细胞：抑制性细胞、反应细胞和同种异体细胞。
    4. 保持应答性T细胞和同种异体抗原提呈细胞数量恒定，检测不同数量的调节性T细胞。例如，比例为4:4:1，5 × 104 抑制性细胞，5 × 104 应答细胞，以及 1.25 x 104 异基因细胞，比例 2:4:1，2.5 x 104 抑制性细胞，5 x 104 应答细胞，以及 1.25 x 104 异基因细胞
    5. 保持 5 x 10 的比例4 每孔200 µL培养基的应答细胞
    6. 对照组应包括若干孔仅含反应性T细胞而不含同种异体APC的样本（阴性对照），以及含反应性T细胞和同种异体APC但不含调节性细胞的样本（阳性对照），用于第6天的CFSE设门（参见步骤2.7.6）。
  7. 共培养6天后的FACS染色与分析
    注意：效应细胞的增殖情况可在多个时间点进行评估。需注意增殖呈指数增长：随着细胞分裂的增加，抑制性条件与阴性对照之间的差异会更加明显。
    1. 将细胞从96孔U型底板转移至96孔V型底板，于4 °C、1,200 × g离心1分钟。
    2. 如有需要，将上清液保存于新培养板中，置于 -20 °C 用于细胞因子水平检测。
    3. 用 200 µL 每孔的 1X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 洗涤细胞，在 4 °C 下以 1,200 x g 离心 1 分钟。
    4. 向细胞中加入抗体以进一步圈定应答性T细胞：抗TCRab（R7/3克隆）和抗CD4（OX35克隆）。4 °C孵育15分钟，每孔用200 µL 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤两次，弃去上清液。
    5. 加入100 µL用1X PBS稀释至0.1 µg/mL的DAPI，然后使用FACS分析仪读取酶标板。
    6. 通过圈选DAPI阴性（活细胞）和CPD阴性（非CD4+ 调节性T细胞（Tregs）TCR+CD4+ 细胞。未受刺激的应答细胞具有最大CFSE荧光强度，如图所示 图5 左下角直方图显示，在存在同种异体抗原呈递细胞（APCs）的情况下，应答细胞增殖程度最高，CFSE荧光强度最低（底部中间）；在存在同种异体抗原呈递细胞和调节性细胞的情况下，效应细胞增殖程度中等，CFSE荧光强度亦处于中等水平（底部右侧）。

3. 体内 通过过继性细胞转移评估心脏移植受体中细胞的抑制活性

注意：需要进行照射以清除宿主细胞，促进供体细胞的植入和增殖。

  1. 在移植前1天上午对移植物受体进行照射，以预处理受体。通过肌内注射麻醉大鼠. 注射赛拉嗪（8 mg/kg）-氯胺酮（80 mg/kg），并用X射线以4.5 Gy剂量进行照射。
  2. 按照方案2.3分离目标细胞。
    注意：保存 1 x 108 如有需要，可将脾细胞用作过继转移耐受性的阳性对照。
  3. 照射后12 h（移植前1 d傍晚），通过吸入4%异氟烷-O₂麻醉大鼠2 并灌注细胞（5.0 × 107 T细胞，3.0 × 107 B 细胞，3.0 × 107 髓系细胞，或 1.50 x 108 通过阴茎静脉注射脾细胞作为过继转移耐受性的阳性对照。
    注意：通过过继转移实现耐受所需的细胞数量取决于细胞的抑制活性。
  4. 次日，按照方案1.1进行异体移植。通过腹部触诊监测移植物的演变情况。

4. 供体特异性抗体检测

注意：通过将供体来源的细胞与受体血清共同孵育，检测针对移植物供体的IgG反应。通过将细胞与同系LEW.1W血清孵育，检测LEW.1W B细胞的直接染色所引起的背景信号，并从结果中扣除该背景值。

  1. 采集大鼠血液，于 4 °C 条件下以 1,200 × g 离心 15 分钟。收集血清。血清可于 -20 °C 保存或立即使用。通过在 56 °C 孵育 30 分钟以灭活血清中的补体。
  2. 取供体 LEW.1W 大鼠的脾脏，并将其保存于冷的 1× PBS 中。按步骤 2.2.1 至 2.2.4 操作。将 2 × 105 个细胞/孔加入 96 孔 V 型底板中。于 4 °C 以 1,200 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。
  3. 用 1× PBS 将血清从 1/10 至 1/270 进行系列稀释（每样本 4 个稀释度）。每孔加入 25 µL 稀释后的血清，于 4 °C 孵育细胞 1 小时。预计每样本需分析的供体特异性 IgG 亚型（IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b）免疫反应数量（1 份血清 × 4 个稀释度 × 4 种 IgG 亚型）。用 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 洗涤细胞，弃去上清液。
  4. 每孔加入一种荧光染料标记的小鼠抗大鼠 IgG 亚型抗体，于 4 °C 孵育 30 分钟，每孔对应一种亚型。
    注意：若无荧光染料标记的抗大鼠 Ig 抗体，可使用未标记的纯化小鼠抗大鼠 IgG 亚型抗体，再配合荧光染料标记的二抗（抗小鼠抗体）。根据可用的荧光染料及流式细胞仪配置，可在同一孔中使用适当设置同时检测多种抗大鼠 IgG 亚型。
  5. 用 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 洗涤细胞两次，每次后弃去上清液。
  6. 每孔加入 100 µL 用 PBS 稀释至 0.1 µg/mL 的 DAPI 溶液，使用 FACS 分析仪读取结果。
  7. 读取所有 DAPI- 细胞中荧光染料标记的抗大鼠 IgG 亚型抗体的平均荧光强度（MFI）。将各受体血清在相应稀释度下对 LEW.1W 细胞测得的 MFI 值（右下图显示经治疗后耐受受体呈中等 MFI），减去正常 LEW.1A 血清对 LEW.1W 细胞测得的 MFI 值（背景染色，左下图；未经治疗的排斥受体显示最大 MFI，中下图）（图 6）。

5. 外源性抗原体液反应的评估（初始与记忆）

注意：移植、治疗和免疫前的大鼠血清应作为体液反应的阴性对照。否则，可使用未免疫的正常大鼠。具有免疫能力的受体血清，i.e.，经移植后接受过外源抗原免疫并发生排斥反应的受体血清，用作体液反应的阳性对照。

  1. 产生针对新抗原的体液免疫应答的能力图7)
    注意：该方法为体液免疫反应的相对定量，因未包含标准品。若在步骤5.1.6中加入已知浓度的大鼠IgG或IgM抗KLH抗体的一系列稀释液，则可实现Ig的绝对定量。
    1. 将50 µg KLH与200 µL完全弗氏佐剂乳化，注射至长期存活/耐受受体、未治疗对照排斥受体或未经处理的大鼠尾部，作为体液免疫反应的阳性对照。
    2. 在免疫后第4天和第13天采集血样，于4 °C条件下以1,200 × g离心15分钟，收集上层血清。同时采集未免疫大鼠的血清作为阴性对照。血清可于-20 °C保存，直至进行ELISA检测。
    3. 用 1× PBS 将 KLH 稀释至 10 µg/mL，每孔加入 50 µL，于 4 °C 过夜包被 ELISA 板（平底）。确保包被液覆盖所有孔。
    4. 通过洗涤去除多余的未包被KLH。洗涤时，每孔加入150 µL洗液（含0.1% Tween的1×PBS），振荡后弃去。
    5. 用含10%胎牛血清的洗涤缓冲液每孔100 µL，37 °C孵育1小时以阻断受体Ig的非特异性结合。洗涤一次。
    6. 将受体血清用洗涤缓冲液从1/40开始倍比稀释至1/512，每孔加入50 µL稀释液，每个稀释度设复孔，加入已包被的酶标板中，37 °C孵育2 h。保留部分孔不加血清作为空白对照。洗涤2次。
    7. 在受体第4天采集的血清孔中加入50 µL浓度为1 µg/mL的生物素标记抗大鼠IgM抗体，或在第13天采集的血清孔中加入50 µL生物素标记抗大鼠IgG抗体，37 °C孵育1小时。洗涤两次。
    8. 每孔加入 50 µL 浓度为 1 µg/mL 的 HRP 标记链霉亲和素，37 °C 孵育 45 分钟。洗涤 3 次。
    9. 加入50 µL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物 < 室温孵育30分钟，当阳性对照饱和时，加入25 µL的2 M硫酸终止反应。
    10. 在405 nm处读取吸光度。将受体血清测得的光密度值与未免疫大鼠对照血清测得的光密度值进行比较。
  2. 体液记忆反应能力评估图8)
    1. 移植前7天，经静脉注射109 将稀释于800 µL 1X PBS中的异种红细胞注入未致敏大鼠体内。红细胞可来源于绵羊、马或其他任何物种。
    2. 进行移植并给予耐受性治疗。
    3. 移植后第3天，再次静脉注射109 在移植物受体和非移植物大鼠中，将红细胞用800 µL 1X PBS稀释。
    4. 在第二次免疫后的第5天和第14天采集血液样本，于4 °C条件下以1,200 × g离心15分钟，收集上层血清。血清可于-20 °C保存，或立即使用。使用前将大鼠血清在56 °C孵育30分钟以灭活补体。
    5. 加入 2 x 105 96孔V型底板每孔加入红细胞。4 °C、1,200 × g离心1分钟，小心吸弃上清液。
    6. 将血清用1×PBS进行2倍系列稀释，从1/10稀释至1/1280（每样本8个稀释度）。每孔加入25 µL稀释后的血清，4 °C孵育细胞1小时。用1×PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA洗涤细胞，弃去上清液。
    7. 将细胞与用荧光染料标记的、经红细胞物种吸附的抗大鼠IgG或IgM亚型抗体在4 °C孵育30分钟，每孔一种亚型。分别在免疫后第5天和第14天采集血清，检测其中的大鼠抗红细胞IgM和IgG。. 用 1× PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 洗涤细胞两次，弃去上清液。
      注意：如果无法获得荧光染料标记的抗大鼠Ig抗体，可使用纯化的未标记小鼠抗大鼠IgG亚类抗体，以及荧光染料标记的二抗抗小鼠抗体。
    8. 加入100 µL用1X PBS稀释至0.1 µg/mL的DAPI，然后用FACS分析仪分析细胞。
    9. 将每组的MFI表示为稀释度的函数。

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结果

抗原呈递细胞分选后抑制活性的评估（图1），效应T细胞和调节性T细胞同时图2），或单独地（图4），以及其他任何假定的调节性细胞（图3），可以完成 体内 通过直接注射调节性细胞 体外 通过CFSE荧光强度的测定（图5）。受者对供者体液免疫反应的状态（图6）或外源性抗原（图7 和 8）也可以进行评估 体外 随后 体内 如图所示进行免疫。

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讨论

将总脾细胞过继性转移至新移植的受体是检测某种治疗是否诱导或增强调节性细胞存在的有效方法。宿主经照射后产生的短暂性淋巴细胞减少可促进细胞在转移后的存活以及耐受的建立。此外，亚致死剂量照射为具有耐受原性特性的细胞在免疫重建过程中转化为新的调节性细胞提供了时间，这一现象称为传染性耐受34。通常在观察到耐受现象时，首先研究的是特征明确的CD4+CD25highFoxp3+CD127low Treg细胞。然而，转移阴性组分（即去除CD4+ Treg的脾细胞）有时可突破已知调节性细胞的范畴，从而鉴定出新的细胞群体1,2,3,4。在AdCD40Ig诱导的耐受模型中，将去除CD4+

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作是在 Labex IGO 项目（n°法国国家研究局（ANR）管理的“未来投资”政府项目（ANR-11-LABX-0016-01）以及同样由“未来投资”政府项目资助、法国国家研究局（ANR）管理的IHU-Cesti项目（ANR-10-IBHU-005）。IHU-Cesti项目还获得了南特都市区和卢瓦尔河地区大区政府的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物
LEW.1W 和 LEW.1A 大鼠Janvier Labs，法国8 周龄， 
BN 第三方供体大鼠Janvier Labs，法国8 周龄， 
名称公司货号备注
试剂
AdCD40Ig法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室自制质粒
IL34-AAV法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室自制质粒
FGL2-AAV法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室自制质粒
抗 TCRab欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株R7/3 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 CD25欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株OX39 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 CD8欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株OX8 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 CD45RA欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株OX33 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 CD161欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株3.2.3 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 CD11b/c欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株OX42 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 TCRgd欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株V65 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 CD45RC欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株OX22 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 CD4欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株OX35 克隆自制培养、纯化及荧光偶联
抗 CD45RBD Biosciences，加利福尼亚州山景城#554881，His24 克隆
抗大鼠 IgG-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC，巴尔的摩，美国#112-096-071
抗大鼠 IgG1Serotec#MCA 194
抗大鼠 IgG2aSerotec#MCA 278
抗大鼠 IgG2bSerotec#MCA 195
抗大鼠 IgM-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC，巴尔的摩，美国#115-095-164
链霉亲和素 HRPBD Biosciences，加利福尼亚州山景城#554066
KLHSigma Aldrich，圣路易斯，美国#9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher Scientific Inc，美国无钙镁磷酸盐缓冲液， 
Tween 20Sigma，圣路易斯，美国#9005-64-5
TMB 显色试剂盒BD Biosciences，加利福尼亚州山景城#555214
CellTraceTM CFSE 细胞增殖试剂盒Thermo Fisher Scientific Inc，美国#C34554
RPMI 1640 培养基 1XThermo Fisher Scientific Inc，美国#31870-025
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific Inc，美国#15140-122
Hepes 缓冲液Thermo Fisher Scientific Inc，美国#15630-056
非必需氨基酸Thermo Fisher Scientific Inc，美国#11140-035
丙酮酸钠Thermo Fisher Scientific Inc，美国#11360-039
2-β-巯基乙醇Sigma，圣路易斯，美国#M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 细胞染料Thermo Fisher Scientific Inc，美国#65-0842-85
谷氨酰胺Sigma，圣路易斯，美国#G3126
DAPIThermo Fisher Scientific Inc，美国#D1306
胶原酶 DRoche Diagnostics，德国#11088882001
EDTASigma，圣路易斯，美国#E5134
0.9% NaClFresenius Kabi#B230561
磁性 DynabeadsDynal, Invitrogen#11033羊抗小鼠 IgG
One Comp eBeadsEbiosciences，圣地亚哥，美国#01-1111-42
聚维酮碘参照机构指南
异氟烷参照机构指南
纳布啡参照机构指南
土霉素参照机构指南
丁丙诺啡参照机构指南
美洛昔康参照机构指南
完全弗氏佐剂
隆朋参照机构指南
乳酸林格液参照机构指南
氯胺酮参照机构指南
红细胞裂解液将 8.29 g NH4Cl（Sigma，圣路易斯，美国 A-9434）、1 g KHCO3（Prolabo 26 733.292）和 37.2 mg EDTA（Sigma，圣路易斯，美国 E5134）溶于 800 ml H2O 中，调节 pH 至 7.2–7.4，加水定容至 1 L。
胶原酶 D将 1 g 胶原酶溶于 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS 中
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)向 1 ml PBS 1X 中加入 5 ml EDTA 0.1 M（Sigma，圣路易斯，美国 E5134）和 20 ml FCS
CFSE（Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen）将 50µg（=1 管）CFDA SE（组分 A）溶于 90μl DMSO（组分 B）中，配制成 10 mM 储存液。然后将储存液用 PBS 1X 稀释 20,000 倍，得到 0.5μM 溶液
共培养完全培养基500 ml 完全 RPMI-1640 培养基，含 5 ml 青霉素（80 单位/ml）-链霉素（80 mg/ml）、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml 非必需氨基酸（100X）、5 ml 丙酮酸钠（100 mM）、5 ml HEPES 缓冲液（1 M）、2.5 ml β-巯基乙醇（7 ml 2-巯基乙醇原液稀释于 10 ml RPMI 中）、10% FCS
名称公司货号备注
设备
50 ml 离心管BD Biosciences，加利福尼亚州山景城#227261
15 ml 离心管BD Biosciences，加利福尼亚州山景城#188271
筛网
Corning 塑料培养皿VWR，佩萨克#391-0439
100µm 和 60µm 组织滤网Sefar NITEX，海登，瑞士#03-100/44 和 #03-60/35
共培养用 96 孔圆底板 Falcon 圆底组织培养板，无菌，Corning#353077
FACS 染色用 96 孔 V 底板ThermoScientifique，丹麦#249570
ELISA 用 96 孔平底板Nunc Maxisorb
脾脏研磨用注射器BD Biosciences，加利福尼亚州山景城#309649
ELISA 阅读仪SPARK 10M，Tecan，瑞士SPARK 10M，Tecan，瑞士
离心机
水浴锅 
X 射线辐照仪Lincolshire，英国Faxitron CP160
旋转摇床
FACS Canto IIBD Biosciences，加利福尼亚州山景城
FACS Aria IIBD Biosciences，加利福尼亚州山景城
磁力架Thermo Fisher Scientific Inc，美国12302D

参考文献

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