研究棉铃虫浓核病毒在寄主组织中的分布、传播方式及其对寄主适应性影响的实验方案

摘要

本文介绍了一种研究杆状病毒在鳞翅目物种棉铃虫体内宿主组织分布、传播方式及其对宿主适应性影响的实验方案。该方案也可用于研究其他经口传播病毒与其昆虫宿主之间的相互作用。

摘要

利用下一代测序技术已在动物宿主中发现许多新型病毒。此前，我们报道了一种互利性病毒， Helicoverpa armigera 棉铃虫（一种鳞翅目物种）中的浓核病毒（HaDV2） Helicoverpa armigera (Hubner). 在此，我们描述了目前用于研究HaDV2对其宿主影响的实验方案。首先，我们从一对亲本中建立一个无HaDV2的棉铃虫种群。随后，通过口服接种的方式，将含有HaDV2的过滤液体喂食部分新生幼虫后代，从而建立两个遗传背景相同的种群：一个感染HaDV2，另一个未感染。用于比较生命表参数的方案（例如， 还展示了感染与未感染HaDV2个体在幼虫期、蛹期、成虫期及繁殖力方面的差异，并提供了确定HaDV2在寄主组织中分布情况及其传播效率的实验方案。这些方案同样适用于研究其他经口传播病毒对昆虫寄主（尤其是鳞翅目昆虫寄主）的影响。

引言

在过去的几十年中，测序技术（如高通量测序，NGS）的发展促进了大量新DNA和RNA病毒的发现，其中包括许多非致病性病毒，以及先前已知病毒的新分离株^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}。在模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，利用宏基因组学技术已检测到超过20种新的部分病毒基因组¹³。此外，在其他昆虫中也鉴定出大量病毒序列，包括新病毒，例如蜜蜂、蚊子、亚洲柑橘木虱、蜻蜓以及多种鳞翅目昆虫^{14,15,16,17,18,19,20,21}。

未来，利用这些先进技术，预计将在昆虫中发现更多新病毒，因此我们对病毒与宿主相互作用的理解也可能随之改变^6,9。例如，病毒与宿主的相互关系被认为比以往认为的更为复杂，因为许多新发现的病毒正被定义为互利共生伙伴，而非严格的病原体²²。例如，蚜虫Dysaphis plantaginea中的互利性细小病毒DplDNV可诱导有翅型个体的形成，提高其移动能力，从而促进宿主及病毒自身的扩散²³。此外，互利性病毒还被报道参与哺乳动物健康调节、植物对干旱和低温的耐受性以及细菌感染的影响过程²⁴。塞内卡谷病毒-001（Seneca valley virus-001）可对具有神经内分泌癌特征的肿瘤细胞产生选择性细胞毒性²⁵。甲型肝炎病毒感染可抑制丙型肝炎病毒的复制，并可能促进丙型肝炎的康复²⁶。疱疹病毒的潜伏状态可赋予宿主对细菌感染的共生性保护作用²⁷。人类内源性逆转录病毒HERV-W的包膜糖蛋白可诱导细胞对脾坏死病毒产生抗性²⁸。来自真菌内生菌的弯孢热耐受病毒（Curvularia thermal tolerance virus, CThTV）参与了该真菌与一种热带雀麦草之间的互利共生关系²⁹。因此，了解新发现病毒与其宿主之间的相互作用，将为这些病毒的生物学特性及其管理策略提供全新的视角。然而，对于新病毒——尤其是那些不表现出急性感染典型症状的隐蔽性病毒——的研究仍十分有限，我们亟需建立一套系统化的流程和实验方案，以评估新发现病毒对其宿主的影响。

此前，我们已报道了一种新型单链细小病毒——棉铃虫浓核病毒（Helicoverpa armigera densovirus，HaDV2）在棉铃虫（Helicoverpa armigera）中的流行情况，并提供了证据表明HaDV2与棉铃虫之间存在互惠共生关系^30,31。本文将详细描述用于深入研究HaDV2与其宿主棉铃虫之间相互作用的实验室操作方案。本方案也可能对研究其他经口传播病毒（尤其是鳞翅目害虫中传播的病毒）的科研人员具有重要参考价值。

方案

1. 建立无HaDV2的棉铃虫种群

1. 棉铃虫幼虫H. armigera) 在人工饲料上³² 在25 ± 1 °C、14小时光照/10小时黑暗光周期、相对湿度60%的受控生长室或人工气候箱中培养。
2. 使用塑料笼（高10 cm，直径5 cm）对新羽化的蛾进行单对交配，每对一对，笼口覆盖纱布以保证良好通风，并作为产卵基质。为提高获得无病毒种群的可能性，应至少使用30对单对交配组合。成虫以10%蔗糖和2%维生素溶液饲喂。³² 用棉球浸润，每日补充。
3. 雌成虫在交配后约2天将卵产在棉纱布上，因此需每日更换纱布。将带有卵的纱布收集后，与成虫置于同一生长室（或人工气候箱）中培养，直至卵孵化。
4. 立即将新孵化的幼虫转移至新的24孔板中，每孔放置一只个体。
5. 在首次产卵日期后的第五天，收集亲代成虫并保存于液氮中。
   注意：在首次产卵日期后5天收集蛾类，可确保亲代在收集时仍然存活，从而避免使用死亡个体对DNA提取准确性造成的潜在影响。
6. 使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从这些样品中分离基因组DNA。
   1. 使用引物actin F/actin R扩增肌动蛋白基因的574 bp片段（actin F：5-CATCTACGAGGGTTACGC-3，actin R：5-CATCTGTTGGAAGGTGGA-3）。按照标准操作程序通过琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链式反应（PCR）产物；肌动蛋白基因的成功扩增表明DNA质量良好。
   2. 使用特异性引物 DVVPF（GGATTGGCCTGGGAAATGAC）和 DVVPR（CGTTGTTTTTATATCCGAGG）通过 PCR 检测亲代蛾类中 HaDV2 的存在³¹.
7. 一旦确定了无HaDV2感染的清洁配对，即由该单一对亲本繁殖后代至少五代，并将其维持为无HaDV2品系（NONINF-strain）；将感染HaDV2的品系定义为INF-strain。
8. 为确认 NONINF 品系中 HaDV2 的感染状态（并排除已知细菌或病毒对宿主发育的影响），需对 HaDV2 的感染状态进行评估， Wolbachia，以及 H. armigera 核多角体病毒（HaNPV）在8只随机选取的NONINF品系幼虫个体中的检测，采用PCR方法（特异性引物：DVVPF/DVVPR用于HaDV2，NPVF/NPVR用于HaNPV，81F/691R用于） Wolbachia^31,33).
   注意：已知某些病毒在感染宿主中可能处于潜伏状态，其水平即使使用基于PCR的技术也难以检测。NGS技术可用于确认基因组DNA样本中不存在病毒序列。

2. 含HaDV2液体的制备

注意：我们已证明，尝试纯化HaDV2病毒颗粒会抑制其感染性和活性³¹；因此，以下方案通过过滤感染HaDV2的个体样本，以获得具有感染性的HaDV2溶液。

1. 单独采集成年蛾，并立即置于液氮中保存。
2. 使用灭菌的研钵和研杵在液氮中将采集的单个蛾体彻底研磨。取约 10 µg 碎屑转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。将剩余碎屑转移至新管，并立即于 -80 °C 保存。
3. 按照试剂盒制造商提供的说明书，从 10 µg 碎屑中提取 DNA。一旦完成蛾类 DNA 的分离，即按照步骤 1.6 所述方法检测 HaDV2。
4. 根据步骤 2.3 获得的结果，依据感染状态将剩余碎屑分为两组：HaDV2 阳性和 HaDV2 阴性。向每个个体样品中加入 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na₂HPO₄，1.5 mM KH₂PO₄；pH 7.5），充分溶解剩余的幼虫碎屑。
5. 将匀浆液（来自步骤 2.4）在 4 °C 条件下以 6,500 × g 离心 15 分钟。使用 0.22 µm 滤膜过滤上清液。收集滤过液体（每管 200 µL），并立即于 -80 °C 保存。
   注意：0.22 µm 滤膜可去除大多数不期望的颗粒物、细菌和真菌。首先将离心机预冷至 4 °C。所有涉及滤后液体的操作均需在冰上进行，以防止匀浆液变褐和凝固。

3. 感染HaDV2的棉铃虫群体的建立

1. HaDV2的水平传播能力
   1. 建立HaDV2标准曲线。
      1. 使用从头设计的引物（PF: GGACAATGCTGGTGAGGC；PR: AATCCTCTTTGTCCGTTATCTATG），扩增包含定量引物（VPF: CTGGTGAGGCGATGGACATG；VPR: TGACAAGATCCAGCGTAGACATC）和探针（VP-probe: GCCACCACTAGAGGACCCACCAGATG）的片段，用于HaDV2病毒的定量。在PCR仪上使用以下程序：94 °C 30 s，53 °C 30 s，72 °C 60 s，共40个循环³¹。向25 µL PCR反应体系中加入1 µL含有HaDV2基因组的基因组DNA（步骤2.3）作为模板DNA。根据制造商说明书将扩增产物克隆至克隆载体中。
      2. 使用以下公式计算质粒拷贝数：拷贝数/µL = (N_A × C) / (n × M × 10⁹)，其中N_A为阿伏伽德罗常数（6.02 × 10²³ 分子/mol）；C为质粒的质量浓度（ng/µL），可通过微量分光光度法测定；n为包含PCR产物的重组质粒长度（5,195 bp）；M为双链DNA中单个碱基对的平均分子量（660 g/mol）。
      3. 在1.5 mL微量离心管中制备六种10倍系列稀释液，浓度分别为1.5 × 10⁹、1.5 × 10⁸、1.5 × 10⁷、1.5 × 10⁶、1.5 × 10⁵和1.5 × 10⁴ 拷贝数/µL。
      4. 使用特异性引物（VPF/VPR）和探针（VP-probe）进行实时定量聚合酶链式反应（qPCR），获得步骤3.1.1.3中所述质粒的循环阈值（CT）值。进行三次独立的技术重复实验，并取平均值用于后续计算。
      5. 根据上述结果，绘制HaDV2浓度经log2转换后与相应平均CT值之间的标准曲线。
   2. 定量检测滤过液体中的HaDV2。
      1. 取100 µL含HaDV2的滤过液体样本（步骤2.6）用于DNA提取。
      2. 使用实时qPCR测定滤过液体的CT值，并利用步骤3.1.1中的标准曲线计算拷贝数。
   3. 测定不同浓度HaDV2感染性滤过液体的口服感染效率。
      1. 将含HaDV2的液体稀释至以下浓度：10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴和0 拷贝数/µL。
      2. 在凝固前将人工饲料均匀铺于直径9 cm的培养皿中。在凝固的人工饲料表面均匀滴加各浓度含HaDV2的滤过液体（200 µL）。操作应在通风橱中进行。
      3. 将100头新孵化的幼虫转移至含HaDV2的人工饲料培养皿中。轻轻敲击棉纱布（含新孵化幼虫），使幼虫从纱布转移至一张白纸上。轻拍纸张，使幼虫吐丝并"飘散"离开纸面。使用灭菌镊子接触丝线，将幼虫转移至培养皿中。
      4. 48小时后，将人工饲料上的幼虫转移至24孔板中（每孔一只）。
      5. 将上述浓度接种HaDV2的幼虫饲养至成虫阶段。
      6. 收集成虫，提取DNA，并按照步骤1.5所述方法通过PCR检测HaDV2。
         注：此处使用10⁸ 拷贝数/µL浓度可获得100%的棉铃虫HaDV2感染率，从而建立HaDV2感染种群（INF品系）。
2. HaDV2的垂直传播能力
   1. 从NONINF和INF品系中选取成虫，组成单对交配组合：♀-/♂-、♀+/♂-、♀-/♂+ 和 ♀+/♂+（+：HaDV2感染阳性；-：HaDV2感染阴性）。
   2. 将上述交配组合的后代转移至无病毒的24孔板中，饲养幼虫至三龄期。
   3. 提取所收集的三龄幼虫DNA，作为模板，按照步骤1.5所述方法检测HaDV2的存在情况。

4. HaDV2的组织分布

1. 为防止病毒和细菌污染，将镊子和剪刀在75%乙醇中消毒三次，然后在酒精灯火焰上加热。
   注意：当发生污染时，必须对镊子进行消毒。
2. 使用分析天平称量用于储存组织的空管。
3. 将INF品系的幼虫和成虫置于冰上约5分钟。
4. 在含有PBS缓冲液的洁净培养皿中，于体视显微镜下解剖幼虫、成年雌性和成年雄性的以下组织。
   1. 对于幼虫，用移液器吸取血淋巴，并解剖前肠、中肠、后肠、脂肪体和马氏管（图1A）。立即将每种组织转移至液氮中的试管中。
      1. 用两枚昆虫针（直径200 µm，长度20 mm）将冷冻的幼虫固定在囊胚分离膜上，针插入头部附近和最后一腹节的节间膜处（图1A）。
      2. 剪开幼虫腹部后端的腹足，使血淋巴流出。在10秒内使用微量移液器吸取幼虫血淋巴，以防止血淋巴变褐和凝固。
         注意：可将苯硫脲（50 µg/mL）以1:20的体积比与血淋巴混合，以防止黑色素化。
      3. 使用剪刀从最后一节间膜至头部沿表皮做切口。使用两把镊子在体视显微镜下解剖所有剩余组织；各组织的示意图见图1A。
      4. 将三个个体的组织样本混合作为一次重复。
      5. 为防止解剖过程中血淋巴污染其他组织，用PBS缓冲液清洗解剖后的组织三次。然后检测用于清洗的PBS中的HaDV2感染状态。若最后一次清洗液中无HaDV2，则表明组织未被血淋巴污染。
   2. 对于成年雌性，在PBS缓冲液中使用体视显微镜解剖头部（脑）、肌肉、脂肪体、肠道、马氏管和卵巢（图1B）；对于成年雄性，在PBS缓冲液中使用体视显微镜解剖头部（脑）、肌肉、脂肪体、肠道、马氏管和睾丸（图1C）。立即将每种组织转移至液氮中的试管中。
      1. 使用镊子和剪刀去除成虫蛾的翅膀，并将剩余身体用PBS缓冲液清洗三次以清除鳞片。
      2. 使用剪刀分离头部、胸部和腹部。
      3. 去除胸部的内骨骼并收集肌肉。
      4. 使用镊子去除腹部的表皮，并参照图1B和图1C解剖其他组织。
      5. 将三个个体的组织样本混合作为一次重复。将解剖后的组织用PBS缓冲液清洗三次。
5. 当试管及上述组织完全冻结后，称量其总质量，并确保不同组织的质量基本相等。
   组织质量 = （试管/组织样本）质量 - （仅试管）质量
6. 从这些组织中提取DNA，并按照步骤3.1.2所述进行qPCR。
7. 利用步骤3.1.1中生成的标准曲线，计算每毫克组织中的拷贝数。使用单位质量病毒滴度校正因DNA提取所用组织量差异导致的样本偏差。
8. 按如下方式计算特定组织中HaDV2所占百分比：每种组织中HaDV2的百分比 = （待测组织每毫克HaDV2拷贝数）/（所有组织每毫克拷贝数之和）。

5. 检测HaDV2对宿主发育影响的生物测定

1. 将至少100只来自NONINF品系的蛹或新羽化的成虫放入一个5升、金属网结构、外覆棉纱布的笼子中。两天后，交配过的雌性成虫将开始在棉纱布上产卵。收集并保存附有卵的棉纱布；卵大约三天后孵化。
2. 用HaDV2接种初孵幼虫。
   1. 将NONINF品系的初孵幼虫转移至含HaDV2的人工饲料中（病毒拷贝数为10⁸ 拷贝/µL），以建立INF品系。
   2. 同样地，将初孵幼虫转移至覆盖无HaDV2滤液（步骤2.4）的人工饲料中，以建立对照组（NONINF品系）。每种处理至少包含240只幼虫（图2A）。
      注意：用于构建NONINF品系和INF品系的幼虫应来自同一亲代群体，并在同一时间孵化，以确保遗传背景一致。确保NONINF品系和INF品系均置于相同的气候培养箱中（25 ± 1 °C，14小时光照/10小时黑暗，相对湿度60%），以保证发育速率同步；发育速率可能因温度和湿度变化而不同。操作时应轻柔对待幼虫。
3. 48小时后，将幼虫单独转移至24孔板中（每孔一只）（图2B）。
   1. 依次为每孔中的幼虫编号，并每日记录其龄期和存活状态。
   2. 约5天后，当人工饲料发生降解时，将这些个体同时转移至含有新鲜人工饲料的新24孔板中（图2C）。
   3. 从孵化后第7天至第11天，使用分析天平称量幼虫体重，精确至0.0001 g。称重后，将每只幼虫单独放回24孔板中。
4. 在第四次蜕皮后进入五龄幼虫阶段（约孵化后十天），将幼虫转移至玻璃管中（高10 cm，直径2 cm）（图2D）；五龄幼虫也可通过头壳宽度识别（约2.6 mm）。
   注意：每天在相同时间将个体转移至玻璃管。
   1. 使用颜料或标记笔在玻璃管上标注每只幼虫的原始编号。每日记录幼虫状态；在玻璃管中，幼虫约五天后化蛹，蛹期持续约11天。
   2. 记录每只个体在玻璃管中的化蛹日期和羽化日期。记录3日龄蛹的质量。
5. 羽化后，将一只雌蛾和一只雄蛾放入一个单独的笼子中，并提供10%蔗糖溶液和2%维生素溶液（图2E）。每天补充蔗糖溶液。记录每只蛾的死亡日期。
6. 当雌蛾产卵时，每日更换棉纱布。立即统计卵的数量。在子代孵化时及时计数新孵化的幼虫。
7. 在生物测定过程中，每种处理随机选取八只个体以确认HaDV2的感染状态。按照制造商说明书，使用商用胰蛋白酶试剂提取这些样本的总RNA。按照说明书合成第一链cDNA，并以其为模板检测病毒是否成功转录。

结果

从不含HaDV2的亲本（图3A）获得的子代被培育为NONINF品系。我们使用相同的DNA模板成功扩增了actin基因，表明这些DNA模板质量良好（图3B）。此外，随机选取的8个子代个体均未检测到HaDV2（图3C）、HaNPV（图3D）和Wolbachia（图3E）。再次证实，所有检测样本的actin基因片段均成功扩增，说明子代DNA样品质量良好（图3F）。

根据起始材料质量的对数值与获得的CT值之间的关系，绘制了标准曲线，如图4所示。CT值与HaDV2初始基因拷贝数的对数值之间表现出强烈的线性相关性（R² > 0.99...

讨论

在过去的几十年中，关于昆虫与病毒相互作用的研究主要集中在蜜蜂健康^34,35,36、人类疾病传播媒介³⁷、植物病毒³⁸，以及一些具有重要生物防治潜力的昆虫病原病毒³⁹。相比之下，对昆虫中隐性病毒的关注较少，尤其是在鳞翅目害虫中。本文介绍了一种研究隐性病毒与其宿主昆虫之间相互作用的实验方案。在比较病毒感染个体与无病毒个体的生命表参数时，理想情况下应排除宿主遗传背景差异所带来的影响。为了研究病毒表型，以往许多研究通过比较同一群体中自然感染或未感染个体的生命表参数，或通过显微注射接种的个体进行分析，但这些方法耗时较长^23,40。本文所述的棉铃虫口服接种HaDV2的方法，为分析病毒表型提供了一种简便且有效...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	Corning	07-200-740	多家供应商可提供。
DNA提取试剂盒	TIANGEN	DP304-03	多家供应商可提供。
PCR仪	Veriti; Applied Biosystems	4375786
PBS	Corning	21-040-CV
0.22 µm膜过滤器	Millipore	SLGS025NB
pEASY-T克隆载体	TransGen, 北京, 中国	CT301-02
镊子	IDEAL-TEK	2.SA
Premix Ex Taq（探针法qPCR）	Takara	RR390A
探针	Invitrogen	定制订购
引物	Invitrogen	定制订购
微量分光光度计 NanoDrop 2000c	Thermo scientific	无
7500实时荧光定量PCR系统	Applied Biosystems	无
体视显微镜 SZX-16	Olympus	无
蔗糖			多家供应商可提供。
复合维生素			多家供应商可提供。