CAPRRESI：通过质粒回收与限制性酶切位点插入实现嵌合体组装

摘要

本文介绍了基于质粒回收和限制性酶切位点插入的嵌合体组装方法（CAPRRESI），该方案通过将限制性酶切位点插入同义DNA序列并实现功能性质粒的回收。该方法是一种快速且低成本的蛋白编码基因融合技术。

摘要

本文介绍了通过质粒回收和限制性酶切位点插入进行嵌合体组装的方法（CAPRRESI）。CAPRRESI 继承了原始质粒回收方法的诸多优点，并引入限制性酶切以简化DNA连接反应（嵌合体组装所必需）。在本实验方案中，用户将野生型基因克隆至同一质粒（pUC18 或 pUC19）中。在通过in silico方法选定需要组装嵌合体的氨基酸序列区域后，用户获取编码这些区域的所有同义DNA序列。Ad hoc Perl 脚本可帮助用户确定全部同义DNA序列。完成此步骤后，另一个Perl脚本将在所有同义DNA序列中搜索限制性酶切位点。该in silico分析同时也会针对pUC18/19质粒上的氨苄青霉素抗性基因（ampR）进行。用户在同义序列区域内设计寡核苷酸，通过PCR破坏野生型基因和ampR基因。获得并纯化互补DNA片段后，进行限制性酶切消化。通过连接适当的互补DNA片段实现嵌合体组装。选择pUC18/19载体用于CAPRRESI，因其具备多种技术优势，如小尺寸（2,686个碱基对）、高拷贝数、有利于测序反应的特性以及商业易得性。使用限制性酶进行嵌合体组装，避免了需要产生平末端产物的DNA聚合酶。CAPRRESI是一种快速且低成本的蛋白编码基因融合方法。

引言

嵌合基因组装在分子生物学中被广泛应用，用于阐明蛋白质功能和/或实现生物技术目的。目前存在多种基因融合方法，例如重叠PCR产物扩增¹质粒回收²同源重组³CRISPR-Cas9 系统⁴定点重组⁵和吉布森组装⁶每种方法都有不同的技术优势；例如，重叠PCR设计具有灵活性， 体内 质粒回收过程中对构建体的筛选，或CRISPR-Cas9与Gibson组装系统的高效率。另一方面，实施这些方法时也可能遇到某些困难；例如，前两种方法依赖于平末端DNA片段，而与黏性末端连接相比，此类产物的连接在技术上更具挑战性。位点特异性重组可能在原始序列上留下额外的DNA序列痕迹（疤痕），如Cre-loxP 系统⁵CRISPR-Cas9 有时会在靶位点之外的其他基因组区域引起修饰⁴.

本文介绍了通过质粒回收和限制性酶切位点插入进行嵌合体组装的方法（CAPRRESI），该方案结合质粒回收法（PRM）与在同义DNA序列上插入限制性酶切位点，以融合编码蛋白的基因，从而提高连接效率。为确保氨基酸序列的完整....

方案

1. CAPRRESI 方案

注意：图1 表示 CAPRRESI 整体实验流程。该技术基于in silico设计，随后构建目标嵌合体。

1. 克隆质粒的选择，pUC18 或 pUC19。
   1. 选择最符合技术需求的pUC载体。
      注意：两种载体的序列相同，仅多克隆位点的方向不同。这一点对于寡核苷酸的设计以及质粒PCR破坏实验至关重要。
2. 计算机模拟 野生型基因与pUC18/19序列的分析
   1. 获取野生型基因的DNA序列，并将其保存为FASTA格式文件（例如， 基因.fas
      注意：pUC18/19 载体的序列包含在 pUC.fas 文件中（图1，步骤1）。
   2. 确定哪些限制性内切酶不切割野生型基因和pUC18/19序列，可通过运行REsearch.pl脚本实现。或者，可使用在线工具进行限制性酶切位点搜索（图1，步骤 2）。
      1. 在终端中输入以下内容：
         perl REsearch.pl genes.fas
         perl REsear....

结果

图1展示了CAPRRESI方法。利用该方法，通过交换两种细菌主要σ因子（即E. coli RpoD和R. etli SigA）的结构域，构建了两个嵌合基因。rpoD和sigA基因的DNA序列分别通过GenBank中的基因组文件NC_000913和NC_007761，使用Artemis基因组浏览器¹⁴获取。pUC18载体的DNA序列来自NCBI服务器的核苷酸数据库。通过运行REsearch.pl Perl脚本（见步骤1.2.2），对DNA序列进行限制性内切酶位点的in silico分析。这些结果用于引物设计（步骤1.2.3）。外部引物包含用于将野生型基因克隆至pUC18多克隆位点的XbaI和KpnI限制性内切酶识别位点。正向引物还包含一个核糖体结合位点（表2）。从在LB/Nal培养基（37 °C，220–250 rpm）中培养的.......

讨论

CAPRRESI 被设计为 PRM² 的一种替代方法。原始的 PRM 是一种强大的技术，它允许在所选基因的任意区域实现 DNA 序列的融合。在 PRM 中，野生型基因需要被克隆到同一个质粒中。随后，在质粒上的野生型基因和抗生素抗性基因内部设计寡核苷酸。通过使用平末端、高保真 DNA 聚合酶以及预先设计的寡核苷酸进行 PCR，实现对质粒的断裂。互补的 PCR 产物通过连接形成嵌合基因，并恢复抗生素抗性盒，从而实现功能性质粒的回收。PRM 能够在同一质粒背景下构建嵌合基因文库。然而，平末端 DNA 序列的连接在技术上可能较为困难。通过重叠 PCR 片段组装嵌合体¹ 的方法也要求 DNA 聚合酶产生平末端产物，并且每次反应都需要进行 DNA 纯化。该技术组装的嵌合基因是线性 DNA 产物，将每个构建体克隆至目标载体中可能会延缓后续分析。

CAPRRESI 继承了 PRM 的诸多优势，并通过在同义 DNA 序列区域引入限制性酶切位点，简化了互补 DNA 片段的连接过程。因此，CAPRRESI 无.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高保真铂金 Taq DNA 聚合酶	Thermo Fisher	11304011	产生平末端/3’-A 突出末端的 PCR 产物混合物
高纯度质粒提取试剂盒	Roche	11754785001	用于所有质粒纯化反应
高纯度 PCR 产物纯化试剂盒	Roche	11732676001	用于从琼脂糖凝胶中纯化所有 PCR 产物
AflII 限制性内切酶	New England Biolabs	R0520L	识别序列 5’-CTTAAG-3’，在 37 °C 下切割
KpnI-HF 限制性内切酶	New England Biolabs	R3142L	识别序列 5’-GGTACC-3’，在 37 °C 下切割
SpeI-HF 限制性内切酶	New England Biolabs	R3133L	识别序列 5’-ACTAGT-3’，在 37 °C 下切割
XbaI 限制性内切酶	New England Biolabs	R0145L	识别序列 5’-TCTAGA-3’，在 37 °C 下切割
氨苄青霉素钠盐	Sigma Aldrich	A0166-5G	抗生素
萘啶酸	Sigma Aldrich	N8878-5G	抗生素
酵母提取物	Sigma Aldrich	Y1625-1KG	细菌细胞培养
酪蛋白胨	Sigma Aldrich	70171-500G	细菌细胞培养
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG	氯化钠
琼脂	Sigma Aldrich	05040-1KG	细菌细胞培养
XbaI 限制性内切酶	Thermo Fisher	FD0684	快速消化 XbaI 酶
KpnI 限制性内切酶	Thermo Fisher	FD0524	快速消化 KpnI 酶
快速连接试剂盒	New England Biolabs	M2200S	快速 DNA 连接试剂盒
AflII 限制性内切酶	Thermo Fisher	FD0834	快速消化 AflII 酶
SpeI 限制性内切酶	Thermo Fisher	FD1253	快速消化 SpeI 酶