体外 比较治疗性抗体靶标结合与补体依赖性细胞毒作用诱导的方法：在生物相似性分析中的应用

摘要

本方案描述了 体外 利妥昔单抗两种关键功能特性——靶标结合与补体依赖性细胞毒性（CDC）诱导的比较。本方法用于参照利妥昔单抗与利妥昔单抗生物类似药之间的平行对比。这些检测方法可在生物类似药研发过程中使用，或作为其生产过程中的质量控制手段。

摘要

治疗性单克隆抗体（mAbs）在多种疾病的治疗中具有重要意义，包括癌症。制药企业开发生物类似药mAbs不仅是一种市场机遇，也是一种提高药物可及性并降低治疗相关成本的策略。本文详细描述了利妥昔单抗在Daudi细胞中靶点结合能力及补体依赖性细胞毒作用（CDC）诱导的评估方法。这两种功能依赖于抗体的不同结构区域，且与利妥昔单抗所诱导的临床效应密切相关。本方案可用于参照利妥昔单抗与已上市利妥昔单抗生物类似药的平行比较。所评估的产品在靶点结合能力和CDC诱导方面均表现出差异，提示其存在潜在的理化性质差异，并凸显了在临床环境中分析这些差异影响的必要性。本文所报告的方法具有简便、经济的特点 体外 用于评估利妥昔单抗生物类似药活性的模型。因此，这些模型在生物类似药的研发过程中以及生物类似药生产中的质量控制方面均具有应用价值。此外，所介绍的方法还可推广至其他治疗性单克隆抗体。

引言

治疗性抗体是为治疗多种病理状况（包括癌症、自身免疫性疾病和慢性疾病、神经系统疾病及其他疾病）而开发的重组单克隆抗体（mAbs）¹。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准超过40种治疗性单克隆抗体上市，预计未来几年还将有更多产品获批进入市场。

利妥昔单抗是一种高亲和力的嵌合型单克隆IgG1抗体，已获批准用于治疗CD20⁺ B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）、CD20⁺ 滤泡性NHL、慢性淋巴细胞白血病以及类风湿关节炎^2,3。利妥昔单抗通过识别在B细胞中过表达的CD20，可诱导细胞凋亡、补体激活以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）³。该药物的专利分别于2013年和2016年在欧洲和美国到期。因此，全球范围内的制药公司正在开发利妥昔单抗的生物类似物。与任何其他供人类使用的药物一样，生物类似物需获得监管机构的批准。国际指南指出，对于单克隆抗体，应通过比较新药与参照药品的理化特性、药代动力学、有效性和安全性来证明其生物相似性⁴。

因此，此类比较所采用的方法必须评估单克隆抗体（mAbs）的结构和功能特性，尤其是具有临床相关性的特性。为此，in vitro 实验相较于 in vivo 实验具有多项优势（Chapman et al. 综述）⁵：i）in vitro 研究对拟议的生物类似药与参比制品之间的差异更为敏感；ii）in vivo 研究必须在相关物种中进行，而对许多单克隆抗体而言，这些物种为非人灵长类动物；iii）由于参比制品的作用机制、临床前毒理学和临床效应已充分明确，生物类似药的 in vivo 研究可能无法提供额外有用的信息。因此，欧盟的生物类似药指南允许候选药物仅基于充分的 in vitro 数据进入临床试验⁶。

本文介绍了两种快速、经济且简便的检测方法，利用CD20⁺培养细胞来评估利妥昔单抗的生物学活性。这些检测方法可作为利妥昔单抗生物类似物候选药物可比性研究的一部分。

方案

1. 通过流式细胞术评估靶标结合

1. 生物材料与试剂的准备
   1. 配制500 mL RPMI培养基，添加10%热灭活胎牛血清（H-IFBS）。
   2. 使用RPMI培养基和75 cm²培养瓶培养Daudi Burkitt淋巴瘤（Daudi）细胞及Daudi GFP⁺细胞。在37 °C、5% CO₂的湿化环境中维持培养，直至细胞密度达到6 - 9 × 10⁵ 个细胞/mL。
   3. 通过将H-IFBS以1:100比例稀释于PBS中，配制50 mL染色缓冲液；该缓冲液在2 - 8 °C下至少可稳定保存一个月。
   4. 制备参照单克隆抗体（mAb）和生物类似药mAb的测试溶液。从5 µg/mL起始，在染色缓冲液中进行1:2系列稀释，共十级，每级体积为500 µL。
   5. 使用染色缓冲液将人IgG（同型对照）稀释至5 µg/mL，并将PE-Cy5标记的小鼠抗人IgG（二抗）稀释至生产商推荐的浓度。
   6. 配制4%多聚甲醛PBS溶液（固定缓冲液）。
2. 靶标结合
   1. 从75 cm²培养瓶中收集Daudi和Daudi GFP⁺细胞悬液，转移至15 mL离心管中，在400 × g条件下离心5分钟。
   2. 加入5 mL PBS重悬细胞，于400 × g离心5分钟，洗涤细胞一次。
   3. 用PBS重悬细胞，使用台盼蓝进行细胞计数和活力分析。选择细胞活力≥95%的培养物用于后续分析。
   4. 用预冷的染色缓冲液将细胞悬液稀释至4 × 10⁶ 个细胞/mL。
   5. 在1.5 mL微量离心管中，向100 µL不同浓度的参照或生物类似药mAb测试溶液中加入50 µL细胞悬液。每种实验条件设置重复管。
   6. 额外准备同型对照管（使用人IgG1替代利妥昔单抗）和阴性对照管（仅加二抗，不加一抗）。
   7. 在4 °C孵育20 - 30分钟。
   8. 加入1 mL PBS洗涤细胞，于10 °C、400 × g离心5分钟，弃去上清液。
   9. 将细胞重悬于100 µL二抗溶液中，于4 °C避光孵育20 - 30分钟。
   10. 用PBS洗涤细胞两次，最后重悬于200 µL固定缓冲液中。
   11. 在流式细胞仪上进行细胞分析。
       注：若样品在4 °C避光保存，信号可稳定维持数天。
3. 数据采集
   1. 在流式细胞仪操作软件的工作表中打开两个散点图。第一个图设置为FSC-A versus FSC-H，第二个图设置为FSC-A versus SSA-A。同时打开PE-Cy5通道的直方图。
   2. 在FSC-A versus FSC-H图中设置门控（R1），选择单细胞事件（图1A）。
   3. 将R1群体投射至FSC-A versus SSA-A散点图，并在此图中设置新的门控（R2），选择目标细胞（图1B）。将R2群体投射至PE-Cy5强度直方图，以观察细胞的频率分布。
   4. 利用阴性对照和同型对照设定PE-Cy5通道的最低荧光强度（FI）阈值（图1C）。
   5. 从参照品最高浓度样本中采集R2内10,000个事件。该样本的FI应为预期最高值（图1C）。
   6. 依次采集其余样本的数据。
   7. 对每个样本，获取PE-Cy5通道的中位荧光强度（MFI）。
   8. 对于含参照或生物类似药mAb的样本，计算其MFI与同型对照MFI之间的差值（ΔMFI）。

2. CDC 活性评估

1. 生物材料与试剂的准备
   1. 配制细胞培养基并培养道迪细胞和道迪GFP细胞⁺ 细胞，如上所述（步骤 1.1.1 - 1.1.2）。
      注意：此外，CDC 实验需要无血清的 RPMI。
   2. 用无血清 RPMI 培养基将正常人血清补体（NHSC）按 1:2 比例稀释，制备 2.5 mL。
   3. 将正常人血清（NHSC）用RPMI培养基按1:2比例稀释，制备1 mL溶液，56 °C水浴30分钟以灭活。
   4. 在无血清RPMI培养基中配制参考单克隆抗体和生物类似物单克隆抗体的系列测试溶液，从1 µg/mL至0.025 µg/mL共进行10个稀释度，每个稀释度200 µL。
2. CDC实验
   1. 收集 Daudi 和 Daudi GFP⁺ 从培养物中收集细胞并测定细胞活力（见步骤 1.2.1 - 1.2.3）。
   2. 制备细胞悬液，浓度为 4 x 10⁵ 细胞/mL，无血清RPMI
   3. 将50 µL细胞悬液加入96孔圆锥形（V型底）微量培养板中含各参考品或生物类似药单克隆抗体测试浓度的50 µL溶液中。每种实验条件均需设置重复孔。
   4. 为阴性对照准备额外的孔即， 无单克隆抗体）、基础死亡对照（即， 热灭活的NHSC在mAb存在下的染色阳性对照（即， 细胞暴露于50 µL 70% EtOH中。
   5. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞20 - 30分钟₂ 湿润的环境
   6. 向每个孔中加入50 µL NHSC（按1:2稀释），将调理过的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2.5小时₂ 湿润的环境。在基础死亡对照孔中使用热灭活的NHSC。
   7. 在 10 °C 条件下，以 400 x g 离心 5 分钟。弃去上清液。
   8. 加入150 µL PBS洗涤细胞，将细胞悬液在400 x g、10 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
   9. 用7-氨基放线菌素（7-AAD）对样本进行染色，方法如前所述^7,8.
   10. 同一天在流式细胞仪上分析细胞。
3. 数据采集
   1. 在流式细胞仪操作软件的工作表中打开两个点图，将这些点图设置为步骤1.3.1 - 1.3.3中的参数图2A-B). 创建第三个图，对R2群体绘制GFP与7-AAD的点图。
   2. 使用Daudi细胞和Daudi GFP确定适当的荧光强度（FI）阈值⁺ 细胞，以及死亡阳性对照（图 2C).
   3. 对于每个样本，测量 7-AAD 阳性细胞的百分比⁺ 靶细胞。从R2中至少采集5,000个事件。
   4. 通过减去7-AAD阳性细胞百分比来计算特异性单克隆抗体诱导的细胞毒性⁺ 在不同浓度单克隆抗体样本中，从所测得的百分比中减去基础死亡对照值图2D).

3. 生物相似性分析

1. 将浓度和响应值输入绘图软件。
2. 生成图表并计算非线性回归，需考虑以下因素：i) 使用单克隆抗体浓度的对数转换作为"X"；ii) 使用可变斜率数学模型（Y = 最小响应值 + (最大响应值 - 最小响应值) / 1+10^((LogEC₅₀-X)*Hill斜率)）；iii) 将底部参数约束为零，因为基础响应已被扣除。
   注意：预期曲线呈对称的S形。
3. 使用F检验将两种非线性拟合结果与全局拟合进行比较（许多绘图软件包含此功能）。
   注意：此类检验的零假设为两个数据集的最大响应值、LogEC₅₀和Hill斜率相同，这与拟解决的生物学问题一致。

结果

采用上述方案，平行比较了参照利妥昔单抗与一种在亚洲生产并商业化的利妥昔单抗生物类似药的靶标结合能力及补体依赖性细胞毒作用（CDC）诱导活性。

在Daudi细胞中，两种单克隆抗体均以浓度依赖性方式结合CD20（图1D）。结合数据的非线性回归分析显示，参照利妥昔单抗和生物类似利妥昔单抗的r²值分别为0.978和0.848（图1E）。浓度-反应曲线的统计学分析表明，两条曲线之间存在显著差异，因此由其计算得到的药效学参数在两种单克隆抗体之间也存在显著差异（P < 0.0001）。生物类似物的最大反应值比参照产品低2.16倍。这些结果提示，所评估的两种单克隆抗体在结合白血病细胞膜表面表达的CD20能力方面存在差异。

还比较了两种单克隆抗体对CDC的...

讨论

治疗性单克隆抗体（mAb）的专利到期正在推动生物类似药的开发。因此，亟需建立简便的方法来识别这些产品在临床相关活性方面的差异。本研究采用CD20⁺培养细胞来评估利妥昔单抗的两个关键功能特性：靶标结合和补体依赖性细胞毒作用（CDC）诱导。前者需要mAb的Fab区识别CD20，而后者主要依赖于mAb的Fc区与补体的相互作用⁹。因此，这些检测方法为关联单克隆抗体的结构与功能特性提供了有效途径。

治疗性单克隆抗体（mAbs）的靶标结合能力通常通过等温滴定 calorimetry（ITC）、表面等离子共振（SPR）或生物膜干涉技术^10,11,12进行评估。这些检测方法可用于计算亲和力，但需要专用设备和专业培训。本文所述方案通过并行比较来评估靶标结合能力，即使在缺乏亲和力数据的情况下也能识别不同产品之间的差异。该方法操作简便，并采用与生物学...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI-1640 培养基	ATCC	30-2001	根据细胞系的不同调整培养条件
台盼蓝溶液	Sigma	T8154	0.4%，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养
Daudi 伯基特淋巴瘤细胞	ATCC	CCL-213	可根据目标抗体选择不同的细胞系
胎牛血清（FBS）	GIBCO	16000-044	可根据细胞系的需求调整血清来源
正常人血清补体	Quidel	A113	因此适用于生物相容性实验，包括药物开发、生物材料测试及其他应用
7AA-D	BDPharmigen	559925	可使用多种荧光颜色选项，兼容大多数仪器配置以分析细胞活力
PECy5 小鼠抗人 IgG	BDPharmigen	551497	根据流式细胞仪的滤光片和激光器选择合适的荧光染料
人 IgG 同型对照	ThermoFisher Scientific	07-7102	根据单克隆抗体（mAb）进行相应调整
BDCytofix	BDPharmigen	554655	流式细胞术固定缓冲液（1–4% 甲醛或多聚甲醛）
PBS pH 7.4 10x（磷酸盐缓冲液）	GIBCO	70011-044	不含 Ca2+/Mg2+ 的磷酸盐缓冲液 [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4]，且无内毒素
96 孔 V 型底细胞培养板	Corning	29442-068	12 x 75 mm 圆底试管或 96 孔 V 型或 U 型底微量滴定板
MabThera（利妥昔单抗）	Roche	—	参比产品
利妥昔单抗	Indian	—	生物类似药产品
15 或 50 mL 锥形离心管	Corning	430290 或 430052	—
移液器吸头	Eppendorf	—	需要多种体积规格的吸头
移液器	Eppendorf	—	需要可调体积移液器
Centrifuge 5430/5430R 型离心机	Eppendorf	—	带制冷功能的可变转速离心机（4 至 25 °C），转速范围为 10 至 30,130 × g
流式细胞仪	BD Dickinson	—	BD FACSAria III 或其他流式细胞仪
奥林巴斯光学显微镜和光学照明显微镜	Olympus	—	用于定量和评估细胞生长情况
培养箱	SANYO	—	用于细胞培养的温控和 CO2 控制培养箱
生物安全柜	CHC BIOLUS	—	用于保护研究人员、产品和环境的生物安全柜