一种用于蛋白质和细胞图案化的多功能方法

摘要

本报告介绍了一种简单且易于操作的技术，利用低压真空将细胞和底物填充至微流控通道中，用于生物学研究。

摘要

底物和细胞图案化技术在细胞生物学中被广泛用于研究细胞间以及细胞与底物间的相互作用。传统的图案化技术仅适用于简单形状、小面积区域以及特定的生物材料。本文介绍一种利用负压将细胞悬液和底物溶液导入复杂、细长且封闭（盲端）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道的方法。该方法使研究人员能够对多种底物进行图案化，包括纤连蛋白、胶原蛋白、抗体（Sal-1）、聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白。通过对底物进行图案化，可间接实现多种细胞的图案化。我们已测试了C2C12成肌细胞、PC12神经细胞系、胚胎大鼠皮层神经元以及两栖动物视网膜神经元。此外，我们还证明，通过在细胞悬液上短暂施加低真空，该技术可直接在微流控通道内实现成纤维细胞的图案化。细胞活力检测结果表明，低真空处理不会显著降低细胞活力。本文还讨论了该方法针对不同类型细胞和底物的应用改进方案。该技术使研究人员能够在无需特殊材料或设备的情况下，在任意配备真空系统的实验室中实现细胞和蛋白质的特定图案化。

引言

在组织工程和生物传感领域，能够控制蛋白质和细胞在二维及三维空间中的排列方式对于模拟生理微环境、调控细胞行为以及构建功能性生物结构至关重要。 µ微米尺度在过去的四十年中变得愈发重要^1,2,3蛋白质和细胞的精确空间排列使研究人员能够研究细胞与含有相同或不同类型细胞的基底之间的相互作用，引导细胞生长，并固定生物分子以构建生物传感器。^4,5,6,7,8,9.

目前用于蛋白图案化的技术包括光图案化和微接触印刷。光图案化利用对光敏感的材料，在暴露于紫外光（UV）时发生交联。将紫外光照射到光掩模（由透光区域和阻挡紫外光透过的暗区组成）上，可在特定区域引发交联，从而用于后续固定生物材料或细胞^10,11<....

方案

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本实验方案中使用的某些化学品具有毒性且可能致癌。操作有毒或酸/碱性物质时，请务必采取所有适当的安全措施（如通风橱、手套箱）并穿戴个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。

1. 使用光刻技术制备软光刻用主模具

1. 使用计算机辅助设计（CAD）绘图工具绘制微通道的布局。
2. 使用激光掩模写入器将布局打印到空白掩模板上。
3. 用丙酮冲洗一片4英寸硅片，随后用异丙醇冲洗，并用氮气枪吹干，确保硅片表面无残留溶剂。
4. 将硅片置于加热板上，在200 °C下烘烤5分钟以进行脱水处理。
5. 选择适用于所需微通道高度的负性光刻胶。例如，使用负性光刻胶SU-8 50，以获得高度为50 µm的微通道。
6. 让硅片冷却至室温，然后将其对准并固定在匀胶机的卡盘上。
7. 将4 mL（每英寸硅片直径对应1 mL）负性光刻胶滴加至硅片中心。
8. 使用匀胶机进行两步旋转涂覆。首先，以100 rpm/s的加速度在500 rpm下旋转10秒进行铺展；然后，以300 rpm/s²的加速度在2,000 rpm下旋转30秒，以在硅片上形成厚度为50 µm的光刻胶涂层。
9. 根据制造商说明，在加热板上分两步对硅片进行前烘。对于50 µm厚的光刻胶涂层，先在65 °C下预烘6分钟，然后....

结果

该方法利用尺寸小至10 µm的盲端微流控通道，结合在大多数生物实验室中常见的设备（一旦制备好主模具），可实现蛋白质的图案化以及细胞的间接图案化。该技术可与采用传统软光刻技术制备的PDMS微流控通道联用，也可与采用胶带 fabrication 方法制备的PDMS微流控通道联用（图1）^28,29。我们此前已证明该方法可用于光感受器轴突导向研究中的神经元细胞间接图案化^4,30，并现已进一步验证其在多种不同来源细胞类型中的应用。在聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白表面图案化的大鼠胚胎皮层神经元表现出对图案化区域的良好黏附，并沿PDL和层粘连蛋白条带生长（图3A）。C2C12成肌细胞系同样黏附于图案化区域，并融合形成多核肌管（图3B）。我们还改进了.......

讨论

尽管传统光刻技术是制备软光刻模具的一种成熟方法，但大多数实验室难以获得使用该技术所需的设备、材料和专业技能。对于无法获取这些资源的实验室，我们提出了一种利用胶带制作模具的方法，可用于制备具有相对简单结构的微流控装置。该方法使任何实验室均可利用 readily available 的工具自行制作并使用微流控装置开展科研工作。通过低成本的台式乙烯基切割机，胶带制作法可得到进一步改进³¹。台式切割机可提高制作的重复性、分辨率以及图案复杂度。传统光刻、台式切割机和胶带制作这几种方法各有其能力与局限性，研究人员必须仔细评估哪种方法能够满足自身需求。

在固化的PDMS中，二甲基硅氧烷的长聚合物链形成一种具有纳米孔结构的晶格，从而产生可被空气分子填充的空腔区域²⁷。这种透气特性对我们的微流控通道填充方法至关重要。当将其置于低压环境中时，PDMS本体材料以及微通道内部的空气分子会被去除²⁵。随后当PDMS暴露于大气压下时，PDMS本体材料和微通道会在一段时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CorelDRAW X4 CAD 绘图工具	Corel Corporation, Canada	X4 版本 14.0.0.701	用于绘制微流控装置布局的 CAD 工具
HP 激光打印机	Hewlett Packard, CA	1739629	用于打印微流控装置布局，以用于胶带粘附技术
Bel-Art 干燥器	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	用于对 PDMS 混合物进行脱气处理
Scotch 胶带（压敏胶带）	3M 产品, MN	Tape 600	用于制作胶带母模
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	浇铸用聚合物
培养皿	Fisher Scientific, MA	08-772-23	用于盛放用于 PDMS 浇铸的模具
不锈钢手术刀（#3 手柄）配刀片（#11）	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	用于切割 PDMS
镊子	Ted Pella, CA	5627-07	用于在剥离过程中操作 PDMS 铸件
载玻片	Fisher Scientific, MA	12-546-2	用作图案化基底的表面
载玻片	Fisher Scientific, MA	12-544-4	用作图案化基底的表面
橡胶滚轮	Dick Blick 美术材料公司, IL	40104-1004	用于将胶带贴附在玻璃上而不夹入气泡
激光掩模写入仪	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	用于制造光刻工艺中使用的石英掩模
EVG 掩模对准器（光刻紫外曝光工具）	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	用于将光刻胶暴露于紫外光下
Headway 旋涂机	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	用于在硅片上旋涂光刻胶
光刻胶 SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	用于模具制造的负性光刻胶
SU-8 显影液	MicroChem, MA	Y020100	光刻胶显影剂
十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷	UCT Specialties, PA	T2492-KG	用于模具表面涂层，防止 PDMS 粘附
异丙醇	Sigma-Aldrich, MO	190764	清洗溶剂
乙醇	Sigma-Aldrich, MO	24102	灭菌溶剂
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL 溶液用四硼酸钠缓冲液配制成 0.1 mg/mL
层粘连蛋白（Laminin）	Sigma-Aldrich, MO	L2020	层粘连蛋白分装为 10 µL 等份，并在使用前用 PBS 稀释至 20 µg/µL
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	细胞培养
C2C12 成肌细胞系	ATCC, VA	CRL-1722	用于展示 C2C12 的图案化能力
PC12 细胞系	ATCC, VA	CRL-1721	用于展示 PC12 的图案化能力
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源	BD Biosciences	40236	细胞培养
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	细胞培养
马血清，热灭活	Fisher Scientific, MA	26050-070	细胞培养
鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）	Sigma-Aldrich, MO	P1951	用于细胞标记
Calcein-AM 活死细胞检测试剂盒	Invitrogen, MA	L-3224	细胞活力检测
活检打孔器	Ted Pella, CA	15110-10	在 PDMS 上打孔