本文及教学视频的目的是介绍如何完整暴露并摘除死后猪的脑组织和垂体腺，以获得适用于后续大体解剖学和组织学分析的完整标本。
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本文内容
摘要
摘要
猪在大型动物转化神经科学研究中的应用日益广泛，已成为非人灵长类动物在经济和伦理方面均可行的替代模型。猪的大脑体积较大，可使用常规的临床脑成像设备，并可直接应用和测试源自人类临床的神经外科手术方法和器械。然而，进一步的宏观和组织学分析需要在死后暴露猪的中枢神经系统（CNS），并随后取出脑组织。这并非易事，因为猪的中枢神经系统被厚实的骨性颅骨和脊柱所包裹。本文及配套教学视频旨在介绍如何在死后完整地暴露并取出猪脑及垂体，以获得适合后续宏观和组织学分析的完整标本。
引言
在过去的二十年中，猪的转化神经科学研究变得越来越受欢迎。猪脑体积较大，使得可以使用常规的临床脑成像设备，并可直接应用和测试来自人类临床的神经外科手术方法与器械1,2,3,4,5,6,7,8。在过去20年中，猪，尤其是小型猪（例如，哥廷根小型猪），已被用于研究神经调节治疗方法，如干细胞移植、病毒载体转染以及针对帕金森病、肥胖症、抑郁症和阿尔茨海默病的深部脑刺激2,6,9,10,11,12,13,14,15,16,17。随之而来的是立体定向和外科技术的发展，以实现对小型猪中枢神经系统（CNS）的干预操作3,18,19,20,21。这些中枢神经系统的改变已在活体动物中通过脑成像（PET10,13,22,24 和 MR23）、膀胱测压11,12,25、步态分析17、神经功能评估9,17，以及基于组织学和体视学分析的死后检查进行评估14,15,17,26,27,31。然而，死后分析需要暴露并取出猪脑，这并非易事，因为猪脑被厚厚的骨性颅骨和一层致密的纤维性硬脑膜所包绕。
本文及教学视频旨在介绍如何使用非电动外科器械，在15-20分钟内完整暴露并取出死后猪的大脑和垂体。教学视频和摄影图示展示了用于小型猪垂体腺解剖学研究的雄性小型猪（年龄：6个月，体重：20-25 kg）。
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方案
动物麻醉和安乐死操作均遵循《实验动物护理原则》（NIH 出版物第 86-23 号，1985 年修订版），并经丹麦动物研究伦理委员会批准。
1. 仪器
- 收集视频中展示并在材料表中列出的仪器。
2. 断头
注意：通过肌肉注射 5 mL 咪达唑仑（5 mg/mL）和 5 mL 氯胺酮（25 mg/mL）诱导麻醉。5–10 分钟后，当动物深度镇静时，经耳静脉插管并静脉注射戊巴比妥钠（200 mg/mL）致死剂量（100 mg/kg 体重）。为确认动物已完全安乐死，按照 Ettrup et al. (2011)20 所示方法检测趾间疼痛反射。安乐死的彻底性依据上述伦理声明中的描述予以确认，随后按照 Ettrup et al. (2011)20 所示方法进行经心灌注，灌注液为 5 L 等渗盐水。所有所示操作均在死亡后进行，因此无需采取长期麻醉及术后存活所必需的福利保护措施。
- 使用手术刀在下颌角下方做一个高位环形颈部切口，将猪的头部切断（图1A）。
- 继续使用手术刀向前切开颈部软组织，包括喉部和食管，直至到达骨性脊柱，位置大约在颅颈交界处。
- 从颅颈交界处的前方开始，使用手术刀在寰椎前弓上方及寰枕前膜处继续切开，从而暴露椎管和脊髓（图1B）。同时请助手将猪的身体部分向后拉离头部，以方便显露颅底与第一颈椎之间的区域。
- 继续用手术刀切开硬脊膜囊和脊髓（图1B）。需特别注意确保脊髓被完全横断。
注意：若未正确执行上一步骤，在后续断头过程中可能导致脊髓和脑组织受到不必要的牵拉。 - 在切开平面强力伸展颅颈交界处（图1C）。同时使用手术刀切断残余的寰枕韧带，使枕骨髁与寰椎上关节突之间的关节连接完全松解。将猪头与身体分离。
图1：小型猪去头术。（A）颈部切口（箭头，下颌角）。（B）在颅颈交界处切开寰枕韧带及被硬脊膜包绕的脊髓（SC）（C1，寰椎前弓；OC，枕骨髁）。（C）通过在切割平面施加强力过伸（箭头），松解寰枕关节的后部结构。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 颅骨开窗
- 将猪头放置在桌面上。
- 使用手术刀从吻部后方开始，沿头顶正中线向后，经头顶部延伸至枕部后区，切开皮肤及下方软组织，做一条背侧纵行切口。
- 使用手术刀清除初始切口两侧的软组织，暴露颅骨的背侧和后侧部分。
- 使用手术刀从颅骨两侧剥离颞肌（图2A），并确保枕骨后部的软组织已被彻底清除。
- 利用枕骨大孔的后方入口，使用Kerrison骨凿和咬骨钳去除枕骨，暴露被硬脑膜覆盖的小脑（图2B）。
- 返回暴露的颅骨前侧，在额骨上选择一个入路点，位置位于眼睛正前方。在此处使用骨凿和锤子穿透颅骨，进入额窦（图2C）。
- 利用额窦的范围，使用咬骨钳或骨凿继续向背侧和后侧方向去除颅骨外板，暴露覆盖大脑的内层薄骨板（图2D）。
- 使用锤子和骨凿轻柔地从前方向打开内层骨性颅板，暴露被硬脑膜覆盖的大脑（图2E）。
- 继续使用骨凿和咬骨钳向两侧方向去除颞骨和顶骨的骨质，以移除位于已暴露的大脑硬脑膜与小脑硬脑膜之间的最后背侧后段颅骨部分（图2F）。
注意：在该操作的最后阶段，通常可以像打开一扇门一样，用骨凿从一侧撬开剩余的后部颅骨。
图2：小型猪颅骨开窗。（A）暴露颅骨背侧后部表面，包括切除枕部和颞肌。（B）去除枕骨（CB，被硬脑膜覆盖的小脑；OB，枕骨；OC，枕骨髁；SC，脊髓）。（C）使用锤子和骨凿向前穿透颅骨，并在眼部水平进入额窦。（D）利用额窦（FS）的范围去除外层较厚的颅骨（1），暴露覆盖大脑的内层薄骨板（2）。（E）去除薄骨板，暴露被硬脑膜覆盖的大脑（箭头所示）。（F）最后，使用锤子和骨凿将前部与后部颅骨开窗在侧方连接。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 脑组织取出
- 使用手术镊抬起硬脑膜，并用精细手术刀在靠近静脉上矢状窦处做轻柔切口（图3A）。
- 使用显微剪刀或硬脑膜刀进一步打开覆盖在脑背侧表面的硬脑膜。
注意：移除小脑幕对应的硬脑膜时需特别小心（图3B），因为保留此层硬脑膜将阻碍后续脑组织的取出。 - 将猪头垂直放置（图3C）。
- 使用骨凿或解剖器，通过钝性分离嗅球与颅腔底面硬脑膜附着处，松解腹侧前脑（图3D）。
- 使用精细手术刀切断暴露的视交叉（图3E）。暴露并切断垂体柄和动眼神经。
- 用精细手术刀切断低位颅神经，以松解腹侧脑干（图3F）。确保小脑幕硬脑膜已完全切开（图3B），否则在松解过程中该硬脑膜层会切断脑干。
图3：小型猪脑组织取出。（A）使用手术镊和硬脑膜刀切开硬脑膜。（B）必须小心彻底切开位于大脑与小脑之间的硬脑膜叶片（箭头所示）。（C）将猪头垂直放置，以更清晰地观察颅底结构，并利用重力辅助脑组织按预期方向移位。（D）使用解剖器或骨凿通过钝性分离，将嗅球从被硬脑膜覆盖的颅底松解。（E）沿颅底向后继续解剖，暴露并切断视交叉（箭头所示）、漏斗柄及动眼神经。（F）切断从脑干腹侧表面发出的低位脑神经，完成脑组织的释放（III，动眼神经；IV，滑车神经；V，三叉神经；VI，外展神经）。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 垂体摘除
- 在颅底识别垂体柄及其周围的硬脑膜叶（鞍膈）（图4A）。
- 使用精细手术刀在垂体柄外侧切开硬脑膜叶（图4B）。
- 用解剖器松解垂体，并将其从垂体窝中抬起取出（图4C）。
图4：小型猪垂体摘除。（A）在颅底识别垂体窝（*）（1，嗅球；2，视交叉；PF，后颅窝）。（B）侧方切开硬脑膜覆盖层（鞍膈，（箭头））。（C）用解剖器松解垂体（箭头），并从垂体窝中取出。比例尺（A–C）= 10 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
为防止组织材料干燥，建议在完成大体分析后，立即将取出的脑组织和垂体置于装有固定液或等渗盐水的容器中保存。组织材料可在固定液中保存数年，而即使在冰箱中保存，等渗盐水也会随着时间推移导致组织腐败降解。
切除的垂体可直接浸入干冰冷却的2-甲基丁烷中进行速冻，而完整的猪脑体积过大，无法直接冷冻28相反，建议按照先前已展示的方法对猪脑进行切片28，切成9-15 mm厚的平行冠状组织片，以便冷冻 整体上 并使用冷冻切片机切片 40 µm厚切片5,18,26,28或者，可从完整取出的大脑或切开的脑组织...
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讨论
大多数实验神经科学研究是在小动物物种（如小鼠和大鼠）中进行的，这些动物的颅骨和硬脑膜较薄，便于进入中枢神经系统。然而，在猪1,4,8、绵羊32以及非人灵长类等较大的实验动物中，由于这些结构显著增厚，必须使用坚固的器械（材料表）并选择适当的入颅点以去除颅骨（图2）。在能够进入中枢神经系统并安全取出脑组织之前，必须了解限制性的硬脑膜皱襞（图3 和 图4）的解剖结构。
建议在去除颅骨的过程中保持硬脑膜完整，因为这可以保护下方的大脑免受损伤。先前的经心灌注固定20同样可能使脑组织变硬并轻微收缩，从而使颅骨和硬脑膜的去除过程更加简便和安全。与绵羊和非人灵长类动物不同，猪颅骨的一个特殊特征是额窦随年龄增长而逐渐扩大...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者们衷心感谢特里内·W·米凯尔森女士、莉丝·M·菲廷女士以及帕åskehøjgaard。本研究由丹麦医学研究委员会、伦贝克基金会和诺和诺德基金会提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 重型手术刀柄 #4 | FST (Fine Science Tools) | 10008-13 | 适用于皮肤切口和软组织切除 |
| 非无菌手术刀片 #23 | FST | 10023-00 | |
| 手术刀柄 #7 | FST | 10007-12 | 适用于硬脑膜切开和精细操作 |
| 非无菌手术刀片 #11 | FST | 10011-00 | |
| 外科镊 | FST | 11024-18 | 外科镊尖端确保牢固抓握 |
| Kerrison骨凿 | Aesculap Neurosurgery | FF713R | 必须坚固，咬合尺寸为3-5 mm |
| 骨钳 | Aesculap Neurosurgery | MD615 | 必须坚固，咬合尺寸为15 × 5 mm |
| 骨钳 | Aesculap Neurosurgery | FO551R | 必须坚固，咬合尺寸为25 × 15 mm |
| 骨凿 | Lawton | 67-0335 | 凿头尺寸不应超过20 mm |
| 小锤（锤子） | Millarco | 5624108 | 重量300 g，长度30 cm，击打面尺寸2 × 2 cm |
| 显微剪刀 | FST | 14002-14 | |
| 解剖器 | Aesculap Neurosurgery | OL165R | |
| Göttingen小型猪 | Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark | ||
| Euthanimal | 戊巴比妥 | ||
| 氯胺酮 | Pfizer | ||
| 咪达唑仑 | Hameln Pharmaceuticals |
参考文献
- Lind, M. N., Moustgaard, A., Jelsing, J., Vajta, G., Cumming, P., Hansen, A. K. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav Rev. 31, 728-751 (2007).
- Bjarkam, C. R., et al. Neuromodulation in a minipig model of Parkinson disease. British J Neurosurg. 22 (Suppl. 1), S9-S12 (2008).
- Bjarkam, C. R., Cancian, G., Glud, A. N., Ettrup, K. S., Østergaard, L., Sørensen, J. C. MRI-guided stereotaxic targeting in pigs based on a stereotaxic localizer box fitted with an isocentric frame and use of SurgiPlan computer-planning software. J Neurosci Methods. 183 (2), 119-126 (2009).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Bjarkam, C. R., et al. Safety and function of a new clinical intracerebral microinjection instrument for stem cells and therapeutics examined in the Göttingen minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 88 (1), 56-63 (2010).
- Fjord-Larsen, L., et al. Long-term delivery of nerve growth factor by encapsulated cell biodelivery in the minipig basal forebrain. Mol Therapy. 18 (12), 2164-2172 (2010).
- Sørensen, J. C., et al. Development of neuromodulation treatments in a large animal model - Do neurosurgeons dream of electric pigs? Prog Brain Res. 194, 97-103 (2011).
- Dolezalova, D., et al. Pig models of neurodegenerative disorders: utilization in cell replacement-based preclinical safety and efficacy studies. J Comp Neurol. 522 (12), 2784-2801 (2014).
- Mikkelsen, M., Moller, A., Jensen, L. H., Pedersen, A., Harajehi, J. B., Pakkenberg, H. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Danielsen, E. H., et al. The DaNEX study of embryonic mesencephalic, dopaminergic tissue grafted to a minipig model of Parkinson's disease: Preliminary findings of effect of MPTP poisoning on striatal dopaminergic markers. Cell Transplant. 9 (2), 247-259 (2000).
- Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Jørgensen, T. M., Djurhuus, J. C. Effects of high frequency deep brain stimulation on urine storage and voiding function in conscious minipigs. Neurourol Urodyn. 23 (3), 265-272 (2004).
- Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Djurhuus, J. C. Stereotactic electrical stimulation of the pontine micturition center in the pig. Br J Urol. 95, 886-889 (2005).
- Andersen, F., Watanabe, H., Bjarkam, C. R., Danielsen, E. H., Cumming, P. The DaNeX Study Group. Pig brain stereotaxic standard space: Mapping of cerebral blood flow normative values and effect of MPTP-lesioning. Brain Res Bull. 66 (1), 17-29 (2005).
- Glud, A. N., et al. Direct gene transfer in the minipig CNS using stereotaxic lentiviral microinjections. Acta Neurobiol Exp. 70 (3), 1-8 (2010).
- Glud, A. N., et al. Direct MRI-guided stereotaxic viral mediated gene transfer of alpha-synuclein in the minipig CNS. Acta Neurobiol Exp. 71 (4), 508-518 (2011).
- Ettrup, K. S., Sørensen, J. C., Rodell, A., Alstrup, A. K. O., Bjarkam, C. R. Hypothalamic deep brain stimulation influences autonomic and limbic circuitry involved in the regulation of aggression and cardiocerebrovascular control in the minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 90 (5), 281-291 (2012).
- Nielsen, M. S., et al. Continuous MPTP intoxication in the minipig results in chronic parkinsonian deficits. Acta Neurobiol Exp. 76, 198-210 (2016).
- Bjarkam, C. R., et al. A MRI-compatible stereotaxic localizer box enables high-precision stereotaxic procedures in pigs. J Neurosci Methods. 139 (2), 293-298 (2004).
- Bjarkam, C. R., Jorgensen, R. L., Jensen, K. N., Sunde, N. A. A., Sørensen, J. C. H. Deep brain stimulation electrode anchoring using BioGlue®, a protective electrode covering, and a titanium microplate. J Neurosci Methods. 168, 151-155 (2008).
- Ettrup, K. S., et al. Basic Surgical Techniques in the Minipig: Intubation, Transurethral Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion. J Vis Exp. (52), e2652(2011).
- Ettrup, K. S., Tornøe, J., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. A surgical device for minimally invasive implantation of experimental deep brain stimulation leads in large research animals. J Neurosci Methods. 200 (1), 41-46 (2011).
- Danielsen, E. H., et al. Positron emission tomography of living brain in minipigs and domestic pigs. Scand J Lab Anim Sci Suppl. 25 (1), 127-135 (1998).
- Røhl, L., et al. Time evolution of cerebral perfusion and ADC measured by MRI in a porcine stroke model. J Magn Reson Imaging. 15 (2), 123-129 (2002).
- Cumming, P., Gillings, N. M., Jensen, S. B., Bjarkam, C. R., Gjedde, A. Kinetics of the uptake and distribution of the dopamine D2/3 agonist (R)-N-[1-11C]n-propylnorapomorphine in brain of healthy and MPTP-poisoned Gottingen miniature pigs. Nucl Med Biol. 30 (5), 547-553 (2003).
- Jensen, K. N., Deding, D., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. Long-term implantation of deep brain stimulation electrodes in the pontine micturition centre of the minipig. Acta Neurochir. 151 (7), 785-794 (2009).
- Rosendal, F., et al. Does chronic low dose treatment with ciclosporin influence the brain? A histopathological study in pigs. Transplantation Proc. 37 (8), 3305-3308 (2005).
- Nielsen, M. S., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. The substantia nigra pars compacta of the minipig: An anatomical and stereological study. Brain Struct Funct. (4-5), 481-488 (2009).
- Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R., Simonsen, C. Z., Danielsen, E., Geneser, F. A. Oriented sectioning of irregular tissue blocks in relation to computerized scanning modalities. Results from the domestic pig brain. J Neurosci Methods. 104, 93-98 (2000).
- Bjarkam, C. R., Pedersen, M., Sørensen, J. C. New strategies for embedding, orientation and sectioning of small brain specimens enable direct correlation to MR-images, brain atlases, or use of unbiased stereology. J Neurosci Methods. 108, 153-159 (2001).
- Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Geneser, F. A. Distribution and morphology of serotonin-immunoreactive axons in the hippocampal region of the New Zealand white rabbit. I. Area dentata and hippocampus proper. Hippocampus. 13 (1), 21-37 (2003).
- Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Struct Funct. , e-pub ahead of print (2016).
- Boltze, J., Nitzsche, B., Geiger, K. D., Schoon, H. A. Histopathological investigation of different MCAO modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an ovine stroke model. Transl Stroke Res. 2, 279-293 (2011).
- Jortner, B. S. The return of the dark neuron. A histological artifact complicating contemporary neurotoxicologic evaluation. Neurotoxicology. 27, 628-634 (2006).
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