本方案描述了 体外 利妥昔单抗两种关键功能特性——靶标结合与补体依赖性细胞毒性（CDC）诱导的比较。本方法用于参照利妥昔单抗与利妥昔单抗生物类似药之间的平行对比。这些检测方法可在生物类似药研发过程中使用，或作为其生产过程中的质量控制手段。
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本文内容
摘要
摘要
治疗性单克隆抗体（mAbs）在多种疾病的治疗中具有重要意义，包括癌症。制药企业开发生物类似药mAbs不仅是一种市场机遇，也是一种提高药物可及性并降低治疗相关成本的策略。本文详细描述了利妥昔单抗在Daudi细胞中靶点结合能力及补体依赖性细胞毒作用（CDC）诱导的评估方法。这两种功能依赖于抗体的不同结构区域，且与利妥昔单抗所诱导的临床效应密切相关。本方案可用于参照利妥昔单抗与已上市利妥昔单抗生物类似药的平行比较。所评估的产品在靶点结合能力和CDC诱导方面均表现出差异，提示其存在潜在的理化性质差异，并凸显了在临床环境中分析这些差异影响的必要性。本文所报告的方法具有简便、经济的特点 体外 用于评估利妥昔单抗生物类似药活性的模型。因此，这些模型在生物类似药的研发过程中以及生物类似药生产中的质量控制方面均具有应用价值。此外，所介绍的方法还可推广至其他治疗性单克隆抗体。
引言
治疗性抗体是为治疗多种病理状况（包括癌症、自身免疫性疾病和慢性疾病、神经系统疾病及其他疾病）而开发的重组单克隆抗体（mAbs）1。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准超过40种治疗性单克隆抗体上市，预计未来几年还将有更多产品获批进入市场。
利妥昔单抗是一种高亲和力的嵌合型单克隆IgG1抗体，已获批准用于治疗CD20+ B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）、CD20+ 滤泡性NHL、慢性淋巴细胞白血病以及类风湿关节炎2,3。利妥昔单抗通过识别在B细胞中过表达的CD20，可诱导细胞凋亡、补体激活以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）3。该药物的专利分别于2013年和2016年在欧洲和美国到期。因此，全球范围内的制药公司正在开发利妥昔单抗的生物类似物。与任何其他供人类使用的药物一样，生物类似物需获得监管机构的批准。国际指南指出，对于单克隆抗体，应通过比较新药与参照药品的理化特性、药代动力学、有效性和安全性来证明其生物相似性4。
因此，此类比较所采用的方法必须评估单克隆抗体（mAbs）的结构和功能特性，尤其是具有临床相关....
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方案
1. 通过流式细胞术评估靶标结合
- 生物材料与试剂的准备
- 配制500 mL RPMI培养基，添加10%热灭活胎牛血清（H-IFBS）。
- 使用RPMI培养基和75 cm2培养瓶培养Daudi Burkitt淋巴瘤（Daudi）细胞及Daudi GFP+细胞。在37 °C、5% CO2的湿化环境中维持培养，直至细胞密度达到6 - 9 × 105 个细胞/mL。
- 通过将H-IFBS以1:100比例稀释于PBS中，配制50 mL染色缓冲液；该缓冲液在2 - 8 °C下至少可稳定保存一个月。
- 制备参照单克隆抗体（mAb）和生物类似药mAb的测试溶液。从5 µg/mL起始，在染色缓冲液中进行1:2系列稀释，共十级，每级体积为500 µL。
- 使用染色缓冲液将人IgG（同型对照）稀释至5 µg/mL，并将PE-Cy5标记的小鼠抗人IgG（二抗）稀释至生产商推荐的浓度。
- 配制4%多聚甲醛PBS溶液（固定缓冲液）。
- 靶标结合
- 从75 cm2培养瓶中收集Daudi和Daudi GFP+细胞悬液，转移至15 mL离心管中，在400 ×....
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结果
采用上述方案，平行比较了参照药利妥昔单抗与一种在亚洲生产并 commercially available 的利妥昔单抗生物类似药的靶标结合能力及补体依赖性细胞毒作用（CDC）诱导活性。
在 Daudi 细胞中，两种单克隆抗体均以浓度依赖性方式结合 CD20（图 1D）。结合数据的非线性回归分析显示，参照利妥昔单抗和生物类似物利妥昔单抗的 r2 值分别为 0.978 和 0.848（图 1E）。浓度-反应曲线的统计分析表明，这些曲线及其所计算出的药效学参数在两种单抗之间存在显著差异（P < 0.0001）。生物类似物的最大反应值比参照产品低 2.16 倍。这些结果提示，两种被评估的单克隆抗体在结合白血病细胞膜上表达的 CD20 的能力方面存在差异。
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讨论
治疗性单克隆抗体（mAb）的专利到期正在推动生物类似药的开发。因此，亟需建立简便的方法来识别这些产品在临床相关活性方面的差异。本研究采用CD20+培养细胞来评估利妥昔单抗的两个关键功能特性：靶标结合和补体依赖性细胞毒作用（CDC）诱导。前者需要mAb的Fab区识别CD20，而后者主要依赖于mAb的Fc区与补体的相互作用9。因此，这些检测方法为关联单克隆抗体的结构与功能特性提供了有效途径。
治疗性单克隆抗体（mAbs）的靶标结合能力通常通过等温滴定 calorimetry（ITC）、表面等离子共振（SPR）或生物膜干涉技术10,11,12进行评估。这些检测方法可用于计算亲和力，但需要专用设备和专业培训。本文所述方案通过并行比较来评估靶标结合能力，即使在缺乏亲和力数据的情况下也能识别不同产品之间的差异。该方法操作简便，并采用与生物学.......
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披露
N. Salinas-Jazmín、E. González-González 和 S. M. Pérez-Tapia 是 UDIBI 的员工，该机构为多家制药公司开展生物类似药研究。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 培养基 | ATCC | 30-2001 | 根据细胞系的不同调整培养条件 |
| 台盼蓝溶液 | Sigma | T8154 | 0.4%，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养 |
| Daudi 伯基特淋巴瘤细胞 | ATCC | CCL-213 | 可根据目标抗体选择不同的细胞系 |
| 胎牛血清（FBS） | GIBCO | 16000-044 | 可根据细胞系的需求调整血清来源 |
| 正常人血清补体 | Quidel | A113 | 因此适用于生物相容性实验，包括药物开发、生物材料测试及其他应用 |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | 可使用多种荧光颜色选项，兼容大多数仪器配置以分析细胞活力 |
| PECy5 小鼠抗人 IgG | BDPharmigen | 551497 | 根据流式细胞仪的滤光片和激光器选择合适的荧光染料 |
| 人 IgG 同型对照 | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | 根据单克隆抗体（mAb）进行相应调整 |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | 流式细胞术固定缓冲液（1–4% 甲醛或多聚甲醛） |
| PBS pH 7.4 10x（磷酸盐缓冲液） | GIBCO | 70011-044 | 不含 Ca2+/Mg2+ 的磷酸盐缓冲液 [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4]，且无内毒素 |
| 96 孔 V 型底细胞培养板 | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm 圆底试管或 96 孔 V 型或 U 型底微量滴定板 |
| MabThera（利妥昔单抗） | Roche | — | 参比产品 |
| 利妥昔单抗 | Indian | — | 生物类似药产品 |
| 15 或 50 mL 锥形离心管 | Corning | 430290 或 430052 | — |
| 移液器吸头 | Eppendorf | — | 需要多种体积规格的吸头 |
| 移液器 | Eppendorf | — | 需要可调体积移液器 |
| Centrifuge 5430/5430R 型离心机 | Eppendorf | — | 带制冷功能的可变转速离心机（4 至 25 °C），转速范围为 10 至 30,130 × g |
| 流式细胞仪 | BD Dickinson | — | BD FACSAria III 或其他流式细胞仪 |
| 奥林巴斯光学显微镜和光学照明显微镜 | Olympus | — | 用于定量和评估细胞生长情况 |
| 培养箱 | SANYO | — | 用于细胞培养的温控和 CO2 控制培养箱 |
| 生物安全柜 | CHC BIOLUS | — | 用于保护研究人员、产品和环境的生物安全柜 |
参考文献
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a P....
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重印与许可
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