方法文章

研究棉铃虫浓核病毒在寄主组织中的分布、传播方式及其对寄主适应性影响的实验方案

DOI：

10.3791/55534

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2017年4月12日

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1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3Crop and Environment Sciences, Harper Adams University

本文内容

摘要

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本文介绍了一种研究杆状病毒在鳞翅目物种棉铃虫体内宿主组织分布、传播方式及其对宿主适应性影响的实验方案。该方案也可用于研究其他经口传播病毒与其昆虫宿主之间的相互作用。

摘要

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利用下一代测序技术已在动物宿主中发现许多新型病毒。此前，我们报道了一种互利性病毒， Helicoverpa armigera 棉铃虫（一种鳞翅目物种）中的浓核病毒（HaDV2） Helicoverpa armigera (Hubner). 在此，我们描述了目前用于研究HaDV2对其宿主影响的实验方案。首先，我们从一对亲本中建立一个无HaDV2的棉铃虫种群。随后，通过口服接种的方式，将含有HaDV2的过滤液体喂食部分新生幼虫后代，从而建立两个遗传背景相同的种群：一个感染HaDV2，另一个未感染。用于比较生命表参数的方案（例如， 还展示了感染与未感染HaDV2个体在幼虫期、蛹期、成虫期及繁殖力方面的差异，并提供了确定HaDV2在寄主组织中分布情况及其传播效率的实验方案。这些方案同样适用于研究其他经口传播病毒对昆虫寄主（尤其是鳞翅目昆虫寄主）的影响。

引言

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在过去的几十年中，测序技术（如高通量测序，NGS）的发展促进了大量新DNA和RNA病毒的发现，其中包括许多非致病性病毒，以及先前已知病毒的新分离株1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。在模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，利用宏基因组学技术已检测到超过20种新的部分病毒基因组13。此外，在其他昆虫中也鉴定出大量病毒序列，包括新病毒，例如蜜蜂、蚊子、亚洲柑橘木虱、蜻蜓以及多种鳞翅目昆虫

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方案

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1. 建立无HaDV2的棉铃虫种群

  1. 棉铃虫幼虫H. armigera) 在人工饲料上32 在25 ± 1 °C、14小时光照/10小时黑暗光周期、相对湿度60%的受控生长室或人工气候箱中培养。
  2. 使用塑料笼（高10 cm，直径5 cm）对新羽化的蛾进行单对交配，每对一对，笼口覆盖纱布以保证良好通风，并作为产卵基质。为提高获得无病毒种群的可能性，应至少使用30对单对交配组合。成虫以10%蔗糖和2%维生素溶液饲喂。32 用棉球浸润，每日补充。
  3. 雌成虫在交配后约2天将卵产在棉纱布上，因此需每日更换纱布。将带有卵的纱布收集后，与成虫置于同一生长室（或人工气候箱）中培养，直至卵孵化。
  4. 立即将新孵化的幼虫转移至新的24孔板中，每孔放置一只个体。
  5. 在首次产卵日期后的第五天，收集亲代成虫并保存于液氮中。
    注意：在首次产卵日期后5天收集蛾类，可确保亲代在收集时仍然存活，从而避免使用死亡个体对DNA提取准确性造成的潜在影响。
  6. 使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从这些样品中分离基因组DNA。
    1. 使用引物actin F/actin R扩增肌动蛋白基因的574 bp片段（actin F：5-CATCTACGAGGGTTACGC-3，actin R：5-CATCTGTTGGAAGGTGG....

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结果

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从不含HaDV2的亲本（图3A）获得的子代被培育为NONINF品系。我们使用相同的DNA模板成功扩增了actin基因，表明这些DNA模板质量良好（图3B）。此外，随机选取的8个子代个体均未检测到HaDV2（图3C）、HaNPV（图3D）和Wolbachia（图3E）。再次证实，所有检测样本的actin基因片段均成功扩增，说明子代DNA样品质量良好（图3F）。

根据起始材料质量的对数值与获得的CT值之间的关系，绘制了标准曲线，如图4所示。CT值与HaDV2初始基因拷贝数的对数值之间表现出强烈的线性相关性（R2 > 0.99.......

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讨论

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在过去的几十年中，关于昆虫与病毒相互作用的研究主要集中在蜜蜂健康34,35,36、人类疾病传播媒介37、植物病毒38，以及一些具有重要生物防治潜力的昆虫病原病毒39。相比之下，对昆虫中隐性病毒的关注较少，尤其是在鳞翅目害虫中。本文介绍了一种研究隐性病毒与其宿主昆虫之间相互作用的实验方案。在比较病毒感染个体与无病毒个体的生命表参数时，理想情况下应排除宿主遗传背景差异所带来的影响。为了研究病毒表型，以往许多研究通过比较同一群体中自然感染或未感染个体的生命表参数，或通过显微注射接种的个体进行分析，但这些方法耗时较长23,40。本文所述的棉铃虫口服接种HaDV2的方法，为分析病毒表型提供了一种简便且有效.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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本工作得到中国国家重点基础研究发展计划（编号：2013CB127602）和国家自然科学基金创新研究群体科学基金（编号：31321004）的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔板Corning07-200-740多家供应商可提供。
DNA提取试剂盒TIANGENDP304-03多家供应商可提供。
PCR仪Veriti; Applied Biosystems4375786
PBSCorning21-040-CV
0.22 µm膜过滤器MilliporeSLGS025NB
pEASY-T克隆载体TransGen, 北京, 中国CT301-02
镊子IDEAL-TEK2.SA
Premix Ex Taq（探针法qPCR）TakaraRR390A
探针Invitrogen定制订购
引物Invitrogen定制订购
微量分光光度计 NanoDrop 2000c Thermo scientific 无
7500实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems无
体视显微镜 SZX-16Olympus无
蔗糖多家供应商可提供。
复合维生素多家供应商可提供。

参考文献

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  1. Tang, P., Chiu, C. Metagenomics for the discovery of novel human viruses. Future Microbiol. 5, 177-189 (2010).
  2. Rosario, K., Breitbart, M. Exploring the viral world through metagenomics. Curr. Opin. Virol. 1, 289-297 (2011).
  3. Hugenholtz, P., Tyson, G. W.

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标签

PCR

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