图案蛋白质和细胞的通用的方法

摘要

本报告描述了一种简单易行的技术，即使用低压真空，用细胞和底物填充微流体通道，用于生物学研究。

摘要

底物和细胞模式化技术广泛用于细胞生物学中，以研究细胞间和细胞间底物的相互作用。传统的图案化技术仅适用于简单的形状、小面积和选定的生物材料。本文介绍了一种利用负压将细胞悬液和底物溶液分配到复杂、长、封闭（死端）聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 微通道中的方法。这种方法使研究人员能够对多种底物进行图案化，包括纤连蛋白、胶原蛋白、抗体 （Sal-1）、聚-D-赖氨酸 （PDL） 和层粘连蛋白。底物的图案化允许间接地对各种细胞进行图案化。我们已经测试了 C2C12 成肌细胞、PC12 神经元细胞系、胚胎大鼠皮质神经元和两栖动物视网膜神经元。此外，我们证明该技术可以通过在细胞悬液上短暂施加低真空直接在微流体通道中形成成纤维细胞模式。如细胞活力测定所示，低真空不会显著降低细胞活力。讨论了将该方法应用于不同细胞和底物类型的修改。这项技术使研究人员能够以特定模式排列细胞和蛋白质，而无需使用特殊材料或设备，并且可以在任何有真空的实验室中完成。

引言

在组织工程和生物传感，控制在微米尺度的蛋白质和细胞的空间组织的能力，已成为在过去的四十年里^1，2，3越来越重要。蛋白质和细胞的精确空间组织已经允许研究者检查包含相似或不同类型的细胞，以引导细胞生长，和固定生物分子的生物传感器^{4，5，6，7，8}的制造电池和基板之间的相互作用^{， 9。}

图案蛋白目前的方法包括光图案和微接触印刷。光图案利用其在暴露交联ULTR光敏材料紫色（UV）光。冲着光掩模（由透明区域的较深区域，以防止UV光透射）的UV光使在随后可被用于生物材料或电池^10，11的后续附着特定区域交联。虽然这种方案是非常准确的，并允许培养表面的地形的精确控制，它是有限的，可以通过UV辐射¹²被图案化UV敏感的生物分子。微接触印刷是形成图案的特定蛋白质^13,14的另一种流行的方法。在该方法中，聚二甲基硅氧烷（PDMS）印模与多种表面改性试剂中所选择的生物分子基底的溶液中浸泡前处理。它然后轻轻按压到玻璃盖玻片或其它表面从而"冲压"的生物分子上的培养物表面。何wever，冲压仅限于可以的PDMS压模¹⁵传送以及生物分子的润湿性的表面的材料的类型。

细胞的直接图案化可以更加困难，并依赖于复杂的方法，例如可切换基板，基于模版的方法，或图案形成具有特定细胞粘附分子^16,17。这些方法是在自己的能力图案细胞由于缺乏兼容细胞粘附基底的限制，该方法的不相容性与敏感的生物细胞和约束，不一致性在再现图案化，并且该过程的复杂性工作。例如，与可切换的基板，定制基材需要被设计为每一个细胞类型，在暴露于切换它们遵守特定的细胞类型，而不降解到UV光和热在过程¹⁷使用的^，< SUP类="外部参照"> ^{18，19，20。}基于模板图案的方法是在自己的能力格局细胞多才多艺的;然而，它难以制造的PDMS模具在使用^16，21中的适当的厚度。细胞进入的PDMS微流体通道的直接注射有一些优点，如:1）缓解微流体通道的制造和2），用于许多不同的细胞和基质的适宜性。然而，在注射过程中空气气泡捕捉由于PDMS的不使用等离子体清洗，或其他方法来减少气泡的疏水性的普遍问题，使得难以一致地创建在玻璃或塑料表面²¹图案化的细胞。

这项工作扩展了毛细管微模塑^22，23，小姑娘="外部参照"> ^{24，25，26，}并报告给注射蛋白质和细胞悬液到微通道的方法。此处所使用的方法展示衬底的图案化和特定细胞类型的直接和间接的构图。该技术克服了PDMS的疏水性高，并采取的PDMS ²⁷的透气性的优点消除气泡的任一底物或细胞注射期间的存在。本文证明了具有几种不同的底物和细胞类型的使用的技术的。本文还使用常规的光刻法以及一种简单和低成本的粘合带的方法在资源有用有限设置^{28个 ，29}突出的模具的制造中用于软光刻。

方案

注意:使用前请咨询所有相关的材料安全数据表（MSDS）。一些在该协议中使用的化学品是有毒和致癌性。使用有毒或酸/碱材料时，请使用所有适当安全操作规范（通风橱，手套箱）和个人防护装备（护目镜，手套，实验室外套，全长裤，封闭趾鞋）。

1.制造主模具软光刻使用光刻

1. 绘制使用计算机辅助设计（CAD）绘图工具的微通道的布局。
2. 使用激光掩膜写入空白掩模板打印的布局。
3. 冲洗用丙酮随后异丙醇和干燥用氮气气枪一个4英寸的硅晶片，以确保没有溶剂残留在晶片上。
4. 通过在200℃下烘烤的热板上进行5分钟脱水晶片。
5. 选择设计的微通道的所需高度的负光致抗蚀剂。 F或者例如，使用负光致抗蚀剂的SU-8 50具有50μm的高度，以获得微通道。
6. 允许晶片冷却至室温，然后对齐晶片上旋涂器的卡盘。
7. 分配负光致抗蚀剂4毫升（毫升/英寸直径晶片的1）到晶片的中心。
8. 旋涂在晶片用旋涂器的两步旋转循环。首先，应用500rpm的传播周期以100rpm / s的的10秒的加速度。然后应用2000 rpm的旋转周期为300转/秒²的加速度为30秒，以获得在晶片上的光刻胶的一个50微米的涂层。
9. 软烘烤在根据制造商的指示在热板上两个步骤的晶片。对于光致抗蚀剂50μm的涂层，第一预烘烤在65℃下进行6分钟的晶片，然后立即斜坡上升的热板温度进行后烘烤在95℃下将晶片20分钟。
10. 允许晶片冷却到室温，然后装入晶圆上光刻阶段。
11. 使用掩模对准对准晶片上的掩模，并在为146秒的1.5毫瓦/厘米²的强度曝光晶片于UV光（根据制造商的说明）应用220毫焦耳的总UV剂量/ cm ²的所需一50微米厚的一层光刻胶。
12. 在热板上曝光后烘烤应用于晶片在两个步骤。对于光致抗蚀剂的一个50微米的涂层，第一预烘烤在65℃下将晶片1分钟，并立即斜坡上升的热板温度进行后烘焙它在95℃下5分钟。
13. 在SU-8开发者淹没晶圆并轻轻晃动，直到特点成为晶圆上明确的发展晶圆英寸制定为50微米厚的光刻胶〜6分钟的片。
14. 冲洗掉多余的开发商用异丙醇和乙醇，然后用干燥氮气气枪晶圆。
15. 硬烤在硅晶片上的热板上在150℃下进行15分钟。
16. 放置晶片与硅烷化剂的25微升干燥器十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷。
    注:硅烷化剂具有腐蚀性，因此应在酸/碱通风橱中使用，配备适当的个人防护设备（防护眼镜，手套，实验室外套，全长裤，封闭趾鞋）。
17. 施加真空5分钟，并暴露所述晶片的硅烷30分钟的蒸汽而不释放真空。
18. 转移晶片到适当大小的培养皿。

2.制造主模具软光刻使用胶带

1. 绘制使用CAD绘图工具的微通道的布局，并打印在白纸上的绘图。
2. 清洁载玻片大到足以容纳用异丙醇设计，然后干燥用空气枪的幻灯片。
3. 安装胶带到清洁玻片。要小心，不要捕获任何气泡。
4. 大盘的GLA侧面SS拨动到纸上的设计，与磁带的一面朝上。
5. 使用手术刀使用的纸张设计作为参考，以削减在载玻片磁带，然后从载玻片上的不需要的区域剥离胶带。
6. 冲洗用异丙醇载玻片，然后干燥用空气枪。烘烤在烘箱载玻片在65℃下30分钟。
7. 在磁带轻轻摇动用橡胶辊以除去气泡并允许滑动冷却到室温。

3. PDMS设备的软光刻制造

1. 混合的PDMS弹性体及其固化剂以10:1的比例（重量:重量），充分搅拌该混合物剧烈，然后将其放入一个真空室脱气混合物直至没有气泡出现在混合物中。
2. 倒入混合物到硅烷化硅模具或胶带铸型在培养皿以获得〜2毫米的PDMS厚层和脱气，直至所有的气泡消失。
3. 固化的PDMS在烘箱在65℃下2小时。
4. 用手术刀切割PDMS层从功能至少5mm远，然后剥离使用镊子模具中的固化的PDMS。
5. 冲与1毫米活检单个入口孔的任何地方打孔的微通道，优选在微通道的一个网络的端部如在图2a可见和4b。
6. 请用胶带蒙上除去吸附到设备上的灰尘颗粒的PDMS。通过用70％乙醇，随后通过无菌去离子（DI）水的溶液冲洗消毒的PDMS微通道装置（PDMS铸），并暴露于紫外线30分钟。
7. 保持无菌PDMS设备在无菌培养皿直至使用。

4.基材图案

1. 放置用镊子投无菌的PDMS上的无菌玻璃盖玻片或培养皿并使用镊子的顶端施加轻柔的压力。
   注:PDMS投使得保形，但与GL可逆密封屁股盖玻片或培养皿中不使用任何粘合剂形成微通道。
2. 放置一个微滴 - 上完全覆盖入口孔的入口处的底物溶液（20 40微升）。图案聚-D-赖氨酸（PDL）通过在微通道的入口放置的PDL的20微升液滴在四硼酸钠缓冲液中。
3. 把培养皿在〜254 mmHgA的真空（相当于容纳在生物实验室真空）10分钟，并观察空气流出通道中的气泡的形式。
4. 释放真空并观察流入微通道的底物溶液。
5. 在孵育底物附着在适当的条件下菜。 见表1和表 2的培养条件（这些取决于在基片上）。对于PDL图案，在37℃孵育1小时。
6. 用无菌镊子小心地剥去PDMS邮票，用去离子水洗涤三次对玻璃盖玻片的格局。
7. 1％的牛血清白蛋白（BSA）溶液添加到培养皿，以覆盖盘或玻璃盖玻片并孵育过夜，在37℃。
   注意:这将减少在未涂覆区域的非特异性粘附。
8. 吸掉1％BSA的溶液中，将图案化衬底，现在可以使用了。

5.细胞间接图案

1. 制备在无血清培养基中的细胞悬浮液。细胞类型和细胞密度都列于表1。
2. 将细胞悬浮液添加到该图案化的培养皿和完全淹没在细胞悬浮液中的图案化区域。
3. 孵育在37℃的培养皿中15分钟的培养箱，以允许细胞附着到图案化衬底。
4. 吸从培养皿多余的细胞悬浮液，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤所述图案化的细胞三次，同时轻轻10秒摇动以除去未附着的细胞。
5. 添加一个ppropriate培养基到图案化的细胞培养物，并在CO ₂培养箱中孵育该图案化细胞在37℃。

6.细胞直接图案

注意:此技术是在步骤5。然而，在步骤5中描述的，不同的是间接细胞图案的替代，在该技术的细胞上具有或不具有底物涂层的组织培养表面图案化。

1. 通过用乙醇接着DI水中70％的溶液冲洗消毒微流体装置。
2. 过夜浸泡装置在1％BSA的溶液中，以防止细胞粘附到PDMS。
3. 干燥设备在室温和其附加到组织培养处理的培养皿底部。
4. 制备在无血清培养基中的细胞悬浮液。细胞类型和细胞密度都列于表2中 。
5. 放置一个微滴 - 细胞悬浮液（4 8微升），足以填满微通道，在入口完全覆盖入口孔。
6. 把培养皿在真空10分钟，并观察空气流出通道中的气泡的形式。释放真空并观察流入微通道中的细胞悬浮液。
7. 孵化培养皿在培养箱，以促进细胞粘附根据培养条件（取决于细胞类型图案化的）在表2中提及。添加PBS的培养皿浸没PDMS设备。
8. 皮尔的PDMS小心掉培养皿中用镊子和用PBS洗模式。细胞培养基添加到培养皿，然后将细胞培养物在孵化器。

结果

此方法允许蛋白质和使用具有尺寸小至10微米的和可用的设备中几乎所有的生物实验室死胡同微流体通道，一旦母模是由细胞的间接形成图案的图案形成。这种技术可以使用传统的软光刻法，或用胶带的制造（ 图^1）28，29中创建的PDMS微流体通道创建的PDMS微流体通道被利用。之前我们已经证实在神经元细胞在光感受器^4，30轴突导向的评价间接图形使用这个程序，而现在已经证明了它的使用在一些额外的细胞类型不同的历史背景的。图案上的聚-D-赖氨酸（PDL）未成熟神经元和层粘连蛋白表面展示一般adherencE要沿PDL和层粘连蛋白的条纹（ 图3A）的图案化的区域和生长。 C2C12成肌细胞系也附着到图案化区域和展示的融合到多核肌管（ 图3B）。我们还适于这种技术...

讨论

而常规的光刻是用于创建模具软光刻，设备，材料，和需要使用传统的光刻技术的良好建立的技术是不容易获得的大多数实验室。对于没有访问这些资源的实验室，我们已经提出了胶带制造为具有相对简单的功能，对于微流体装置产生的模具的方法。这种方法允许任何实验室创建和利用用于研究目的使用现成的工具微流体装置。粘合带的方法可以用低成本的桌面乙烯基切刀³¹得到改善。桌面乙烯基切刀可能增加可重复性，分辨率，以及布局的复杂性。每个选项，传统的光刻，桌面切割机，或胶带制作有不同的能力和局限和研究人员必须仔细考虑哪一种方法就足够了他们的需求。

在固化的PDMS，二甲基硅氧烷的长聚合物链构成的晶格，纳米多孔结构，其创建了可填充有空气分子²⁷空的区域。这种透气性物业的关键是我们的填充微流体通道的方法。当置于低压环境，空气分子从PDMS散装材料以及微通道本身²⁵除去。当与PDMS然后暴露于大气压力下，PDMS散装材料和微通道保持一个负压力一段时间

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CorelDRAW X4 CAD 绘图工具	Corel Corporation，加拿大	X4 版本 14.0.0.701	CAD 工具，用于绘制微流控装置的布局
激光打印机 HP	Hewlett Packard，CA	1739629	用于打印胶带技术的微流控装置的布局
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific，MA	08-594-16B	用于对 PDMS 混合物
进行脱气胶带	3M 产品，MN	胶带 600	用于制造胶带 Master
PDMS Sylgard 184	康宁，密歇根	1064291	铸造聚合物
培养皿	Fisher Scientific，MA	08-772-23	用于保持模具用 PDMS 铸造
带刀片的不锈钢手术刀 （# 11）Feather	Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	用于切割 PDMS
镊子	Ted Pella， CA	5627-07	用于在剥离过程中处理 PDMS 铸模
载玻片	Fisher Scientific， MA	12-546-2	用作衬底
载玻片	Fisher Scientific， MA	12-544-4	用作衬底
橡胶滚筒	Dick Blick Art Materials， IL	40104-1004	用于将胶带粘在玻璃上而不会捕获气泡
激光掩模写入器	德国海德堡仪器	DWL66fs	用于制造用于光刻制造工艺的石英掩模
EVG 掩模对准器（光刻紫外曝光工具）	EV Group，德国	EVG 620T（B）	用于将光刻胶暴露在紫外光下
旋压涂布机 Headway	Headway Research Inc，德克萨斯州	PWM32-PS-CB15PL	用于在硅片上旋涂光刻胶
光刻胶 SU-8 50	MicroChem， MA	Y131269	用于模具制造的负性光刻胶
SU-8 Devloper	MicroChem， MA	Y020100	光刻胶显影
Tridecafluoro-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯氢氢硅烷	UCT 特种产品，PA	T2492-KG	涂层模具，避免 PDMS 粘附
异丙醇	Sigma-Aldrich， MO	190764	清洁溶剂
乙醇	Sigma-Aldrich， MO	24102	灭菌溶剂
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 （PDL）	Sigma-Aldrich， MO	P0899-10MG	中以 0.1 mg/mL 的浓度制备
			将层粘连蛋白分装成 10 µL 等分试样并稀释至 20 &微量;g/&微;使用前 PBS 中的 L
BSA	Fisher Scientific，MA	BP1605100	细胞培养
C2C12 肌母细胞系	ATCC，VA	CRL-1722	用于演示 C2C12 模式化
PC12 细胞系	ATCC，VA	CRL-1721	用于演示 PC12 模式化
1 型胶原蛋白，大鼠尾	BD Biosciences	40236	细胞培养
DMEM	GIBCO，MA	11965-084	细胞培养
马血清，热灭活	Fisher Scientific，MA	26050-070	细胞培养
鬼笔环肽-四甲基罗丹明 B 异硫氰酸酯 （TRITC）	Sigma-Aldrich，MO	P1951	标记细胞
钙黄绿素-AM 活死细胞检测试剂盒	Invitrogen，MA	L-3224	细胞活力检测
活检 打孔	Ted Pella，CA	15110-10	PDMS 中的冲孔