体外方法比较标的结合和CDC诱导治疗性抗体之间:应用在Biosimilarity分析

Summary

该协议描述了利妥昔单抗的两个关键功能特征的体外比较:靶结合和补体依赖性细胞毒性（CDC）诱导。该方法用于参考利妥昔单抗和利妥昔单抗生物仿制药之间的对侧比较。这些测定可以在生物仿制发展过程中使用或作为其生产中的质量控制。

Abstract

治疗性单克隆抗体（mAb）与治疗不同病理学，包括癌症有关。制药公司开发生物仿制药是一个市场机会，但也是增加药物可及性并减少治疗相关成本的策略。这里详述的方案描述了利多西他单抗在Daudi细胞中的靶标结合和CDC诱导的评估。这两个功能需要抗体的不同结构区域，并且与由利妥昔单抗引起的临床效果相关。协议允许参考利妥昔单抗和市售的利妥昔单抗生物仿制药的对侧比较。评估的产品显示靶结合和CDC诱导的差异，表明存在潜在的物理化学差异，并强调需要分析这些差异在临床环境中的影响。这里报道的方法在体外构成简单且便宜/ em>评估利妥昔单抗生物仿制药活性的模型。因此，它们在生物仿制发展过程中是有用的，也可用于生物仿制品的质量控制。此外，所提出的方法可以外推到其他治疗性mAbs。

Introduction

治疗性抗体是开发用于治疗不同病理学，包括癌症，自身免疫性和慢性疾病，神经系统疾病等的重组单克隆抗体（mAb）。目前，FDA批准了超过40种治疗性单克隆抗体，预计在接下来的几年内将有更多的药物进入市场。

利妥昔单抗是批准用于治疗CD20 ⁺ B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL），CD20 ⁺滤泡性NHL，慢性淋巴细胞白血病和类风湿性关节炎2,3的高亲和力嵌合单克隆IgG1抗体。由利妥昔单抗对B细胞过度表达的CD20的识别诱导细胞凋亡;补体激活;和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC） ³ 。该药物的专利于2013年和2016年在欧洲和美国期满， 分别。因此，制药公司全球正在开发的生物仿制药利妥昔单抗。与在其他任何药物用于人类消费，生物仿制药需要监管机构的批准。国际准则指出，对单克隆抗体，biosimilarity应通过比较理化性质，药代动力学，药效，以及新产品的参考⁴安全证明。

因此，在这样的比较所使用的方法必须评估mAb的结构和功能特征，特别是那些具有临床相关性。为此目的， 在体外测定法显示在体内实验几个优点（在Chapman 等人综述^）。5:1） 体外

Protocol

通过流式细胞术评价靶标结合

1. 制备生物材料和试剂
   1. 制备500mL补充有10％热灭活胎牛血清（H-IFBS）的RPMI培养基。
   2. 使用RPMI和75-cm ²培养瓶培养Daudi Burkitt's淋巴瘤（Daudi）细胞和Daudi GFP ⁺细胞。将培养物保持在37℃，5％CO ₂加湿气氛中，直到达到6 - 9×10 ^5个细胞/ mL。
   3. 通过在PBS中稀释1/100 H-IFBS制备50 mL染色缓冲液;该缓冲液在2-8℃下稳定至少一个月。
   4. 为参考和生物仿制mAb准备测试解决方案。在染色缓冲液中制备10个1:2系列稀释液（各500μL），从5μg/ mL开始。
   5. 使用染色缓冲液将人IgG（同种型对照）稀释至5μg/ mL和PE-Cy5小鼠抗人IgG（二抗）至con制造商建议的中心。
   6. 在PBS（固定缓冲液）中制备4％多聚甲醛。
2. 目标绑定
   1. 从75 cm ²培养瓶中收集Daudi和Daudi GFP ⁺细胞悬液，并将其转移到15 mL离心管中。以400 xg离心5分钟。
   2. 通过加入5毫升PBS洗涤细胞，并以400×g离心细胞悬浮液5分钟。....

Results

使用上面描述的协议中，靶结合和参考利妥昔单抗的CDC诱导与产生的生物仿制药利妥昔单抗的和可商购于亚并行进行比较。

在Daudi细胞，两种mAb浓度依赖的方式（ 图1D）结合CD20。结合数据的非线性回归显示的0.978和0.848的R ²为参考和利妥昔单抗生物仿制药，分别（ 图1E）。浓度 - 响应曲线的统计分析表明，它们，因此由它们计算的药效学参数，是单克隆抗体（P <0.0001）之间显著不同。用于生物仿制药的最大反应是比参考产品的2.16倍以下。这些结果表明，两种评价mAb具有不同的能力结合CD20的表达我白血病细胞的mbrane。

CDC诱导作用还比较两个单克隆抗体。参考和生物仿制药产品中的浓度依赖的方式（ 图2.......

Discussion

治疗性单克隆抗体的专利期限正在促进生物仿制药的开发。因此，需要简单的方法来识别这些产品的临床相关活动的差异。 CD20 ⁺培养细胞用于评估利妥昔单抗的两个关键功能特征:目标结合和CDC诱导。前一种活性需要通过mAb的Fab区域识别CD20，而后者主要取决于Fc区与其互补序列⁹的相互作用。因此，这些检测提供了一种链接mAbs的结构和功能特征的方法。

治疗性mAbs的目标结合通常通过等温滴定量热法（ITC），表面等离子体共振（SPR）或生物层干涉测量法评估^10,11,12 。这些测定允许af资金计算，但需要专门的设备和培训。这里描述的协议评估目标绑定在一个侧面比较，以识别产品之间的差异，即使没有亲和力数据。该方法简单，并采用相关的细胞环境进行活动评估。另一方面，可以通过ATP测量¹³ ，释放的乳酸脱氢酶（LDH） ¹⁴或alamarBlue

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 培养基	ATCC	30-2001	根据细胞系修改培养
台盼蓝溶液	Sigma	T8154	0.4%，液体，无菌过滤，适用于细胞培养
Daudi Burkitt 淋巴瘤细胞	ATCC	CCL-213	您可以根据感兴趣的抗体修改细胞系
胎牛血清 （FBS）	GIBCO	16000-044	您可以根据细胞系的要求修改血清来源
正常人血清补体	Quidel	A113	因此，它适用于生物相容性实验，包括药物开发、生物材料测试和其他应用
7AA-D	BDPharmigen	559925	您可以使用多种颜色选项，与大多数仪器配置兼容，用于分析活力。
PECy5 小鼠抗人 IgG	BDPharmigen	551497	根据流式细胞仪的滤光片和激光更换荧光染料
人 IgG 同种型对照	ThermoFisher Scientific	07-7102	根据 mAb 更换
BDCytofix	BDPharmigen	554655	流式细胞术固定缓冲液（1 - 4% 甲醛或多聚甲醛）
PBS pH 7.4 10x（磷酸盐缓冲液）盐水）	GIBCO	70011-044	磷酸盐缓冲液，不含 Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4、1.46 mM KH2PO4] 和无内毒素。
细胞培养板 96 孔，V 形底	Corning	29442-068	12 x 75 mm 圆底试管或 96 孔 V 形或 U 形底微量滴定板
MabThera （Rituximab）	Roche	—	参考产品
利妥昔单抗	印度	—	生物仿制药产品
15 mL 或 50 mL 锥形离心管	Corning	430290 或 430052	—
移液器吸头	Eppendorf	—	需要多个卷配置
移液器	Eppendorf	—	需要可调量程移液器
离心机 5430/ 5430R 型号	Eppendorf	—	冷冻变速离心机 （4 至 25 °C） 速度范围从 10 到 30,130 &g
流式细胞仪	BD Dickinson	—	BD FACSAria III 或其他流式细胞仪
奥林巴斯光学显微镜	Olympus	—	量化和评估细胞生长
孵化器	SANYO	—	培养箱用于培养细胞的温度和 CO2 控制
生物安全柜	CHC BIOLUS	—	用于保护研究人员、产品和环境的生物安全柜。