本报告介绍了一种简单且易于操作的技术，利用低压真空将细胞和底物填充至微流控通道中，用于生物学研究。
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摘要
摘要
底物和细胞图案化技术在细胞生物学中被广泛用于研究细胞间以及细胞与底物间的相互作用。传统的图案化技术仅适用于简单形状、小面积区域以及特定的生物材料。本文介绍一种利用负压将细胞悬液和底物溶液导入复杂、细长且封闭（盲端）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道的方法。该方法使研究人员能够对多种底物进行图案化，包括纤连蛋白、胶原蛋白、抗体（Sal-1）、聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白。通过对底物进行图案化，可间接实现多种细胞的图案化。我们已测试了C2C12成肌细胞、PC12神经细胞系、胚胎大鼠皮层神经元以及两栖动物视网膜神经元。此外，我们还证明，通过在细胞悬液上短暂施加低真空，该技术可直接在微流控通道内实现成纤维细胞的图案化。细胞活力检测结果表明，低真空处理不会显著降低细胞活力。本文还讨论了该方法针对不同类型细胞和底物的应用改进方案。该技术使研究人员能够在无需特殊材料或设备的情况下，在任意配备真空系统的实验室中实现细胞和蛋白质的特定图案化。
引言
在组织工程和生物传感领域，能够控制蛋白质和细胞在二维及三维空间中的排列方式对于模拟生理微环境、调控细胞行为以及构建功能性生物结构至关重要。 µ微米尺度在过去的四十年中变得愈发重要1,2,3蛋白质和细胞的精确空间排列使研究人员能够研究细胞与含有相同或不同类型细胞的基底之间的相互作用，引导细胞生长，并固定生物分子以构建生物传感器。4,5,6,7,8,9.
目前用于蛋白图案化的技术包括光图案化和微接触印刷。光图案化利用对光敏感的材料，在暴露于紫外光（UV）时发生交联。将紫外光照射到光掩模（由透光区域和阻挡紫外光透过的暗区组成）上，可在特定区域引发交联，从而用于后续固定生物材料或细胞10,11。尽管该方法精度高，可精确控制培养表面的拓扑结构，但其应用仅限于可通过紫外辐射进行图案化的UV敏感型生物分子12。微接触印刷是另一种广泛使用的特定蛋白图案化方法13,14。在该方法中，先将聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章用多种表面修饰试剂处理，然后浸入选定的生物分子基质溶液中，再轻轻按压到玻璃盖玻片或其他表面上，从而将生物分子“印刷”到培养表面。然而，该方法受限于可转移材料的类型以及生物分子在PDMS印章表面的润湿性15。
直接对细胞进行图案化可能更为困难，通常依赖于复杂的方法，例如可切换的基底、基于掩模的方法，或利用特定细胞黏附分子进行图案化16,17。这些方法在细胞图案化方面存在局限性，原因包括缺乏兼容的细胞黏附基底、操作过程难以适用于敏感的生物细胞、图案重复性差以及操作步骤复杂。例如，在使用可切换基底时，需要为每种细胞类型专门设计定制的基底，以使其能够在不因暴露于工艺中所用的紫外光和热而降解的前提下，切换对特定细胞类型的黏附性17,18,19,20。基于掩模的图案化方法在细胞图案化方面具有较高的灵活性；然而，制造适用于特定厚度要求的聚二甲基硅氧烷（PDMS）掩模仍存在困难16,21。将细胞直接注入PDMS微流控通道具有一些优势，例如：1）微流控通道易于制备；2）适用于多种不同类型的细胞和基底。然而，由于PDMS具有疏水性，在未使用等离子体清洗或其他减少气泡的方法时，注射过程中容易捕获气泡，导致在玻璃或塑料表面稳定地形成图案化细胞变得困难21。
本研究在毛细管微模塑技术22,23,24,25,26的基础上进一步拓展，报道了一种将蛋白质和细胞悬液注入微通道的方法。该方法实现了基底的图案化，以及特定细胞类型的直接和间接图案化。该技术利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的透气性，克服了PDMS高疏水性的问题，并在基底或细胞注入过程中有效消除气泡的产生27。本文展示了该技术在多种不同基底和细胞类型中的应用。文章还重点介绍了使用传统光刻法以及一种简单、低成本的胶带法制作软光刻模具的过程，后者在资源有限的条件下尤为适用28,29。
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方案
注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本实验方案中使用的某些化学品具有毒性且可能致癌。操作有毒或酸/碱性物质时，请务必采取所有适当的安全措施（如通风橱、手套箱）并穿戴个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。
1. 使用光刻技术制备软光刻用主模具
- 使用计算机辅助设计（CAD）绘图工具绘制微通道的布局。
- 使用激光掩模写入器将布局打印到空白掩模板上。
- 用丙酮冲洗一片4英寸硅片，随后用异丙醇冲洗，并用氮气枪吹干，确保硅片表面无残留溶剂。
- 将硅片置于加热板上，在200 °C下烘烤5分钟以进行脱水处理。
- 选择适用于所需微通道高度的负性光刻胶。例如，使用负性光刻胶SU-8 50，以获得高度为50 µm的微通道。
- 让硅片冷却至室温，然后将其对准并固定在匀胶机的卡盘上。
- 将4 mL（每英寸硅片直径对应1 mL）负性光刻胶滴加至硅片中心。
- 使用匀胶机进行两步旋转涂覆。首先，以100 rpm/s的加速度在500 rpm下旋转10秒进行铺展；然后，以300 rpm/s2的加速度在2,000 rpm下旋转30秒，以在硅片上形成厚度为50 µm的光刻胶涂层。
- 根据制造商说明，在加热板上分两步对硅片进行前烘。对于50 µm厚的光刻胶涂层，先在65 °C下预烘6分钟，然后立即升温至95 °C，继续后烘20分钟。
- 让硅片冷却至室温，然后将其装载到光刻机台上。
- 使用掩模对准器将掩模与硅片对准，并按照制造商说明，以1.5 mW/cm2的强度照射紫外光146秒，使光刻胶层接受总计220 mJ/cm2的紫外剂量，适用于50 µm厚的光刻胶层。
- 在加热板上分两步对硅片进行曝光后烘烤。对于50 µm厚的光刻胶涂层，先在65 °C下预烘1分钟，然后立即升温至95 °C，继续后烘5分钟。
- 将硅片浸入SU-8显影液中，并轻轻摇动，直至硅片上的图形清晰可见。对于50 µm厚的光刻胶，显影时间约为6分钟。
- 用异丙醇和乙醇冲洗掉多余的显影液，然后用氮气枪吹干硅片。
- 将硅片置于加热板上，在150 °C下进行坚膜烘烤15分钟。
- 将硅片放入干燥器中，并加入25 µL硅烷化试剂三氯(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)硅烷。
注意：该硅烷化试剂具有腐蚀性，必须在酸/碱通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋）。 - 抽真空5分钟，并在不释放真空的条件下使硅片暴露于硅烷蒸气中30分钟。
- 将硅片转移至合适尺寸的培养皿中。
2. 使用胶带制备软光刻用主模具
- 使用 CAD 绘图工具绘制微通道的布局，并将图纸打印在白纸上。
- 用异丙醇清洁足够容纳设计图案的玻璃载片，然后用气枪吹干。
- 将胶带粘附到已清洁的玻璃载片上，注意避免夹入气泡。
- 将带有设计图案的纸张用胶带固定在玻璃载片四周，使胶带面朝上。
- 以纸上的设计图为参考，使用手术刀切割玻璃载片上的胶带，然后撕去玻璃载片上不需要胶带的区域。
- 用异丙醇冲洗玻璃载片，再用气枪吹干，随后将载片放入烘箱中，在 65 °C 下烘烤 30 分钟。
- 用橡胶滚轮轻轻滚压胶带表面以去除气泡，并让载片冷却至室温。
3. PDMS 装置的软光刻制备
- 按10:1（w:w）的比例混合PDMS弹性体与其固化剂，充分搅拌混合物，然后将混合物置于真空腔中脱气，直至混合物中无气泡出现。
- 将混合物倒入培养皿中的硅烷化硅胶模具或胶带模具内，形成约2 mm厚的PDMS层，并继续脱气至所有气泡消失。
- 在65 °C烘箱中固化PDMS 2小时。
- 使用手术刀在微结构特征至少5 mm以外处切割PDMS层，然后用镊子将固化的PDMS从模具上剥离。
- 在微通道任意位置使用1 mm活检打孔器打一个进样孔，优选位于微通道网络末端，如图2a和图4b所示。
- 用胶带清洁PDMS复制件，以去除吸附在器件表面的灰尘颗粒。通过用70%乙醇溶液冲洗，随后用无菌去离子（DI）水冲洗，并暴露于紫外线下30分钟，对PDMS微通道器件（PDMS复制件）进行灭菌处理。
- 将无菌PDMS器件保存在无菌培养皿中，待用。
4. 底物图案化
- 使用镊子将无菌的PDMS模具放置在无菌的玻璃盖玻片或培养皿上，并用镊子尖端轻轻按压。
注意：PDMS模具与玻璃盖玻片或培养皿之间形成一种贴合但可逆的密封，从而构成微通道，无需使用任何粘合剂。 - 在入口处滴加一滴（20 - 40 µL）基质溶液，完全覆盖入口孔。通过在微通道入口处加入20 µL溶于四硼酸钠缓冲液中的多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液，实现PDL图案化。
- 将培养皿置于约254 mmHgA的真空环境中（相当于生物实验室常用的真空压力）10分钟，并观察通道中有气泡逸出。
- 释放真空，观察基质溶液流入微通道。
- 在适当的条件下孵育培养皿，以促进基质附着。孵育条件见表1和表2（根据所用基质不同而有所差异）。对于PDL图案化，需在37 °C下孵育1小时。
- 使用无菌镊子小心剥离PDMS印章，并用去离子水将玻璃盖玻片上的图案清洗三次。
- 向培养皿中加入1%牛血清白蛋白（BSA）溶液，覆盖整个培养皿或玻璃盖玻片，并在37 °C下过夜孵育。
注意：此步骤可减少未包被区域的非特异性附着。 - 吸除1% BSA溶液，此时图案化的基质已准备就绪，可供使用。
5. 细胞的间接图案化
- 在无血清培养基中制备细胞悬液。细胞类型和细胞密度见表1。
- 将细胞悬液加入图案化培养皿中，并完全浸没图案化区域。
- 将培养皿置于37 °C培养箱中孵育15分钟，使细胞附着于图案化基底上。
- 吸除培养皿中多余的细胞悬液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻振荡洗涤图案化区域3次，每次10秒，以去除未贴壁的细胞。
- 向图案化细胞培养物中加入适当的培养基，并在37 °C的CO2培养箱中继续孵育图案化细胞。
6. 细胞的直接图案化
注意：该技术是步骤5中所述间接细胞图案化方法的一种替代方案。然而，与步骤5不同的是，该技术可在有或无基底包被的组织培养表面进行细胞图案化。
- 用70%乙醇溶液冲洗微流控装置，再用去离子水冲洗，以对其进行灭菌。
- 将装置在1% BSA溶液中浸泡过夜，以防止细胞黏附到PDMS表面。
- 在室温下干燥装置，并将其固定在经组织培养处理的培养皿底部。
- 在无血清培养基中制备细胞悬液。细胞类型和细胞密度见表2。
- 在入口处滴加4–8 µL细胞悬液（足以充满微通道），完全覆盖入口孔。
- 将培养皿放入真空环境中10分钟，观察通道中有气泡逸出。随后释放真空，观察细胞悬液流入微通道。
- 根据表2中所述的孵育条件（取决于所图案化的细胞类型），将培养皿置于孵育箱中以促进细胞黏附。向培养皿中加入PBS，使PDMS装置完全浸没。
- 用镊子小心地将PDMS从培养皿上剥离，用PBS清洗图案区域。向培养皿中加入细胞培养基，并将细胞培养物放入孵育箱中继续培养。
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结果
该方法利用尺寸小至10 µm的封闭式微流控通道，可在母模制备完成后，使用几乎所有生物实验室常见的设备实现蛋白质的图案化以及细胞的间接图案化。此技术可与采用传统软光刻工艺制备的PDMS微流控通道联用，也可与采用胶带成型法（adhesive tape fabrication）制备的PDMS微流控通道联用（图1）28,29。我们此前已证明该方法可用于光感受器轴突导向研究中的神经元细胞间接图案化4,30，目前进一步验证了其在多种不同来源细胞类型中的应用。在聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白（laminin）表面图案化的胚胎大鼠皮层神经元表现出对图案区域的良好黏附性，并沿PDL和层粘连蛋白条带生长（图3A）。C2C12成肌细胞系同样黏附于图案化区域，并融合形成多核肌管（
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讨论
尽管传统光刻技术是制备软光刻模具的一种成熟方法，但大多数实验室难以获得使用该技术所需的设备、材料和专业技能。对于无法获取这些资源的实验室，我们提出了一种利用胶带制作模具的方法，可用于制备具有相对简单结构的微流控装置。该方法使任何实验室均可利用 readily available 的工具自行制作并使用微流控装置开展科研工作。通过低成本的台式乙烯基切割机，胶带制作法可得到进一步改进31。台式切割机可提高制作的重复性、分辨率以及图案复杂度。传统光刻、台式切割机和胶带制作这几种方法各有其能力与局限性，研究人员必须仔细评估哪种方法能够满足自身需求。
在固化的PDMS中，二甲基硅氧烷的长聚合物链形成一种具有纳米孔结构的晶格，从而产生可被空气分子填充的空腔区域27。这种透气特性对我们的微流控通道填充方法至关重要。当将其置于低压环境中时，PDMS本体材料以及微通道内部的空气分子会被去除25。随后当PDMS暴露于大气压下时，PDMS本体材料和微通道会在一段时...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究的经费由新泽西州脊髓研究委员会（NJCSCR）（资助FHK）、CSCR14IRG005基金（资助BLF）、美国国立卫生研究院（NIH）R15NS087501基金（资助CHC）以及F.M. Kirby基金会（资助ETA）提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CorelDRAW X4 CAD 绘图工具 | Corel Corporation, Canada | X4 版本 14.0.0.701 | 用于绘制微流控装置布局的 CAD 工具 |
| HP 激光打印机 | Hewlett Packard, CA | 1739629 | 用于打印微流控装置布局，以用于胶带粘附技术 |
| Bel-Art 干燥器 | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | 用于对 PDMS 混合物进行脱气处理 |
| Scotch 胶带（压敏胶带） | 3M 产品, MN | Tape 600 | 用于制作胶带母模 |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | 浇铸用聚合物 |
| 培养皿 | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | 用于盛放用于 PDMS 浇铸的模具 |
| 不锈钢手术刀（#3 手柄）配刀片（#11） | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | 用于切割 PDMS |
| 镊子 | Ted Pella, CA | 5627-07 | 用于在剥离过程中操作 PDMS 铸件 |
| 载玻片 | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | 用作图案化基底的表面 |
| 载玻片 | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | 用作图案化基底的表面 |
| 橡胶滚轮 | Dick Blick 美术材料公司, IL | 40104-1004 | 用于将胶带贴附在玻璃上而不夹入气泡 |
| 激光掩模写入仪 | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | 用于制造光刻工艺中使用的石英掩模 |
| EVG 掩模对准器（光刻紫外曝光工具） | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | 用于将光刻胶暴露于紫外光下 |
| Headway 旋涂机 | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | 用于在硅片上旋涂光刻胶 |
| 光刻胶 SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | 用于模具制造的负性光刻胶 |
| SU-8 显影液 | MicroChem, MA | Y020100 | 光刻胶显影剂 |
| 十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷 | UCT Specialties, PA | T2492-KG | 用于模具表面涂层，防止 PDMS 粘附 |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | 清洗溶剂 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | 灭菌溶剂 |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL） | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL 溶液用四硼酸钠缓冲液配制成 0.1 mg/mL |
| 层粘连蛋白（Laminin） | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | 层粘连蛋白分装为 10 µL 等份，并在使用前用 PBS 稀释至 20 µg/µL |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | 细胞培养 |
| C2C12 成肌细胞系 | ATCC, VA | CRL-1722 | 用于展示 C2C12 的图案化能力 |
| PC12 细胞系 | ATCC, VA | CRL-1721 | 用于展示 PC12 的图案化能力 |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | BD Biosciences | 40236 | 细胞培养 |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | 细胞培养 |
| 马血清，热灭活 | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | 细胞培养 |
| 鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC） | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | 用于细胞标记 |
| Calcein-AM 活死细胞检测试剂盒 | Invitrogen, MA | L-3224 | 细胞活力检测 |
| 活检打孔器 | Ted Pella, CA | 15110-10 | 在 PDMS 上打孔 |
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