三维球体制作一个高效，灵活细胞聚集方法

Summary

在这里，我们描述了一种通过细胞聚集形成 3D 细胞球体的快速灵活的方案。这很容易适应多种细胞类型，适用于各种应用，包括细胞迁移、侵袭或失巢凋亡检测，以及用于细胞-基质相互作用的成像和定量。

Abstract

单层细胞培养不充分模拟组织的体内行为，这涉及复杂的细胞-细胞和细胞-基质相互作用。三维（3D）细胞培养技术是最近开发用于解决贴壁细胞培养的缺点一个创新。而在体外产生组织类似物几种技术已经开发，这些方法往往是复杂，以建立价格昂贵，需要专门的设备，并且通常由兼容性只有某些细胞类型的限制。在这里，我们描述了用于凝集细胞成一致的大小是与多种肿瘤和正常细胞系的生长兼容的多细胞三维球状体一个快速和灵活的协议。我们利用不同浓度的血清和甲基纤维素（MC），以促进依赖贴壁球体的产生和防止在一个高度可再生的方式的细胞单层的形成。逐张为最佳条件idual细胞系可以通过在球体形成介质调整MC或血清浓度来实现。生成的3D球体可被收集用于在广泛的应用范围，包括细胞信号传导或基因表达研究中，候选药物筛选，或在细胞过程如肿瘤细胞侵袭和迁移的研究中使用。该协议也容易地适用于产生从单个细胞克隆的球状体，并可以适于评估贴壁依赖性生长和失巢凋亡抗性。总的来说，我们的协议提供了用于产生和利用为了概括组织的微环境的3D模型和正常和肿瘤细胞的体内生长三维细胞球状体的容易修改的方法。

Introduction

的肿瘤细胞的行为生物相关的评估是使用传统的二维（2D）细胞培养的方法，部分是因为这些不充分地反映在体内发现的细胞微环境挑战。结合细胞外基质成分进入文化（ 如 Boyden小室测定）的替代方法是体内组织的环境更生理代表。然而，它们可被限定在单个细胞行为的评估，并且不概括在有助于组织或肿瘤生长^1，2，3细胞-基质和细胞-细胞相互作用的体内组合的复合物。

使用多细胞球体是最近的做法更准确地再现体内细胞生长¹的结构紧凑^，4。球状体可以用于研究正常细胞的细胞-基质相互作用，而且还可以作为肿瘤类似物肿瘤进展的特征，如转移性生长或药物抗性⁴建模。

球状体可以通过嵌入在基体^5，或更快速的单细胞的增殖而形成，通过促进多种细胞的聚集，以形成一单细胞群（ 例如 ，悬滴，离心方法^<....

Protocol

注:所有试剂和耗材均列在材料清单 。

1.球体由生产细胞聚集

1. 甲基纤维素溶液:准备100毫升100毫克/毫升甲基纤维素。
   1. 热火50毫升超纯H ₂ O操作80℃。加入10克甲基纤维素粉末和搅动，直到颗粒被均匀地分散。
   2. 带给用冷超纯_的 H _2ö终体积，并在4℃下搅拌，直到溶液变得清晰，稻草色，并且不包含可见固体。
   3. 通过0.45微米的过滤器通过除去未溶解的固体。制备的溶液可以被等分并储存于4℃多达12个月。
      注:甲基纤维素用作无细胞毒性的，惰性的，悬浮剂以增强细胞 - 细胞粘附和阻止粘附细胞单层的形成。甲基纤维素是可溶于水，并且可以被洗去以下spherOID生成。
2. 球状体形成中
   注意:使用前，立即准备球体形成网上平台。不要储存。
   1. 稀甲基纤维素溶液至1-5毫克/毫升在适当的培养基中。
   2. 通过0.22微米的过滤器传送到消毒和去除未溶解的固体。
3. Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）
   1. 稀释至1x和使用之前，将通过一个0.45微米的过滤器。制备的溶液可以无限期地在室温....

Results

我们描述一个灵活，高效的方法来生成利用细胞排斥板和补充MC球体形成媒体离散球体。下MC和血清的适当的条件下，各个细胞沉降并在井的中心粘附在一起以形成具有最小粘附到孔底部的球体。使用该协议，是从多种细胞系中（ 图2B）产生球体。 MC和血清浓度的滴定所需的每个细胞系，以确定在形成仅单个球体即足够强大，以允许操纵未经分段的最佳条件。最佳地，所述球状体的直径为200至500微米之间，并且包括紧密粘附细胞以最小的细胞碎片。球状体存活柔和处理而不会损坏，允许它们被收集并在各种试验中使用。

图3A），这导致在死细胞中的聚集受到损害。在的灰尘或其它纤维污染，多个或只弱凝集形成的不规则形状的细胞团，并将所得的球状体的存在下处理时容易解体。球体的形成也受到的MC次优浓度或血清中的球体形成培养基（ 图3B）。在我们的测试中，许多细胞系能够坚持细胞斥板在不存在，或在低浓度，MC的，并导致在由细胞单层（ 图3B.......

Discussion

我们提出了生产3D细胞球体使用廉价的和广泛使用的试剂在体内组织的架构模型快速，灵活的方法。我们的协议利用MC ^8,9的非细胞毒性和粘合促进性质介导的细胞聚集和降低细胞单层的形成。不像从动物来源分离的基于蛋白质的基质，MC是惰性的，不包含生长因子，并且很容易通过洗涤除去，允许球状体在各种应用中使用的隔离无残余基质的存在。我们的协议使用一致的细胞数的快速聚集，以产生均匀尺寸的球体，允许各种实验条件下生长的球状体的直接比较。该方法可适于混合培养通过组合多个肿瘤相关的细胞类型的固定号码（ 在体内肿瘤生长模型如成纤维细胞，白细胞，基质细胞），以更准确地表示肿瘤环境。

在高浓度的MC接种提供了使用的协议单元的变型，可向监控能够在悬浮液中增殖细胞的锚地依赖性生长，并且可以用作一个失巢凋亡测定法（第6节），以确定或量化细胞转化。我们的协议产生的球体是理想的应用，如药物筛选，从而使细胞的生长，代谢，生存，和侵袭性治疗条件之间的比较。分离的球状体也可.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>缓冲液
10x 磷酸盐缓冲盐水	Thermo Fisher Scientific	AM9625
氯化钙溶液	Sigma-Aldrich	21114	用于 PBS+ 洗涤缓冲液;加入氯化钙时，不要高压灭菌 PBS+洗涤缓冲液
镁溶液	Sigma-Aldrich	M1028	用于 PBS+ 洗涤缓冲液;添加氯化镁后，请勿高压灭菌 PBS+洗涤缓冲液
名称	Company	目录号	>评论
用于球状体形成
96 孔 U 型底细胞驱避板	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's 改良型 Eagle 培养基	Sigma-Aldrich	D5546	用于培养 SH-SY5Y、PANC-1、TPC-1 细胞系
F12K 培养基	Thermo Fisher Scientific	2112722	用于培养 TT 细胞系
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F1051	使用前过滤以去除颗粒污染物
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M7027	在水中制备至 100 mg/mL
罗斯威尔公园纪念研究所培养基	Sigma-Aldrich	R8758	用于培养 HCT-116、BxPC-3 细胞系
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	解离缓冲液
名称	Company	目录号	评论
侵袭测定
I 型胶原蛋白	康宁354231掺入		原液 3.1 mg/mL;使用时保持在冰上
DMEM 无酚红低葡萄糖	Thermo Fisher Scientific	11054-20	补充酚红的培养基相比，背景荧光更少
胶质细胞系衍生的神经营养因子	Peprotech	450-10 趋化因子 Peprotech 450-10	趋化因子
<>名称<	strong>Company	目录号	Comments
用于免疫荧光显微镜
#1.5 盖玻片	电子显微镜科学	72225-01	用于安装切除的球
Alexa-Fluor 488 鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	A12379	用于以 1：200 的比例对肌动蛋白进行染色
血清白蛋白	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	用于 BSA 封闭缓冲液
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	抗褪色
甘油	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	用于 MOWIOL 封片剂
ImageJ 软件	免费软件，NIH	-	用于图像分析
微玻片	VWR International	48312-024	用于安装切除的球体
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	用于 MOWIOL 封固剂
多聚甲醛	EMD-Millipore	PX0055-3	用于固定缓冲液
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	用于透化缓冲液