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方法文章

通过短期渐进性力量训练提高老年人的力量、功率、肌肉有氧能力和葡萄糖耐受性

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DOI：

10.3791/55518

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2017年7月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Åstrand Laboratory of Work Physiology, The Swedish School of Sport and Health Sciences, GIH, 2Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet

本文内容

摘要

通过多种方法的联合应用，研究了短期抗阻训练对老年人的影响。与对照组相比，观察到多项改善，包括肌肉有氧能力、葡萄糖耐量、力量、功率以及肌肉质量（即参与细胞信号传导和肌纤维类型组成的蛋白质）。

摘要

本方案描述了同时采用多种方法评估老年人在进行短期抗阻训练（RET）期间肌肉有氧能力、葡萄糖耐量、力量和功率的综合流程。RET组受试者（71±1岁，年龄范围65-80岁）在8周内每周进行3次、每次1小时的监督式渐进性抗阻训练。与未进行训练的对照组相比，RET组在反映力量、功率、葡萄糖耐量以及多项肌肉有氧能力指标方面均表现出显著改善。抗阻训练在健身房内仅使用结构稳固的健身器材完成。采用等速肌力测定仪评估膝伸肌力量，可测量向心、离心和静态力量，RET组在训练后较训练前均有所提升（提高8-12%）。RET组在初始0-30毫秒内的发力速率（RFD，即功率）也显著增加（52%）。通过频繁采血检测血糖的葡萄糖耐量试验显示，仅RET组在2小时后的血糖值（降低14%）和曲线下面积（降低21%）方面有所改善。血脂谱亦得到优化（改善8%）。通过组织化学方法制备的肌肉活检样本显示，RET组IIa型肌纤维比例增加，IIx型肌纤维比例呈下降趋势，提示肌纤维组成向更具氧化代谢特性的表型转变。Western blot检测（用于测定与肌肉蛋白质合成信号通路相关的蛋白含量）显示，RET组Akt和mTOR蛋白含量均升高69%；同时，仅在RET组中观察到OXPHOS复合体II、柠檬酸合酶（均约增加30%）以及复合体IV（增加90%）的线粒体蛋白含量上升。我们证实，此类渐进性抗阻训练可带来多种生理改善（例如，力量、功率、有氧能力、葡萄糖耐量及血浆血脂谱）。

引言

衰老伴随着肌肉质量（肌少症）、力量和功率的下降。力量降低，尤其是功率的降低，会导致活动能力下降、受伤风险增加以及生活质量降低。抗阻训练是预防肌少症和肌肉功能衰退的常用有效策略。肌肉力量的粗略估计可通过负荷量或完成的重复次数获得。然而，本研究采用等速肌力测试仪，更详细且准确地获取了肌肉功能信息，包括等长、向心和离心收缩过程中的力矩，以及力量发展动力学的相关数据。

整体水平的有氧能力（VO₂max）与局部肌肉水平的有氧能力（如通过近红外光谱技术评估的肌肉氧利用）均是衡量心肺耐力的重要指标。这些参数在运动生理学、临床康复及健康风险评估中具有广泛应用。准确测定有氧能力有助于制定个性化运动处方、监测训练效果以及评估慢性疾病患者的预后。常用测试方法包括递增负荷运动试验（如跑步机或功率自行车测试），结合气体代谢分析系统持续采集呼出气体以计算VO₂变化。测试过程中需密切监测受试者的心率、血压及主观疲劳程度，确保安全性。近年来，便携式生理监测设备的发展使得在非实验室环境下进行有氧能力评估成为可能，提升了测试的可及性与生态效度。关键词：有氧能力，VO₂max，近红外光谱，递增负荷运动试验，气体代谢分析，心肺耐力，运动生理学，临床评估2max)以及骨骼肌中的含量在老年人中有所降低。心率随年龄增长而下降，这在很大程度上解释了VO₂max的降低。2max1，但肌肉氧化能力下降，主要与体力活动减少有关2，确实具有影响。线粒体功能受损也可能参与肌肉减少症和胰岛素抵抗的发生发展。3. 通过生化分析肌肉活检样本中线粒体酶及位于基质内的蛋白质复合物的含量，评估肌肉的有氧能力（即， 柠檬酸合酶）和线粒体内膜。此外，采用组织化学技术检测阻力训练对肌肉形态的影响（即， 肌纤维类型组成、肌纤维横截面积和毛细血管密度）。评估肌肉有氧能力的另一种方法是采用磁共振波谱法，测量运动诱导耗竭后磷酸肌酸的再合成速率。4该方法可提供一种估算 体内 肌肉有氧能力，但无法区分线粒体功能障碍与循环系统疾病。此外，设备的高成本限制了该技术在大多数实验室中的应用。有氧能力（VO2max 并且线粒体密度）可以通过耐力运动在年轻人和老年人中得到改善5,6然而，关于阻力训练对这些参数的影响研究较少，尤其是在老年人群中，且现有结果存在矛盾7,8,9,10.

2型糖尿病在老年人群中是一种常见疾病。体力活动不足和肥胖是导致2型糖尿病发病率上升的主要生活方式相关因素。对于葡萄糖耐量降低的个体，通常建议进行低强度有氧运动。然而，老年人进行力量训练如何影响葡萄糖耐量/胰岛素敏感性尚不明确11,12。测量胰岛素敏感性最准确的方法是采用葡萄糖钳夹技术，即在胰岛素水平升高的条件下，通过葡萄糖输注维持血糖浓度恒定13。该技术的缺点是耗时较长、具有侵入性（需动脉插管），并且需要特殊的实验室设备。本研究采用了在医疗机构中常用的口服葡萄糖耐量试验。当需要在有限时间内对多个受试者进行检测时，该方法尤为适用。

实验程序的测试安排和时间线可总结如下。在为期八周的干预前后，分别使用三个独立的测试日进行测试，每次测试应保持相同的安排和大致相同的时间表（每两次测试之间至少间隔24小时，图1）。在第一次测试日，测量以下指标：人体测量数据，如身高、体重、去脂体重（FFM）和大腿周长（即在放松仰卧位时髌骨上缘上方15 cm处）；次最大强度自行车运动能力；以及膝关节肌力，具体操作见步骤4和5。在第二次测试日，从大腿部位取肌肉活检样本。详细操作见步骤6.1。在最后一次测试日进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。详细操作见步骤7.1。要求所有受试者在每次测试前24小时内避免剧烈体力活动，并在测试前夜开始禁食。但在进行OGTT测试前48小时，应避免高强度体力活动。要求受试者保持其日常正常的体力活动和饮食习惯。需注意的是，在干预前后，两组受试者自我报告的食物摄入量和食物种类均未发生改变。

静态平衡研究；时间线图表；干预前后测试；RET/CON实验结构。
图1：实验方案。 示意图。每位受试者在三次干预前和干预后测试之间的时间间隔相似，且至少为24小时。文中提供了更多细节。本图改编自Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sports. 2016: 26, 764-73。28 请点击此处查看此图的放大版本。

本研究旨在探讨短期抗阻训练对老年人肌肉氧化能力和葡萄糖耐量的影响。第二个目标是评估其对力量、功率以及肌肉质量改善的作用。即， 参与细胞信号传导和肌纤维类型组成的蛋白质。

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方案

瑞典斯德哥尔摩地区伦理委员会批准了本研究的设计。

1. 材料

  1. 招募年龄在65至80岁之间、体重指数（BMI）在20至30 kg·m-2范围内的相对健康女性和男性。将其随机分为两组。确保两组个体的体力活动水平相对较低（即每日有中等程度的身体活动，但无规律的运动训练）。
  2. 排除使用β受体阻滞剂者，以及患有冠状动脉疾病或严重神经系统或关节问题的个体。
  3. 在告知受试者测试和训练过程中可能产生的不适与风险后，获取其书面知情同意。
  4. 在年龄、性别和BMI方面对阻力训练（RET）组和无训练对照组（CON）进行均衡匹配。要求其中一组在教练指导下每周进行三次、每次1小时的阻力训练，持续八周；另一组作为对照组（CON）不进行训练。

2. 测试与训练

注意：这八项练习是标准的力量训练动作：坐姿腿推举、坐姿仰卧起坐、仰卧推胸、坐姿背部伸展、坐姿肩部推举、坐姿划船、坐姿腿伸展（膝关节伸展）和俯卧腿弯举（膝关节屈曲）；参见代表性结果部分的图8。

  1. 在第一次训练期间，评估每项训练动作的一次最大重复（1 RM）最大力量。
    注意：1 RM 模型是常用方法，定义为受试者仅能完成一次但无法完成第二次的负荷量。
    1. 开始前，要求受试者对测试动作进行简短的热身（以极低负荷进行几次初步尝试），随后逐步增加负荷，直至接近但略低于预计的 1 RM 值（通常为 3-4 次递增负荷中的最大值）。记录受试者仅能完成一次动作的最大负荷（= 1 RM）。
    2. 在八项标准力量训练动作中测量 1 RM（参见《代表性结果》部分的图 8）。要求受试者在每次测试动作之间至少休息 2-3 分钟。
      注意：所有训练动作（包括各训练动作的测试）均使用力量训练设备。
  2. 要求整个 RET 组每周进行三次、每次 1 小时的监督式力量训练，持续八周。要求受试者在热身后完成上述八项标准训练动作。每组重复每个动作 12 次，每个动作完成三组。每组之间休息 1 分钟，每个动作之间休息 2-3 分钟。
    1. 要求受试者在向心阶段（即 肌肉缩短阶段）尽可能快速地完成每个动作，在离心阶段（即 肌肉拉长阶段）则缓慢进行。
      注意：受试者可按任意顺序完成动作，但应要求他们以腿部动作为起始和结束，并尽量按所列顺序完成八项动作。所有八项动作均使用力量训练设备。
    2. 在每次训练中，要求受试者以每项动作 1 RM 的 75-80% 负荷完成三组。当某受试者在某项动作的三组中均能完成 12 次重复时，下一次训练 session 中将负荷增加约 5%。

3. 次最大强度骑行测试

注意：在测试第1天进行次最大强度骑行测试（参见引言和图1）。

  1. 进行功率自行车测试，包括两个亚极量负荷水平，每个水平持续4分钟14,15。将第一级负荷设为低强度（30 W），第二级负荷设为60–120 W，在功率自行车上两个负荷之间不暂停。
    注意：第一级负荷对所有受试者均相同，但第二级及最后的亚极量负荷应使每位受试者的心率达到其最大心率的约65–85%。在为期8周的干预训练前后，这两个负荷应保持一致。
    1. 根据试验前进行的适应性测试来确定第二高的负荷水平，方法包括询问受试者的身体活动水平，并让受试者先短时间骑行；测试负责人将根据受试者的心率表现判断最终合适的亚极量负荷。
    2. 使用通过胸带连接的心率监测器，记录在低负荷和高负荷最后1分钟内的平均稳态心率（HR），取每个负荷水平3:15、3:30、3:45和4:00分钟时观测到的心率的平均值。
    3. 使用运动肺功能测定设备测定呼出气和吸入气中的气体成分（O2和CO2）。记录呼吸交换比（RER；即 CO2/O2），并在两个负荷水平的最后1分钟内（每15秒测量一次，共四次）计算RER的平均值。

4. 膝伸肌力量：静态、离心和向心峰值力矩及力发展速率

注意：在测试第1天进行膝关节力量测量（参见引言和图1）。

  1. 在开始记录前，要求受试者在功率自行车上以亚最大强度（即最大心率的约65-85%）进行8-10分钟的热身骑行。
  2. 让受试者坐在等速测力计的座椅上。使用肩部和髋部的绑带固定受试者的躯干。用两条绑带将受试者小腿牢固地固定在测力计转轴上：一条位于膝关节下方，另一条位于踝关节上方。使膝关节轴线与测力计转轴的旋转中心对齐。
  3. 当受试者固定就位后，让其坐在等速测力仪上，评估最大自主膝关节力量，以峰值扭矩表示。首先让受试者进行数次练习，以熟悉膝关节力量测试设备（等速测力仪）。
  4. 要求受试者用右腿以30 deg/s的恒定角速度交替完成四次最大自主偏心和向心膝关节伸展。运动范围设定在90°至15°之间（伸直腿为0°）。
    1. 在离心运动任务中，要求受试者在整个运动过程中（从15°到90°膝关节角度）尽最大努力抵抗测力计轴的移动。在向心运动任务中，要求受试者在整个关节活动范围内尽可能用力地通过小腿推动测力计轴，完成膝关节伸展动作。
  5. 在动态记录后留出4分钟休息时间。随后，在65°膝关节角度下，测量静态最大自主收缩力矩（MVC）共四次。每次静态测试中，要求受试者以相同坐姿位于测力计上，尽可能快速有力地踢向测力计的固定杆（固定于65°，不可移动）。
  6. 对于扭矩（力量）信号，使用连接至等速测力计的模数转换盒将模拟扭矩信号转换为数字信号。
    注意：转换器会自动将测力计的模拟信号转换为数字信号，随后自动导出至计算机以采集数据。
    1. 在计算机的软件分析程序中将采样频率设置为 5 kHz。将数字信号存储在计算机中，以便后续使用软件分析程序进行强度值分析。
  7. 在后续分析中，对每位受试者的离心、向心和静态测量，均采用四次试验中获得的最高值。在软件程序中，点击四次试验中的最高值，并记录计算机屏幕上显示的力量数值。
    1. 记录每位受试者在离心和向心收缩测试中测得的峰值扭矩最大值，以及四次静态测试中测得的最大力量值。
      注意：坐姿下使用等速测力计检测膝伸肌力量具有良好的可靠性和有效性16,17.
  8. 在静力性测试中，选取最大值，测量0-30 ms和0-200 ms期间的力（扭矩）发展速率（RFD）。以膝伸肌力量收缩起始点（时间：0 ms）的7.5 Nm水平设定为零值。18,19. 将光标（在肌肉力量分析软件程序中）移至 "7.5 Nm" 在 y 轴上取值以确定 0 ms 的位置。
    1. 在预测试评估中，将光标置于30毫秒处（即0毫秒之后的时间点），记录30毫秒时显示的扭矩（Nm）增加值。即， Nm 从 7.5 Nm 增加至 0 ms。对测试后数值执行相同的步骤。
    2. 计算在0-30 ms时间段内，后测Nm值（分子）相对于前测Nm值（分母）的百分比增长。因此，以前测到后测的变化表示RFD的百分比提升。对0-200 ms时间区间进行相同的分析。

5. 肌肉活检

注意：在测试第2天进行肌肉活检（参见引言和图1）。

  1. 使用骨锥从大腿肌vastus lateralis的中段取肌肉活检组织20。
    1. 活检前，在皮下及筋膜内注射1-2 mL局部麻醉剂。数分钟后，用小手术刀在皮肤和筋膜上做切口，位置约为从髌骨至髂前上棘距离的1/3处。使用骨锥取出约100-150 mg的肌肉组织。
  2. 将用于组织化学分析的样本置于液氮冷却至其冰点的异戊烷中快速冷冻，并在-80 °C下保存。保存30-50 mg的肌肉组织样本。
  3. 将用于蛋白质分析的样本在液氮中迅速冷冻后，于-80 °C保存。保存30-50 mg的肌肉组织样本。

6. 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）

注意：在第3次测试日进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）（参见引言和图1）。运动与OGTT之间的时间间隔必须超过48小时，且前后测试之间应保持相近。采用2小时口服OGTT，通过检测此期间内多次采集的血样是否显示正常或升高的血糖水平，以判断是否存在糖尿病或糖尿病前期状态。

  1. 在早晨进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），受试者需前一晚禁食，并且在测试当天及前一天未进行任何剧烈运动。
  2. 在摄入葡萄糖前15分钟及即刻，从仰卧位受试者肘前静脉通过静脉留置针采集血液样本（4 mL），随后在摄入葡萄糖后15、30、60、90和120分钟再次采血（葡萄糖剂量为75 g，溶于250 g/L溶液中）。
  3. 将血液样本在4 °C条件下以1,500 × g离心10分钟，分离血浆后于-20 °C保存以备后续分析。使用这些样本进行标准血糖水平检测（步骤7）。
  4. 针对葡萄糖、胰岛素和C肽，通过计算血糖浓度相对于基础水平的时间积分，求得曲线下面积（AUC）。根据以下公式，利用OGTT结果通过Matsuda方法21计算全身胰岛素敏感性：10 000*√[(Glucosebasal*Insulinbasal)*(Glucosemean*Insulinmean]。

7. 血液样本分析

  1. 使用自动分析仪测定静脉血浆中的葡萄糖浓度。将糖耐量受损水平设定为口服葡萄糖耐量试验（OGTT）2小时后血糖值 >7.8 mmol/L22。
  2. 使用ELISA试剂盒22对血浆中的胰岛素和C肽进行分析。使用酶标仪检测。将胰岛素和C肽的ELISA板分别在不同时间放入酶标仪中进行读数。
    注：酶标仪通过在特定吸光度下测定板上样本的光吸收值，来定量胰岛素和C肽的含量。血浆脂质TG、HDL、载脂蛋白A1和载脂蛋白B在中国瑞典斯德哥尔摩的卡罗林斯卡大学医院采用标准方法进行分析。

8. 肌肉样本分析

  1. 免疫印迹法
    1. 首先，将肌肉样品置于冻干机中，在低于10的压强下进行冷冻干燥-1 mbar 下处理 12 小时。在体视显微镜下使用针和镊子解剖，去除血液和结缔组织。于 -80 °C 保存。
      注意：合适的肌肉量为1至5 mg干重，但该方案可调整至少于1 mg，甚至适用于单根肌纤维。由于该RET参与者一次活检所获取的肌肉组织量过少，其数据未用于免疫印迹分析。
    2. 匀浆处理肌肉样品 使用微型珠磨机在冰上冷缓冲液（80 µL/mg）中进行处理，缓冲液成分为 2 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、5 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）、10 mM MgCl2，50 mM ß-甘油磷酸钠，1% Triton X-100，1 mM Na3VO4，2 mM 二硫苏糖醇，20 µg/mL 亮抑蛋白酶肽，50 µg/mL 抑肽酶，1% 磷酸酶抑制剂混合物，以及 40 µg/µL PMSF（苯甲基磺酰氟）。
      1. 将一勺0.5 mm的氧化锆珠放入每管肌肉样品中，加入缓冲液，在4 °C条件下以7-8档速度（此处最大档位为10）匀浆2次，每次1分钟。
    3. 将匀浆在10,000 x g离心10分钟。将上清液转移至新管中，弃去含有结构蛋白的沉淀。
    4. 使用市售试剂盒，通过酶标仪在660 nm波长下分光光度法测定上清液中的蛋白质浓度23.
      1. 随后将样品用2×Laemmli上样缓冲液和匀浆缓冲液（1:1）稀释，使最终蛋白质浓度为1.5 µg/µL。于95 °C加热5分钟以变性蛋白质。分析前将稀释后的样品储存在-20 °C。
    5. 对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），将每个样品中的30 µg蛋白质加入18孔预制梯度凝胶（4-20% 丙烯酰胺）中，在冰上以300 V电压电泳30分钟。
    6. 将凝胶在转移缓冲液（25 mM Tris 碱，192 mM 甘氨酸，10% 甲醇）中 4 °C 平衡 30 分钟。在 4 °C 条件下，以 300 mA 恒定电流将蛋白质转移至孔径为 0.2 µm 的聚偏二氟乙烯膜上，转移时间为 3 小时。
    7. 为确认上样量和转膜均一性，使用总蛋白染色对膜进行染色24针对每种目标蛋白，将每位受试者的所有样本加载至同一凝胶，并同时运行所有凝胶。
    8. 在含有5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（20 mM Tris碱，192 mM NaCl；TBS；pH 7.6）中，室温下封闭膜1小时。
    9. 在含有2.5%脱脂奶粉并添加0.1% Tween-20（TBS-TM）的TBS缓冲液中，将膜与一抗（参见材料列表）于4℃孵育过夜。
    10. 一抗孵育后，用 TBS-TM 洗涤膜（2 次 × 1 分钟 + 3 次 × 5 分钟），室温下加入与辣根过氧化物酶偶联的二抗（见材料列表）孵育 1 小时。再次用 TBS-TM 洗涤（2 次 × 1 分钟 + 3 次 × 10 分钟），随后再用 TBS 进行四次额外的 5 分钟洗涤。
    11. 将6-12 mL化学发光底物均匀覆盖于膜上，孵育5分钟。将膜置于两张透明塑料片之间。将膜放置于CCD相机前，并避光。使用化学发光相机滤光片进行连续曝光。
      1. 使用软件程序采集10次曝光，每次2分钟，或直至信号达到饱和。采用标准设置，包括用于采集化学发光的光学滤光片设置以及镜头设置。
    12. 使用不会导致饱和的最高曝光度，并标记条带的轮廓。将条带量化为强度 × 毫米2 使用相同的软件，从条带强度中减去背景噪声。将结果相对于总蛋白染色进行归一化，并以相对于基线的百分比变化形式表示。
  2. 组织化学
    注意：以下组织化学技术基于先前出版物中描述的方法25.
    1. 进行组织化学染色时，在 -20 °C 条件下使用冷冻切片机连续切取横截面（10 µm）。将切片贴附于存放在玻璃比色皿中的载玻片上，并在室温下自然晾干活检组织切片。
    2. 为ATP酶染色的预孵育准备pH 4.3、4.6和10.3的缓冲溶液26为了观察毛细血管，使用淀粉酶-PAS法对横切面进行染色27.
    3. 使用标记好的校准烧杯盛装校准液，校准pH计。按下相应按钮，从主菜单中选择pH值。
      1. 用去离子水冲洗探头，然后将探头放入第一个校准烧杯中。确保膜上无气泡。测量第一个校准溶液，随后提供下一个校准溶液（显示屏将提示下一个溶液）。
      2. 用去离子水冲洗探头，然后将其放入第二个校准烧杯中。确保膜内无气泡。测量第二种校准溶液后，继续进行下一种校准溶液的测量。
      3. 用去离子水冲洗探头，然后将其放入第三个校准烧杯中。确保膜内无气泡。测量第三种校准溶液。
        注意：当校准良好时，显示屏将短暂显示， "3rd 缓冲液 OK" 然后返回主菜单。
    4. 按以下方式使用缓冲液进行ATP酶染色。
      1. 要配制 pH 10.3 的溶液，需使用两种不同的溶液：（A）4.506 g 甘氨酸、4.8 g CaCl₂2，3.51 g NaCl，以及600 mL dH₂O2O 和 (B) 2.176 g NaOH 与 540 mL dH₂O2O. 将溶液储存于冷室或冰箱中，一个月内使用完毕。
      2. 为配制 pH 4.3 和 pH 4.6 的溶液，执行以下操作 "酸预孵育。" 使用 6.47 g 醋酸钠、3.7 g 氯化钾和 500 mL 去离子水配制预孵育用酸溶液2O。随后，配制1% CaCl2 溶液的配制：将 2.5 g 该物质溶解于 250 mL 的 dH₂O 中2O. 准备 2% CoCl2 将5 g溶于250 mL dH₂O中制备溶液2O.
      3. 如上所述储存和使用这些溶液。最后，通过混合800 µL的20% (NH₄)₂S溶液与7.2 mL去离子水制备0.2%的硫化铵溶液。4)2S 溶解于 40 mL 的 dH₂O 中2O. 后者需新鲜配制。
    5. 按照以下方法配制特定 pH 值的溶液。校准 pH 计后，从冰箱中取出比色皿、氯化钙和氯化钴溶液，待其恢复至室温后再进行染色。
      1. 对于 pH 10.3，向一个小的（约70 mL）玻璃烧杯中加入约25 mL溶液A。测量pH值。持续加入溶液B，直至pH达到所需的10.37。如果染色过深，可提高pH值；如果染色过浅，可降低pH值。
      2. 对于 pH 4.6，加入约25 mL的 "酸预孵育" 加入小玻璃烧杯中。测量pH值。使用5 M乙酸降低pH值. 如果染色图像过暗，可尝试通过提高pH值来增亮；如果过亮，则通过降低pH值来加深。若染色效果仍不理想，可尝试更换pH值，例如将pH 4.6改为pH 4.8。
      3. 对于 pH 4.3，操作同4.6，但加入更多乙酸。若染色过亮，则降低pH；若过暗导致纤维难以分辨，则提高pH。
      4. 按如下步骤配制ATP溶液。每比色皿（10 mL）称取0.017 g ATP，即3个比色皿共需0.051 g，4个比色皿共需0.068 g。量取pH为10.3的溶液30 mL（对应3个比色皿，每比色皿10 mL，使用量筒量取），倒入已称量好ATP的玻璃烧杯中。
        1. 充分混匀后测定pH值。使用浓盐酸调节pH，直至pH值恰好达到9.40。
      5. 在不同 pH 值条件下孵育的操作如下：将 pH 10.3 溶液加入一个比色皿中，于 37 °C 水浴孵育 9 分钟；将 pH 4.3 溶液加入另一个比色皿中，于室温孵育 5 分钟；将 pH 4.6 溶液加入最后一个比色皿中，于室温（RT）孵育 1 分钟。
      6. 按照首选的pH孵育步骤，进行如下操作：用dH₂O清洗15次2O. 加入ATP溶液（0.170 g ATP/100 mL H₂O）2O）加入活检样本中，在37 °C水浴中孵育30分钟，用dH₂O洗涤15次2O.
      7. 加入 CaCl₂2 溶液（1 g CaCl₂）2/100 mL H2O）加入比色皿中的活检样本中，在室温下孵育3分钟，用dH₂O洗涤15次2O. 加入 CoCl2 溶液（2 g CoCl₂）2/100 毫升 H2O）加入比色皿中的活检样本中，在室温下孵育3分钟，用dH₂O洗涤15次2O.
      8. 放入 (NH4)2S溶液处理30秒，然后在通风橱下快速洗涤15次。将活检组织切片贴附于载玻片上。为避免产生气泡，可轻轻挤压组织切片，但不可用力过猛。
    6. 选择一个无伪影且无纤维纵向切面的横截面区域，使用软件在光学显微镜下进行分析。
    7. 评估横截面积（CSA）、毛细血管以及纤维类型的分类即， 通过计算机图像分析，从每次活检中至少150-200根肌纤维的平均值来识别I型、IIA型或IIX型肌纤维。从肌肉纤维横切面的显微图像中，确保识别出三种类型的肌纤维（即， I型、IIA型和IIX型肌纤维呈现从白色到灰色再到黑色的不同深浅，具体取决于pH染色结果即， 4.34、4.65 和 10.37。
    8. 首先标记一些I型肌纤维。随后，程序将自动识别其余的I型肌纤维。请检查所有I型肌纤维是否均被正确标记。要标记特定纤维，请单击 "载体" 按钮。使用光标逐一测量每个选定的肌纤维面积。
    9. 在分析完I型纤维后，继续对IIA型和IIX型纤维进行相同的操作。每种肌纤维类型的平均值±标准误（SEM）即， 应根据RET组和CON组的纤维数量及其横截面积（CSA）计算I型、IIA型和IIX型纤维的比例。
      注：横截面积（CSA）、毛细血管及纤维类型分类（即， I型、IIA型和IIx型肌纤维）从每次活检平均163 ± 9根肌纤维中进行评估。

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结果

材料

在该研究中，纳入了21名相对健康的65至80岁女性和男性，其BMI值介于20至30 kg·m⁻²之间。-2 参与并被随机分为两组。两组个体的体力活动水平均相对较低（即， 中等日常体力活动水平且无规律性运动训练）。一组（n=12，6名女性和6名男性）在教练指导下进行抗阻运动训练（RET），每周3次，每次1小时，持续8周；另一组作为对照组（n=10，5名女性和5名男性）。RET组与CON组在年龄、性别和BMI方面具有可比性（表1为弥补脱落的受试者，向RET组招募了更多受试者；预计RET组的脱落人数将多于CON组。

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讨论

本研究采用多种技术，探讨短期渐进性抗阻训练对老年人群肌肉功能/形态、有氧能力及葡萄糖耐量的影响。主要发现表明，与对照组相比，实验组在肌肉有氧能力、葡萄糖耐量、力量、功率及肌肉质量（即参与细胞信号传导和肌纤维组成的蛋白质）等方面均出现显著改善。例如，静态、离心和向心性最大膝关节伸展力量提高了8-12%；训练负荷提升了19-72%；初始0-30 ms内的最大力发展速率（RFD）提高了52%；多种线粒体蛋白水平上升了30-90%；参与肌肉蛋白质合成的Akt和mTor蛋白水平均提高了69%。

老年人在进行此类项目时可能难以保持持续的健康状态。必须意识到，在未经训练的老年人中进行测试和训练时存在各种受伤风险。在训练期结束时，RET 组有一人旧有的背部问题复发。然而，在老年受试者中，训练项目期间发生的任何损伤或不适均未在研究结束后持续较长时间。有时可对训练的时间、训练量以及训练强度进行适当调整。对于力量训练方案，最好由教练记录每次训练课程中每位受试者在每项训练动作中所承受的负荷，以便在整个训练期间跟踪合理的渐进过程。在使用等速测力计进行力量测量时，必须避免测量过程中的任何误差...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢Andrée Nienkerk、Dennis Peyron和Sebastian Skjöld对培训课程及多次测试的监督；感谢参与研究的受试者；感谢Tim Crosfield对语言的修改；以及感谢瑞典体育与健康科学学院提供的经济支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蛋白质印迹
Pierce 660 nm 蛋白质检测试剂盒Thermo Scientific, Rockford, IL, USA22662
SuperSignal West Femto 高灵敏度底物 Thermo Scientific34096
Halt 蛋白酶抑制剂混合液（100x）Thermo Scientific78429
Restore PLUS 蛋白质印迹膜 stripping 缓冲液Thermo Scientific46430
Pierce PVDF 膜可逆蛋白染色试剂盒Thermo Scientific24585
10 st - 4–20% Criterion TGX 凝胶，18 孔，30 µLBio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA567-1094
Immun-Blot PVDF 膜 Bio-Rad162-0177
Precision Plus Protein 双色蛋白标准品 Bio-Rad161-0374
2x Laemmli 样品缓冲液Bio-Rad161-0737
10x Tris/甘氨酸Bio-Rad161-0771
2-巯基乙醇Bio-Rad161-0710
Tween 20Bio-RadP1379-250ML
Quantity One 版本 4.6.3 软件进行条带分析Bio-Rad
1% 磷酸酶抑制剂混合液Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA
抗体
mTOR（1:1,000）Cell Signaling, Danvers, Massachusetts, USA2983
Akt（1:1,000）Cell Signaling, Danvers9272
二抗：抗兔和抗小鼠 HRP 标记抗体（1:10,000）Cell Signaling, Danvers
柠檬酸合酶（CS）（1:1,000）Gene tex, San Antonio, California, USA
OXPHOS（1:1,000）Abcam, Cambridge, UK
设备——肌肉样本分析
Bullet Blender 1.5 匀浆仪Next Advance, New York, USA
酶标仪Tecan infinite F200 pro, Männedorf, Switzerland
组织化学
Mayer 苏木精染液HistoLab, Västra Frölunda, Sweden 1820
油红 OSigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA00625-25y
NaClSigma-Aldrich793566-2.5 kg
氯化钴Sigma-Aldrich60818-50G
淀粉酶Sigma-AldrichA6255-25MG
ATPSigma-AldrichA2383-5G
甘氨酸VWR-chemicals / VWR-international, Spånga, Sweden101196X
氯化钙VWR-chemicals / VWR-international22328.262
异戊烷VWR-chemicals / VWR-international24872.298
乙醇 96%VWR-chemicals / VWR-international20905.296
NaOHMERCK, Stockholm, Sweden1.06498.1000
乙酸钠MERCK1.06268.1000
KClMERCK1.04936.1000
硫酸铵MERCKU1507042828
乙酸 100%MERCK1.00063.2511
Schiff 试剂´MERCK1.09033.0500
高碘酸MERCK1.00524.0025
氯仿MERCK1.02445.1000
pH 计 LANGEHACH LANGE GMBH, Dusseldorf, Germany
光学显微镜Olympus BH-2, Olympus, Tokyo, Japan
冷冻切片机  Leica CM1950Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Leica 软件 Leica Qwin V3Leica Microsystems
Gel Doc 2000 - Bio-Rad，成像系统Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Sweden 
Quantift One 软件程序 - 4.6（版本 4.6.3；Bio Rad）Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Sweden 
口服葡萄糖耐量试验（OGTT）
葡萄糖 APL 75 gAPL, Stockholm, Sweden323,188
全自动分析仪 Biosen 5140EKF Diagnostics, Barleben, Germany
血浆胰岛素和 C 肽 ELISA 检测试剂盒Mercodia AB, Uppsala Sweden10-1132-01, 10-1134-01
酶标仪Tecan infinite F200 pro, Männedorf, Switzerland
其他设备
去脂体重测量仪FFM-Tanita T5896, Tanita, Tokyo, Japan
所有训练动作的力量训练设备Cybex International Inc., Medway, Massachusetts, USA 
功率自行车 Monark Ergometer 893E, Monark Exercises, Varberg, Sweden 
心率监测器 RS800, PolarPolar Electro OY, Kampele, Finland
Oxycin-Pro —— 自动运动肺量计设备Erich Jaeger GmbH, Hoechberg, Germany
等速肌力计，Isomed 2000，用于膝关节肌肉力量测试D&R Ferstl GmbH, Henau, Germany
CED 1401 数据采集系统及 Signal 软件Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK
肌肉力量分析软件，Spike 2，版本 7Signal Hound, LA Center, WA, USA
用于统计分析的 Statistica 软件Statistica, Stat soft. inc, Tulsa, Oklahoma, USA
肌肉活检设备
Weil Blakesley 活检钳Wisex, Mölndal, Sweden
局部麻醉 Carbocain, 20 mL, 20 mg/mL; Astra Zeneca, Södertälje, Sweden169,367
手术刀片Feather Safety Razor CO, LTD, Osaka, Japan 11048030

参考文献

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Akt mTOR
通过短期渐进性力量训练提高老年人的力量、功率、肌肉有氧能力和葡萄糖耐受性
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