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方法文章

CAPRRESI：通过质粒回收与限制性酶切位点插入实现嵌合体组装

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DOI：

10.3791/55526

⸱

2017年6月25日

 ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Oncomedic Incorporation, Ciudad de México, 3Laboratorio Internacional de Investigación sobre el Genoma Humano, Universidad Nacional Autónoma de México

本文内容

摘要

本文介绍了基于质粒回收和限制性酶切位点插入的嵌合体组装方法（CAPRRESI），该方案通过将限制性酶切位点插入同义DNA序列并实现功能性质粒的回收。该方法是一种快速且低成本的蛋白编码基因融合技术。

摘要

本文介绍了通过质粒回收和限制性酶切位点插入进行嵌合体组装的方法（CAPRRESI）。CAPRRESI 继承了原始质粒回收方法的诸多优点，并引入限制性酶切以简化DNA连接反应（嵌合体组装所必需）。在本实验方案中，用户将野生型基因克隆至同一质粒（pUC18 或 pUC19）中。在通过in silico方法选定需要组装嵌合体的氨基酸序列区域后，用户获取编码这些区域的所有同义DNA序列。Ad hoc Perl 脚本可帮助用户确定全部同义DNA序列。完成此步骤后，另一个Perl脚本将在所有同义DNA序列中搜索限制性酶切位点。该in silico分析同时也会针对pUC18/19质粒上的氨苄青霉素抗性基因（ampR）进行。用户在同义序列区域内设计寡核苷酸，通过PCR破坏野生型基因和ampR基因。获得并纯化互补DNA片段后，进行限制性酶切消化。通过连接适当的互补DNA片段实现嵌合体组装。选择pUC18/19载体用于CAPRRESI，因其具备多种技术优势，如小尺寸（2,686个碱基对）、高拷贝数、有利于测序反应的特性以及商业易得性。使用限制性酶进行嵌合体组装，避免了需要产生平末端产物的DNA聚合酶。CAPRRESI是一种快速且低成本的蛋白编码基因融合方法。

引言

嵌合基因组装在分子生物学中被广泛应用，用于阐明蛋白质功能和/或实现生物技术目的。目前存在多种基因融合方法，例如重叠PCR产物扩增1质粒回收2同源重组3CRISPR-Cas9 系统4定点重组5和吉布森组装6每种方法都有不同的技术优势；例如，重叠PCR设计具有灵活性， 体内 质粒回收过程中对构建体的筛选，或CRISPR-Cas9与Gibson组装系统的高效率。另一方面，实施这些方法时也可能遇到某些困难；例如，前两种方法依赖于平末端DNA片段，而与黏性末端连接相比，此类产物的连接在技术上更具挑战性。位点特异性重组可能在原始序列上留下额外的DNA序列痕迹（疤痕），如Cre-loxP 系统5CRISPR-Cas9 有时会在靶位点之外的其他基因组区域引起修饰4.

本文介绍了通过质粒回收和限制性酶切位点插入进行嵌合体组装的方法（CAPRRESI），该方案结合质粒回收法（PRM）与在同义DNA序列上插入限制性酶切位点，以融合编码蛋白的基因，从而提高连接效率。为确保氨基酸序列的完整性，限制性酶切位点被插入到同义DNA序列区域。CAPRRESI的优势包括可使用常规实验室试剂和工具（例如，酶、感受态细胞、溶液和PCR仪），并且在选用合适酶的情况下可快速获得结果。然而，依赖于同义DNA序列产生的限制性酶切位点可能会限制目标蛋白内部精确融合位点的选择。在此类情况下，应使用重叠寡核苷酸来融合目标基因，并将限制性酶切位点插入载体的抗性基因中。

CAPRRESI 包含七个简单步骤（图1）：1）选择克隆载体 pUC18 或 pUC196；2）对拟融合的野生型序列进行in silico分析；3）选择嵌合体组装和质粒断裂的切割区域；4）in silico生成包含限制性内切酶位点的同义DNA序列；5）将野生型基因独立克隆至所选质粒中；6）通过PCR实现质粒断裂，随后进行限制性内切酶消化；7）利用DNA连接和细菌转化实现质粒回收。通过该技术产生的嵌合基因应通过测序进行验证。

pUC18/19 载体在克隆和嵌合体构建方面具有技术优势，例如体积小（即， 2,686个碱基对），高拷贝数，具有优良的测序反应特性，且可商业获取7。在此，一种 大肠杆菌 宿主被用于组装和处理嵌合体，因为细菌培养物成本低廉且生长迅速。因此，需要将融合片段后续克隆至最终的目标质粒中。例如， 表达载体，如用于细菌的pRK415或用于哺乳动物细胞的pCMV。

CAPRRESI 被用于测试融合两个主要σ因子基因： E. coli rpoD 和 Rhizobium etli sigA. 主要σ因子是负责转录起始的RNA聚合酶亚基，由四个结构域组成（即， σ1、σ2、σ3 和 σ48蛋白质编码的氨基酸序列长度 rpoD 和 sigA 分别为613和685。RpoD与SigA具有48%的序列一致性（98%的覆盖度）。这些主要σ因子在σ2与σ3区域之间被分割为两个互补的片段。根据该设计构建了两个嵌合基因：嵌合体01（RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4）和嵌合体02（SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4）。DNA融合产物经测序验证。

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方案

1. CAPRRESI 方案

注意：图1 表示 CAPRRESI 整体实验流程。该技术基于in silico设计，随后构建目标嵌合体。

  1. 克隆质粒的选择，pUC18 或 pUC19。
    1. 选择最符合技术需求的pUC载体。
      注意：两种载体的序列相同，仅多克隆位点的方向不同。这一点对于寡核苷酸的设计以及质粒PCR破坏实验至关重要。
  2. 计算机模拟 野生型基因与pUC18/19序列的分析
    1. 获取野生型基因的DNA序列，并将其保存为FASTA格式文件（例如， 基因.fas
      注意：pUC18/19 载体的序列包含在 pUC.fas 文件中（图1，步骤1）。
    2. 确定哪些限制性内切酶不切割野生型基因和pUC18/19序列，可通过运行REsearch.pl脚本实现。或者，可使用在线工具进行限制性酶切位点搜索（图1，步骤 2）。
      1. 在终端中输入以下内容：
        perl REsearch.pl genes.fas
        perl REsearch.pl pUC.fas
        注意：这些命令将生成以下输出文件：genes_lin.fas、genes_re.fas、pUC_lin.fas 和 pUC_re.fas。
      2. 通过比较 genes_re.fas 和 pUC.fas 文件，选择合适的限制性内切酶，将野生型基因克隆至所选 pUC18/19 载体的多克隆位点中。根据插入片段相对于氨苄青霉素抗性基因的方向选择正确的插入方向ampRpUC18/19 载体的）
    3. 设计正向和反向寡核苷酸以扩增野生型基因的编码区（外部寡核苷酸）。在每条寡核苷酸的5'端包含适当的限制性内切酶位点，用于确定插入片段的方向。
      1. 在正向寡核苷酸中包含一个功能性的核糖体结合位点。
      2. 将两个野生型基因以相同方向插入载体中。
  3. 嵌合体组装与质粒断裂区域的选择
    1. 获取野生型及突变型的氨基酸序列 ampR 通过运行 translate.pl 脚本分析基因图1，步骤 3）。
      1. 在终端中输入以下内容：
        perl translate.pl genes.fas
        perl translate.pl ampR.fas
        注意：该脚本将生成以下输出文件：genes_aa.fas 和 ampR_aa.fas。
    2. 使用适当的软件对两条野生型氨基酸序列进行全局比对例如， MUSCLE9.
    3. 根据序列比对结果，选择嵌合体组装所需的断裂区域（3-6个氨基酸），并将这些区域保存为FASTA格式文件例如., regions.fas
    4. 定位在两种野生型基因上编码所选氨基酸片段的DNA序列。
  4. 计算机模拟 生成包含限制性内切酶位点的同义DNA序列。
    1. 获取所选作为断裂区域的每段氨基酸序列对应的所有同义DNA序列图1，步骤4）；这些序列已保存在 regions.fas 文件中。
      1. 在终端中输入以下内容：
        perl synonym.pl regions.fas
        注意：此脚本将生成 regions_syn.fas 输出文件。
    2. 在同义DNA序列中搜索限制性酶切位点。
      1. 在终端中输入以下内容： perl REsynonym.pl regions_syn.fas
        注意：该脚本将生成 regions_syn-re.fas 输出文件。
    3. 选择一种在两种野生型基因的同义序列中均存在的限制性内切酶；该酶切位点将用于通过限制性内切酶消化法构建嵌合体。验证所选限制性内切酶不会切割野生型基因序列或pUC18/19载体序列。
      1. 比较基因_genes_re.fas、pUC_re.fas和区域_regions_syn-re.fas文件中发现的限制性内切酶。
    4. 在计算机中 将同义DNA序列在野生型基因的相应位点上替换原始序列。将同义DNA序列添加至野生型序列文件（genes.fas）中。
    5. 获取基因文件 genes.fas 中所含基因的氨基酸序列perl translate.pl genes.fas).
    6. 将野生型和同义突变DNA序列翻译得到的氨基酸序列进行比对，验证两条序列是否一致。
    7. 重复本节的所有步骤 ampR 存在于pUC18/19载体上的基因。
      注意：目的是破坏 ampR 基因（文件 ampR.fas）分为两个互补部分。所选的限制性内切酶用于中断该 ampR 基因应不同于用于嵌合体构建的基因。
  5. 将两个野生型基因分别克隆到选定的pUC18/19载体中（图1，步骤3）。
    1. 使用质粒DNA纯化试剂盒纯化所选的pUC18/19质粒DNA。
      1. 例如，转化 E. coli 含有pUC18质粒的DH5α，于含0.3 mg/mL氨苄青霉素（Amp）的固体LB培养基上37 °C过夜培养转化子。挑取一个转化子菌落，接种至新的含0.3 mg/mL Amp的LB平板，37 °C过夜培养。
      2. 取部分前次培养物，于含0.3 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C振荡培养6–8 h。使用试剂盒提取质粒DNA。
    2. 使用适当的外部寡核苷酸，从总基因组DNA中PCR扩增野生型基因。尽可能使用高保真DNA聚合酶，并选择能够最大化扩增产量的DNA聚合酶。根据制造商的说明以及寡核苷酸的熔解温度进行PCR反应。
      1. 根据所使用的DNA聚合酶、扩增片段大小、模板和寡核苷酸的不同，设置相应的PCR循环程序。例如，扩增时 rpoD DNA，准备50 µL反应体系：10x缓冲液5 µL，50 mM MgSO₄ 2 µL4，1 µL 10 mM dNTP 混合液，2 µL 各10 µM 寡核苷酸（表2），2 µL 模板DNA（E. coli DH5α 总DNA）、35.8 µL 超纯水和 0.2 µL 高保真DNA聚合酶。进行以下PCR循环：94 °C 预变性1分钟，随后进行30个扩增循环（94 °C 变性30秒，60 °C 退火30秒，68 °C 延伸2分钟）。
      2. 将1.2 g琼脂糖溶于100 mL双蒸水中，通过微波炉加热溶解。组装凝胶托盘和梳子，并将其放入水平凝胶模具中。将熔化的琼脂糖溶液倒入凝胶托盘，静置使其凝固。移去梳子。
      3. 将凝胶放入电泳槽中，加入1×Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液至充满电泳槽。向凝胶孔中加入50 µL PCR产物。电泳样品（例如，于110 V电压下运行1小时。
      4. 电泳结束后，将凝胶置于含有100 µL 1 mg/mL溴化乙锭溶液的100 mL双蒸水中，缓慢振荡染色10分钟。随后在双蒸水中继续缓慢振荡洗涤10分钟；使用水平摇床。
        注意：溴化乙锭为有毒化合物，操作时需佩戴防护手套和棉质实验服。
      5. 使用试剂盒从凝胶中相应条带纯化野生型基因DNA。将染色后的凝胶置于紫外成像仪中（推荐波长：300 nm）观察条带。尽量减少凝胶的紫外暴露时间。采用DNA纯化试剂盒，并按照制造商说明书进行操作。
        注意：紫外线辐射具有危险性；请佩戴防护罩、护目镜和棉质实验服。
    3. 根据制造商说明书，使用限制性内切酶对纯化的野生型基因和 pUC18/19 质粒 DNA 进行酶切消化。尽可能使用快速消化酶。例如，在 10 µL 超纯水、2 µL 10X 缓冲液和 1 µL 限制性内切酶中加入 6 µL pUC18 DNA（300 ng/µL）进行消化 KpnI限制性内切酶，以及1 µL的 XbaI型限制性内切酶。37 °C 反应30分钟。
      1. 根据制造商的说明使限制性酶失活。例如，使双酶切反应失活 KpnI-Xba在 80 °C 下孵育 5 分钟。
    4. 将插入片段DNA与载体DNA按3:1的体积比混合。按照试剂盒说明书进行连接反应。尽量使用快速连接酶（在25 °C孵育10分钟）。
      注意：通常情况下，使用试剂盒纯化后的 DNA 浓度已足以用于消化和连接反应。例如，加入 6 µL 的 rpoD DNAKpnI-XbaI，150 ng/µL），3 µL pUC18 DNA（KpnI-XbaI，150 ng/µL），10 µL 2x 缓冲液，1 µL 超纯水和 1 µL T4 DNA 连接酶。将连接反应体系置于 25 °C 下孵育 10 分钟。
    5. 转化 E. coli 将连接反应产物 2-4 µL 加入 DH5α 感受态细胞中，具体操作参见补充材料。将转化后的细胞涂布于固体 LB/Amp/X-gal/IPTG 平板上，37 °C 培养过夜。
    6. 选择白色转化子 E. coli 菌落划线接种于新的LB/Amp平板上，37 °C过夜培养。
    7. 按照补充材料中所述方法进行菌落PCR，以筛选用于测序反应的候选克隆。提取候选克隆的质粒DNA。或者，使用与插入片段克隆时相同的限制性内切酶对候选质粒DNA进行酶切消化。
    8. 与测序服务提供商对接候选构建体的测序事宜10组装序列 计算机模拟 使用DNA组装器11(图1，步骤5）。
  6. PCR扩增后经限制性酶切进行质粒破坏。
    1. 设计 计算机模拟 野生型断裂区域的正向与反向寡核苷酸 ampR 基因，分别。替换 计算机模拟 其对应同义DNA序列的野生型片段（在步骤1.4中获得）。
      注意：该同义DNA序列包含一个限制性内切酶位点。正向与反向寡核苷酸在限制性内切酶位点处重叠。寡核苷酸长度应为21–27个核苷酸，以胞嘧啶或鸟嘌呤结尾，并包含一个限制性内切酶位点。正向寡核苷酸的序列与模板DNA上的目标区域序列相同。反向寡核苷酸则是模板DNA上目标区域的反向互补序列。
    2. 使用两种野生型基因构建体作为PCR反应的DNA模板（例如， pUC18rpoD 和 pUC18sigA）。获取每种构建的两个互补部分（pUC18rpoDσ1-σ2，pUC18rpoDσ3-σ4，pUC18sigAσ1-σ2 和 pUC18sigAσ3-σ4) (图1，步骤6）。
    3. 将DNA样品加入浓度为1-1.2%（w/v）的琼脂糖凝胶中，通过电泳分离PCR产物与DNA模板（例如， 110 V 电泳 1 小时）。或者，用 DpnI 用于断裂DNA模板。
      注意： DpnI 酶仅识别甲基化的 DNA 序列（5'-GATC-3'）。
      1. 使用DNA纯化试剂盒对样品进行纯化，遵循生产商提供的操作说明。
    4. 使用适当的限制性内切酶，根据制造商的说明对所有互补DNA片段进行双酶切消化。尽可能使用快速消化限制性内切酶。例如，用 AflII 和 光谱按照制造商的说明书操作。将消化反应在37 °C孵育15分钟。
    5. 根据制造商的说明使限制性内切酶失活。例如，失活 Afl第二部分光谱在 80 °C 下孵育 20 分钟。
  7. 使用DNA连接和细菌转化进行质粒回收
    1. 将适当的DNA片段按1:1的体积比混合，以构建目标嵌合基因（图1，步骤 7）。
      注意：通过这种方式，可保持 ampR 基因得以恢复，产生功能性蛋白质。
      1. 例如，混合4 µL的pUC18rpoDσ1-σ2 DNA（用消化） Afl第二部分光谱I，150 ng/µL），4 µL pUC18sigAσ3-σ4 DNAAfl第二部分SpeI，150 ng/µL），10 µL 2x 缓冲液，2 µL 超纯水和 1 µL T4 DNA 连接酶；经试剂盒纯化后的 DNA 浓度已足以用于消化及后续连接反应。将连接反应体系置于 25 °C 反应 10 分钟。
    2. 转化 E. coli 将3-5 µL的嵌合体组装连接反应液（见补充材料）加入DH5α中。将转化后的细胞接种于LB/Amp/X-gal/IPTG平板，37 °C过夜培养。
    3. 选择白色菌落的转化子 E. coli 菌落接种至新的LB/Amp平板上，37 °C过夜培养。
    4. 按照补充材料中所述，进行菌落PCR以筛选测序反应的候选克隆。通过电泳（步骤2.3.2.1中所述）在1-1.2%（w/v）琼脂糖凝胶中观察条带。
    5. 从阳性候选克隆中培养菌液，使用质粒DNA纯化试剂盒提取质粒DNA。

2. 测序候选嵌合构建体

  1. 按照测序服务提供商的指南，确保质粒DNA的质量满足测序反应的要求。使用DNA纯化试剂盒提取DNA。例如，在测序服务提供商的网页上，需特别注意其推荐的样品DNA浓度，并使用DNA定量仪器测定样品的浓度。
  2. 将候选的嵌合体构建体送至测序服务提供商进行测序10。
  3. 使用计算机辅助DNA组装工具（in silico DNA assembler）对测序读长进行拼接11。
  4. 利用序列比对工具将拼接后的序列与计算机设计（in silico-designed）的嵌合序列进行比对9,12，确认嵌合基因已成功融合。

3. 准备工作

注意：所有涉及活细胞的操作步骤均应在开启本生灯的洁净层流罩内进行。

  1. 生产 E. coli DH5α 感受态细胞
    1. 为了制备 大肠杆菌- 感受态细胞，请遵循已发表的实验方案13 或参见 补充材料或者，使用市售的感受态细胞。
  2. 转化 E. coli DH5α 感受态细胞
    1. 对于化学转化的 E. coli 培养物，请遵循已发表的实验方案13 或参见 补充材料或者，可采用电穿孔法进行细菌转化。若使用市售的感受态细胞，请遵循生产商提供的说明书。
  3. 纯化基因组DNA和质粒DNA E. coli DH5α
    1. 按照上述说明进行核酸提取 补充材料，使用市售试剂盒或遵循已发表的实验方案13.
  4. 进行菌落PCR。
    1. 使用该技术筛选出候选转化子菌落，用于后续测序反应。
      注意：该方法并不代表对序列完整性的最终验证。有关此技术的详细描述可参见 补充材料.
  5. 配制溶液。
    1. 参见 表1 有关溶液配制的更多信息。
  6. 下载 CAPRRESI 方案所需的脚本和序列文件。
    1. 下载包含目标物种完整基因组序列的基因库文件，利用基因组浏览器提取所选基因的DNA序列，并将其保存为fasta文件格式。下载CAPRRESI实验方案所需的Perl脚本。将脚本文件与序列文件存储在同一目录中。

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结果

图1展示了CAPRRESI方法。利用该方法，通过交换两种细菌主要σ因子（即大肠杆菌E. coli RpoD和R. etli SigA）的结构域，构建了两个嵌合基因。rpoD和sigA基因的DNA序列分别通过GenBank中的基因组文件NC_000913和NC_007761，使用Artemis基因组浏览器14获取。pUC18载体的DNA序列来自NCBI服务器的核苷酸数据库。通过运行REsearch.pl Perl脚本（见步骤1.2.2）对DNA序列进行限制性内切酶位点的in silico分析，结果用于引物设计（步骤1.2.3）。外部引物包含用于将野生型基因克隆至pUC18多克隆位点的XbaI和KpnI限制性酶切位点。正向引物还包含一个核糖体结合位点（表2）。从在LB/Nal培养基（37 °C，220–250 rpm）中培养的大肠杆菌

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讨论

CAPRRESI 被设计为 PRM2 的一种替代方法。原始的 PRM 是一种强大的技术，它允许在所选基因的任意区域实现 DNA 序列的融合。在 PRM 中，野生型基因需要被克隆到同一个质粒中。随后，在质粒上的野生型基因和抗生素抗性基因内部设计寡核苷酸。通过使用平末端、高保真 DNA 聚合酶以及预先设计的寡核苷酸进行 PCR，实现对质粒的断裂。互补的 PCR 产物通过连接形成嵌合基因，并恢复抗生素抗性盒，从而实现功能性质粒的回收。PRM 能够在同一质粒背景下构建嵌合基因文库。然而，平末端 DNA 序列的连接在技术上可能较为困难。通过重叠 PCR 片段组装嵌合体1 的方法也要求 DNA 聚合酶产生平末端产物，并且每次反应都需要进行 DNA 纯化。该技术组装的嵌合基因是线性 DNA 产物，将每个构建体克隆至目标载体中可能会延缓后续分析。

CAPRRESI 继承了 PRM 的诸多优势，并通过在同义 DNA 序列区域引入限制性酶切位点，简化了互补 DNA 片段的连接过程。因此，CAPRRESI 无...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）（资助号 154833）和墨西哥国立自治大学资助。作者谨此感谢 Víctor González、Rosa I. Santamaría、Patricia Bustos 和 Soledad Juárez 在行政与技术方面提供的建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高保真铂金 Taq DNA 聚合酶Thermo Fisher11304011产生平末端/3’-A 突出末端的 PCR 产物混合物
高纯度质粒提取试剂盒Roche11754785001用于所有质粒纯化反应
高纯度 PCR 产物纯化试剂盒Roche11732676001用于从琼脂糖凝胶中纯化所有 PCR 产物
AflII 限制性内切酶New England BiolabsR0520L识别序列 5’-CTTAAG-3’，在 37 °C 下切割
KpnI-HF 限制性内切酶New England BiolabsR3142L识别序列 5’-GGTACC-3’，在 37 °C 下切割
SpeI-HF 限制性内切酶New England BiolabsR3133L识别序列 5’-ACTAGT-3’，在 37 °C 下切割
XbaI 限制性内切酶New England BiolabsR0145L识别序列 5’-TCTAGA-3’，在 37 °C 下切割
氨苄青霉素钠盐Sigma AldrichA0166-5G抗生素
萘啶酸Sigma AldrichN8878-5G抗生素
酵母提取物Sigma AldrichY1625-1KG细菌细胞培养
酪蛋白胨Sigma Aldrich70171-500G细菌细胞培养
NaClSigma AldrichS9888-1KG氯化钠
琼脂Sigma Aldrich05040-1KG细菌细胞培养
XbaI 限制性内切酶Thermo FisherFD0684快速消化 XbaI 酶
KpnI 限制性内切酶Thermo FisherFD0524快速消化 KpnI 酶
快速连接试剂盒New England BiolabsM2200S快速 DNA 连接试剂盒
AflII 限制性内切酶Thermo FisherFD0834快速消化 AflII 酶
SpeI 限制性内切酶Thermo FisherFD1253快速消化 SpeI 酶

参考文献

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