本文介绍了可用于估算相关动力学生长参数的台式光合生物反应器的组装过程和操作方法。该系统利用传感器、数据采集与控制单元以及开源数据采集软件，对pH值、光照和温度进行连续监测。
本文内容
摘要
摘要
光合生物反应器（PBR）在微藻培养中的优化设计与运行，对于提升基于微藻的生物燃料生产的环境与经济效益至关重要。能够估算不同条件下微藻生长情况的模型，有助于优化PBR的设计与操作。为确保模型有效，所采用的生长参数必须准确测定。由于培养环境具有动态变化的特点，藻类生长实验通常受到限制，因此需要控制系统的支持以精确测定动力学参数。开展受控批次实验的第一步是实时数据采集与监测。本实验方案概述了一种可用于开展微藻生长实验的台式光合生物反应器的组装与操作流程。该方案详细说明了如何设计并组装由丙烯酸材料制成的平板式台式PBR，并介绍了如何配置PBR系统，实现通过数据采集与控制单元、模拟传感器以及开源数据采集软件对pH值、光照和温度进行连续监测。
引言
由于对全球气候变化和化石燃料资源有限性的日益关注，各国政府一直在制定政策以减少化石燃料消耗，并推动新型可持续交通燃料的发展。美国环境保护署制定了《可再生燃料标准》（RFS），要求到2022年，美国每年1400亿加仑的交通燃料中，有360亿加仑必须来自可再生燃料来源。要实现这些以及未来的可再生能源标准，必须依赖创新性和变革性技术1。
基于微藻的生物燃料的应用有望在减少温室气体排放的同时，帮助实现国家可再生燃料标准（RFS）2。与基于玉米和大豆等陆生粮食作物的第一代生物燃料相比，基于微藻的生物燃料具有多项优势。不同于第一代生物燃料，藻类生物燃料在种植过程中对土地、水资源以及与粮食相关的资源消耗更少，因为藻类可利用海水或废水在荒芜土地上全年培养。微藻的生长速率远高于陆生作物，并且能够积累高水平的脂质，这些脂质可被直接转化为生物柴油3。目前，尚无工业规模的藻类制生物燃料工厂，主要原因是其生产过程能耗高、成本昂贵，包括藻类培养、脂质分离以及将脂质精炼为生物柴油等环节。未来仍需开展更多研究，以提高这些工艺的效率与可持续性。
光生物反应器（PBRs）是一种光学透明、封闭的装置，可在人工环境中培养光合微生物，被认为是最具前景的培养方法之一3。然而，目前的设计仍缺乏足够的体积生产率，尚不足以使藻类制备生物燃料的过程更高效且在经济上更具吸引力4。考虑光照强度与衰减、营养物和CO2传输以及微藻生长的强力数学模型，可极大促进PBR设计与运行的优化。为建立此类优化模型，需通过小规模培养实验确定物种特异性的生长参数。
动力学实验需要对实验装置进行仔细的监测和控制，以防止出现意外的生长抑制因素。鉴于藻类的光合作用特性（即， 其对 CO 的消耗2 以及光的吸收），在台式规模的光生物反应器（PBR）中维持受控条件尤为困难。如图所示 公式 1，溶解的CO₂量2 在培养基中，通常表示为 
(公式 2)，至少取决于以下因素：1）CO2 分压和亨利平衡常数，后者决定了溶解于溶液中的气体量（公式 3）；2）培养基的初始化学成分，这会影响碳酸根离子的形态分布、活性以及 pH 值（公式 4 和 5）；以及 3）温度，其会影响 公式 3-55.
碳的不同相态及其化学形态使得在保持其他条件恒定的情况下，测量和维持光生物反应器（PBR）内稳定的溶解性碳浓度具有挑战性例如， pH 随着藻类消耗 CO 而升高2，并提高溶解的 CO2 底物可能产生酸性环境，从而抑制生长6.
在进行藻类动力学测试时，控制反应器内光照强度增加了实验条件调控的复杂性。光生物反应器（PBR）内部的平均光照强度不仅取决于入射光强度，还与反应器的设计例如， 材料、形状、深度和混合程度）、藻类生物量组分（特别是叶绿素）的吸光度以及藻细胞的光散射特性。随着藻类的生长，平均光强将逐渐降低。这种光强的变化，无论是由总细胞数和生物量的增加、单个细胞叶绿素含量的升高，或二者共同作用所引起，最终都可能诱导代谢响应，例如单个细胞叶绿素产量的增加，或利用碳水化合物和脂类储存物质供能7持续监测反应器内部的光照强度可提供宝贵的信息。这些数据有助于确保环境条件维持在特定范围内，若与其他测量数据结合，还可用于估算藻类生长和吸光度参数。即， 生物量，叶绿素浓度，反应器深度，入射光 等等。).
要了解藻类在特定条件下的生长情况，需要在台式动力学实验中监测 pH、溶解的 CO2、光照强度和温度。许多藻类培养系统并未配备足够完善的监测设备，难以满足动力学模型校准所需的条件监控要求，这使得建模过程极具挑战性8。尽管许多公司提供带有自动化与控制功能的台式光生物反应器（PBR），但这些台式系统可能价格昂贵（约 20,000 美元），且未必能满足特定研究问题的全部实验需求。
在为批次实验建立控制反馈系统的流程中，第一步是实时数据采集。本文旨在演示如何构建并设置一个配备连续光照、pH 和温度监测功能的 bench-scale PBR（光生物反应器）。这种实时监测系统可帮助研究人员根据需要确保实验条件维持在目标范围内。尽管本方案未详细说明具体的控制机制，但这些分步操作指南为实现更复杂的控制反馈系统之前所需的数据采集框架提供了基本基础。
方案
1. 构建台式光生物反应器主体和盖子
注意：为了说明目的，本实验以杜氏藻属（Dunaliella sp.）作为构建该光生物反应器的模式生物，这是一种大小约为10 µm、耐盐且无细胞壁的微藻。
- 确定研究所需的PBR体积。
- 确定该PBR的实验目标。
- 确定使用哪些藻类测量检测方法， M，对于表征目标藻类物种的生长是必要的，包括每次测定所需的体积， v技术重复次数， n；采样频率， f；以及实验的持续时间， t.
注意：具体项目的研究问题、藻类物种及可用设备决定了所测量的藻类特性、测量方法以及测量频率。生物量、细胞计数以及总叶绿素色素、蛋白质、脂质、碳水化合物和外界硝酸盐浓度的测定是评估生长状况的常用方法，通常在5至14天内进行每日取样以开展生长测试。9,10. - 计算总培养体积， Vs，用于一个实验过程中多次取样所需 公式 6.
- 使用 方程 7 以估算目标PBR体积， Vp，使用 Vs 来自步骤 1.1.3 以及最大体积移除比例， F.
注意：移除的总体培养物体积少于预设比例（例如， ~20%）有助于确保PBR内的条件 即， 混合功率，光照分布 等等。在整个实验过程中，随着培养液体积被移除，其变化并不显著。- 假设进行为期10天的实验，每天以三个重复测定生物量、细胞数量以及总叶绿素、蛋白质、脂质、碳水化合物和硝酸盐浓度，总取样体积约为600 mL。若要求移除的培养液体积不超过总培养体积的18.75%，则反应器的总体工作体积至少应为3.2 L。
- 为PBR实验选择传感器和配件。
- 选择用于连续监测的pH、光照和温度探头。
注意：传感器应与数据采集单元兼容，并能耐受培养内部环境条件（即， pH 范围、光照、热量、藻类残骸、盐分 等等。）。此处选用不锈钢和耐盐探针，因为 杜氏盐藻属物种 是海洋微藻。 - 选择满足实验混合要求的搅拌桨设计和电机。
注意：例如，低剪切轴向搅拌桨是合适的选择 杜氏盐藻 藻类，因其缺乏细胞壁而易于剪切11这些藻类具有鞭毛运动能力，不需要强烈搅拌。11可使用12 V微型齿轮电机实现较低的搅拌速度。搅拌桨和搅拌轴可采用3D打印（3D打印相关信息见材料清单）。
- 选择用于连续监测的pH、光照和温度探头。
- 组装PBR主体和盖子。
- 根据步骤1.1中的体积计算结果确定反应器的尺寸，同时考虑实验目标及可能存在的限制条件（例如， 空间。
注意：优选具有较低比表面积的光生物反应器（PBR）设计，因为这种结构可最大限度减少光在PBR内的衰减，从而在整个实验过程中提供更均匀的光照分布。 - 使用台式锯根据步骤1.3.1中确定的PBR设计和尺寸，切割五块光学透明的浇铸亚克力板（厚度约0.25–0.5英寸）。
- 使用200至400目砂纸将接缝边缘打磨平整，但不得磨成圆角。
- 用胶带和/或夹具将亚克力板的边缘固定在一起。
注意：丙烯酸盐水泥并非胶水。若丙烯酸盐粘接表面粗糙，或丙烯酸盐部件未对齐平整，则该粘接水泥将无法有效发挥作用。 - 在通风良好的区域，使用针头分配器将丙烯酸胶沿接缝处涂抹。塑料表面会立即粘合在一起。静置24小时。
警告：使用丙烯酸骨水泥时应佩戴口罩和手套，以避免吸入和皮肤接触。 - 在接缝处涂抹粘性丙烯酸胶以确保PBR的防水性。根据胶水说明，静置干燥24-48 h；干燥时间可能有所不同。
- 用水填充反应器以检查是否有可见泄漏。若无明显泄漏，将反应器置于纸巾上，在24–36小时后再次检查是否漏液。
注意：组装容积超过约 2 L 的光生物反应器时，应使用厚度不小于约 0.5 英寸的亚克力板；较薄的板材可能因水压而弯曲，导致泄漏。垫圈和加固螺丝可作为比亚克力胶更坚固的替代方案。 图1）。这种组装需要精密设备，且必须极为小心地进行，因为亚克力材料容易开裂。 - 使用机械加工车间设计光生物反应器（PBR）盖子，预留接口以安装传感器及其他PBR配件和满足相关需求（即， 搅拌桨，气体管路，取样口 等等。确保内部组件之间不相互干扰。
注意：PBR 及 PBR 盖子的构型/设计将取决于反应器附件和实验目标。参见 图1 以一个PBR反应器及盖子设计为例（更多细节见材料部分）。本方案后续内容将以此PBR设计为参考。
- 根据步骤1.1中的体积计算结果确定反应器的尺寸，同时考虑实验目标及可能存在的限制条件（例如， 空间。
图1：配备传感器和搅拌器的定制小型光生物反应器装置示意图。该装置包含一个搅拌器、通过顶盖上的螺纹接口固定的电极，以及连接在特制顶盖上的光传感器。该顶盖设计还包括一个12 V直流微型齿轮电机的安装位置。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 使用数据采集与控制单元设置并配置传感器
注意：传感器可将物理世界中的变化转化为可测量的模拟信号，通常为电压。数据采集单元作为数字世界与物理世界之间的接口，可根据计算机指令读取这些模拟信号并将其转换为离散值。本文所述的数据采集单元具有16位模拟输入分辨率，最多可读取14路模拟信号（±10 V），并能为某些传感器提供所需电源（最高 5 V）。本说明概述了如何设置该数据采集与控制单元，以将光、pH 和温度的模拟信号转换为光生物反应器（PBR）中更具意义的数值。本说明未详述重要概念（即，量化，精度，响应时间 等等。）以充分解读这些测量值并量化其不确定性。
图2：传感器与数据采集及控制单元连接示意图。 本图展示了如何将pH、光照和温度传感器连接至本实验方案所用的数据采集与控制单元。图中还显示了pH传感器和光照传感器的信号处理组件。请点击此处查看此图的放大版本。
- 使用低通滤波器，将光传感器与数据采集和控制单元进行设置和配置。
注意：请参阅 图2 用于一般参考示意图。制造商的传感器规格根据颜色标明信号线、电源线和接地线之间的区别。低通滤波器是一种使用电阻器和电容器滤除电信号中不必要噪声的简单电路。此类滤波器会衰减频率高于由电阻和电容决定的截止频率的电信号。该滤波器有助于去除或平滑传感器信号中的电噪声。- 使用剥线钳剪取一段约2英寸长的绿色连接线；在一端剥去约0.25英寸的绝缘层，另一端剥去约0.5英寸的绝缘层。
- 确定光传感器上的模拟信号输出线。确保金属导线从绝缘层中露出至少约0.25–0.50英寸。
- 小心地将1,000的一条腿缠绕 Ω 将电阻器的一端缠绕在连接线约 0.5 英寸的裸露端上。将电阻器的另一引脚缠绕在光传感器模拟信号线的裸露部分。
- 使用电烙铁和无铅焊料将电阻引脚焊接到导线上。让焊料冷却 2-5 min。
警告：焊料和电烙铁温度极高，若操作人员未经适当培训，可能造成严重危险。相关教学视频可在网上找到。佩戴护目镜及其他安全防护措施至关重要。在此过程中，导线不得连接至电源或其他设备。 - 将一段约1.5英寸长的热缩管套在连接线的一端，并滑动热缩管，使其覆盖焊点和电阻。确保所有金属部件均被完全覆盖。
- 使用热风枪进行热缩。确保热缩管紧密包裹电阻和导线，不得暴露任何裸露的导线。
- 使用螺丝刀将光传感器的接地线连接到数据采集与控制单元上的一个空闲接地（GND）端子。
- 使用螺丝刀将信号连接线的自由端固定在空闲的模拟输入（AIN）端子上。
- 固定正极导线的 1,000 µF 电容器（即， 较长的一端）与第2.1.8步中的同一AIN端子连接，负极引线（即， 将较短的引脚与步骤2.1.7中相同的GND端子连接。确保电容引脚和导线均牢固连接至该端子。
- 确定光传感器的电源输入线，并将该导线固定到数据采集与控制单元的电压输出（VS）端子上。
- 使用单位增益放大器和低通滤波器，将pH电极与数据采集单元连接并进行配置。
注意：由于pH测量的特性（即，高阻抗和低电压），在pH探针与数据采集设备之间通常需要一个单位增益放大缓冲器。此外，使用低通滤波器有助于测量pH值，以保护信号免受环境电噪声干扰。- 使用发射导线将单位增益放大器连接到 pH 探针。
- 将带有正负端子的同轴适配器连接到单位增益放大器的另一端。
- 使用剥线钳剪取两段6英寸的绿色导线和一段约12英寸的黑色连接导线。剥离黑色连接导线两端各约0.25英寸的绝缘层。
- 使用剥线钳从绿色连接线的两端分别剥去约 0.25 英寸和约 0.5 英寸的绝缘层。
- 小心地将1,000的一条腿缠绕 Ω 将一个电阻器的一条引线缠绕在一根绿色连接线约0.5英寸的裸露部分上。将该电阻器的另一条引线缠绕在另一根绿色连接线约0.5英寸的裸露部分上。
- 使用电烙铁和无铅焊料将电阻引脚焊接到导线上。让焊料冷却 2-5 分钟。
- 将一段约1.5英寸的热缩管套在连接线的一端，并滑动热缩管，使其覆盖焊点和电阻。确保所有金属部件均被完全覆盖。
- 使用热风枪进行热缩。确保塑料管紧密包裹电阻和导线，不得暴露任何裸露的导线。
- 将黑色连接线的一端固定到同轴适配器的负极（黑色）端子上。将该导线的另一端插入数据采集与控制单元的GND端口，并使用螺丝刀拧紧固定。
- 将绿色连接线的一端（串联有电阻）固定到同轴适配器的正极（红色）接线柱上。将该连接线的另一端插入数据采集与控制单元的一个空闲 AIN 端子中。
- 确定导线的正极 1,000 µF 电容器（即，较长的引脚）并将其连接至与步骤2.2.9相同的AIN端子；确保电容引脚和信号线均牢固连接至该端子。
- 固定负极导线的 1,000 µF 电容器（即，较短的一端）与步骤2.2.8中相同的GND端口相连。
- 将探头的信号线、接地线和电源线分别连接到数据采集与控制单元的空闲 AIN、GND 和 VS 端口。
3. 设置实时数据采集和实验文件
注意：此处描述的数据采集与控制软件通过与数据采集和控制单元通信，以用户指定的时间间隔监测并记录传感器数据。以下说明介绍了如何在该软件中设置控制文件，以监测和记录 pH 值、温度和光照。这些说明仅适用于材料部分列出的软件和数据采集与控制单元。更多详细说明请参见产品用户手册。
- 使用USB线缆将数据采集与控制单元连接至实验装置附近的计算机，并下载所有必需的驱动程序。
- 下载并打开数据采集与控制软件。
- 在软件中为每个传感器设置“转换”。
注意：为了将物理电压信号转换为有意义的数值，必须应用通过校准确定的转换系数。许多传感器附带出厂校准系数，这些系数可在产品特定的技术规格表中找到。转换方程与具体装置和传感器相关。许多转换方程的参数，特别是电极相关的参数，必须通过定期校准进行更新。传感器的使用寿命和校准频率取决于产品特定的技术规格以及工作环境。
注意：用户应完整阅读并理解这些规格说明。 表1 显示材料清单中传感器的换算方法。以下为温度探针的一个换算示例。- 导航至 "转化" 在软件工作区主页面的右侧。
- 添加一个转换名称，例如， "伏特转摄氏度" 并输入转换方程： (55.56 x 值) + 255.37 - 273.15
| 频道名称 | 转换名称 | 方程 | 注意事项 |
| 温度 | 伏特转摄氏度 | (55.56 × 值) + 255.37 - 273.15 | 制造商提供的将伏特转换为摄氏度的换算方程。 |
| 光 | 伏特转光合光子通量密度 | 值 x 500 | 将伏特转换为光合光子通量密度的制造商转换系数（µmol m-2s-1），未应用制造商LED校正。 |
| pH | 伏特转pH | (-17.05 × 值) + 6.93 | 校准依赖的转换方程（图4b），用于将pH电极电压读数转换为pH值。仅在校准后对pH通道应用该转换。 |
表1：数据采集文件的通道转换表。 将传感器的通道及转换信息输入数据采集软件的示例。
- 在软件内为每个传感器设置相应的通道以采集传感器数据。
注：每个传感器在软件中都需要一个独立的模数转换通道，并在数据采集与控制单元中指定一个模拟输入端子。- 在软件中导航至“通道”页面。
- 添加一个传感器通道名称。不允许使用空格字符。
- 为相应通道选择用于采集数据的合适设备；该设备将对应数据采集设备。
- 输入用于引用数据采集与控制单元或其他数据采集设备的设备编号；如果仅使用一个单元，默认编号通常为零。
- 为输入输出类型选择“模数转换”，并输入与数据采集和控制单元上 AIN 端子编号对应的通道号。
- 输入所需的采样“时序”；该值表示传感器信号的读取频率。输入 1.0 表示每 1 秒采集一次读数。若要在记录前对 1 分钟间隔内的数据进行平均，请勾选“平均”框并指定平均长度为 60。
- 如果适用，从下拉菜单中选择合适的转换（参见步骤 3.3 以生成转换）；否则，所有通道数据都将以电压形式显示/记录。
- 设置“记录集”以记录实验数据。
- 在软件工作区中导航至“记录面板”，添加一个新的记录集并相应命名。选择输出文件类型和位置；如果在输出文件名中指定扩展名‘.csv’，ASCII 文件类型将生成一个逗号分隔值文件。
- 将所有需要记录的通道添加到此集合中。
- 通过右键单击工作区中的记录序列并选择相应选项，根据需要启动和停止记录。
注：在主动记录数据时，请勿尝试访问文件。此操作可能会中断记录过程。连续记录文件的保存/写入位置不应位于云目录中。
- 设置“页面”以显示数据和图表。
- 在软件工作区中导航至“页面”显示。单击其中一个默认的空白页面。
- 要在页面上以数值形式显示传感器输出读数，请在页面添加一个“变量值”显示。
- 在空白页面任意位置右键单击，选择“显示”，然后单击“变量值”选项；屏幕上将出现一个小方框。
- 右键单击这个新创建的方框并选择“属性”。输入显示标题（例如，“反应器温度”）、通道引用（例如，“Temperature[0]”）以及相关单位（例如，“Celsius”）。单击“确定”并返回显示页面。
- 要以图形化方式实时显示传感器数据，请在显示页面添加一个二维图表。
- 在空白页面任意位置右键单击，选择“图表”，然后选择“二维图表”；屏幕上将出现一个小型绘图区。
- 右键单击新创建的图表并选择“属性”。在“轨迹”选项卡中，在“Y 表达式：”框中输入所需的传感器通道名称（例如，“Temperature”），并确保“X 表达式：”框中已填写“Time”。单击“确定”并返回显示页面。
4. 校准 pH 探针
注意：每次实验前均应在实验预定温度下进行 pH 校准，并相应更新 pH 通道的转换参数。pH 电极读数在实验过程中可能发生漂移；为确定漂移程度，可在运行实验装置后重复校准过程并比较读数。实验前后，应按照制造商说明将 pH 电极正确保存在适当的储存溶液中。
- 按照步骤2所述，连接pH和温度传感器。
- 将pH电极和温度探头插入pH校准缓冲液7中。
- 检查图形显示，确保探头的温度读数达到实验所需的温度（步骤 3.6.2.2）。
- 让 pH 电极的电压输出稳定（即， 电压读数不再单向变化）。使用图形显示确认其稳定。
- 记录温度和pH电学数据至文件（步骤3.5），持续30-60秒。在此过程中，pH通道不应应用任何转换，也不应包含任何平均处理。
注意：由于pH电极对电噪声敏感，采用较低的采集时间（即更快的采样速率）可能更适合pH通道例如 “时间” = 0.1 s。 请注意，较短的时间间隔将需要更多的计算资源。 - 重复对缓冲液4和10进行校准。确认传感器的响应在-57至-59 mV/pH之间图3a).
- 通过绘制pH缓冲液值与电压的关系图并拟合直线，生成转换方程（图3b）。按照步骤 3.3 中所述更新转换方程。
- 将此转换应用于pH通道，并根据记录需求更新通道设置以包含平均值。
5. 为藻类实验设置光生物反应器
注意：以下步骤专用于Dunaliella以及图1中所示的定制式光生物反应器（PBR）。此外，这些安装说明不符合无菌操作规程，因为该系统并未按无菌要求进行设计。
- 根据实验需求和实验目标，准备藻类接种物和培养基。
- 按照步骤 2.2-2.3 中所述，将 pH 和温度传感器导线连接到数据采集与控制单元。
- 按照步骤 3.3 和 4 中所述，校准并更新 pH 通道的转换方程。
图4：混合器的接线图。 该图展示了如何使用微型齿轮电机、电源以及3D打印的叶轮和轴为光生物反应器（PBR）搭建一个混合装置。请点击此处查看该图的放大版本。
- 在温控培养箱内安装光生物反应器（PBR），并连接配件和传感器。参见 图4 以了解示意图。
- 通过将光传感器导线穿过PBR盖子上的端口，并使用提供的螺丝将传感器头部安装到盖子的延伸支架上，完成光传感器的安装。使用橡胶塞或衬垫确保该端口与外界环境密封。
- 将搅拌桨叶安装至PBR盖上：将桨叶轴套入PBR盖内部的直流微型齿轮电机轴上，并使用紧定螺钉和内六角扳手固定轴。
- 加入藻类专用培养基，盖上盖子，并用螺丝固定。将PBR放入培养箱中（设定温度为25 °C或所需温度）。
- 将温度探头插入指定端口，并使用橡胶塞将其固定在端口内。
- 使用PG-13.5螺纹接口将pH探头固定在反应器盖的端口上。
- 按照步骤2.1所述，将光传感器导线连接至数据采集单元。
- 启动搅拌桨叶并调节至所需转速。
- 在装置旁设置可调直流电源。打开电源，调节电压旋钮使电压读数为0伏，然后关闭电源。
- 将桨叶电机的电源线连接至可调电源的正负输出端子（图5）。
警告：切勿连接或触碰带电导线或电路。在连接任何导线前，务必确保所有电源均已关闭。请始终阅读制造商的说明书/技术规格，以确保电机、电源和导线之间的兼容性。 - 打开电源，缓慢旋转电压旋钮以逐步升高电压，直至达到所需的搅拌速度；通过测量每分钟转数来计算搅拌速度。
图5：反应器实验装置示意图。 在温度可控的培养箱内，光生物反应器（PBR）实验装置的可视化图示。该装置包括一个生长灯和一个PBR，传感器和搅拌器固定在PBR盖子内部。请点击此处查看此图的放大版本。
- 设置生长灯以照射光生物反应器（PBR）。
注意：本研究针对 Dunaliella 特性，选用了一种高功率、发射蓝光和红光光谱的LED生长灯，以达到所需的光合作用光强水平。应根据光生物反应器入射面的尺寸和形状选择合适的灯具，确保光线均匀照射。请确认培养箱能够承受内部热源，否则可能缩短培养箱寿命，或导致箱内过热或损坏。- 将生长灯置于PBR前表面的中心位置，确保光路直接对准安装在反应器背面的光传感器。
- 打开光源，并通过将生长灯向反应器靠近或远离来调节光照强度。通过传感器变量显示查看光照读数。
- 监测并记录传感器数据6至24小时，以确保PBR内的光照、温度和pH值稳定且处于理想范围内。根据需要进行调整。
注意：若无明显的PBR环境变化，却观察到读数波动、不稳定或数值突变，可能是由电噪声引起。 - 取下取样口的橡胶塞，通过移液管加入藻类接种物。
- 取样并监测条件，确保各项参数维持在实验所需范围内。
- 根据需要，使用移液管从取样口取出培养物进行分析。
注意：取样体积、频率和实验持续时间取决于步骤1.1.2。 - 通过软件中的数据显示监测PBR内的水温，并手动调节培养箱的空气温度设定值，以保持水温恒定。
注意：此调节需遵循培养箱制造商的操作说明。 - 根据需要监测并调节PBR内的pH值，确保其保持在实验预期范围内。
注意：本实验中，pH值通过一个12 V电磁阀（常闭型）与压缩CO2气瓶（99.99%）连接进行控制。利用数据采集与控制单元及软件的控制功能按需开启电磁阀。该系统需配备辅助继电器板和直流模块，并通过定制的计算机程序实现，以满足特定研究目标。
- 根据需要，使用移液管从取样口取出培养物进行分析。
结果
该实时监测系统提供的数据显示了小型光生物反应器（PBR）内藻类培养环境的动态变化，凸显了对系统进行监测与控制的必要性。记录的温度数据（图6）表明，光照、培养箱空气温度以及与藻类生长相关的能量耗散均会影响PBR内部的温度，同时显示了如何利用实时数据根据需要调节培养箱的温度控制参数。
在整个实验过程中测得的光照进一步凸显了该培养环境的动态特性。如图7所示，以光合光子通量密度（PPFD；µE-m−2s−1）表示的光照传感器读数，在加入藻类前约为100 PPFD，接种藻液后立即下降至85 PPFD。此后光照持续下降，至第7天时已低于5 PPFD。光照强度的降低是由于生物量和细胞数量增加，和/或叶绿素含量升高导致光吸收增强，表明尽管光照水平较低，藻类在第7天仍保持活性。需要进一步开展生物学测量以得出更深入的推论。
持续记录的 pH 数据表明，总体而言，在本实验中采用的 pH 控制算法能够有效控制 pH 值（图 8）。该数据同时展示了每分钟的读数和以小时为单位的平均值，揭示了在实时监测 pH 条件下培养微藻过程中的几个关键点。首先，在将藻类接种到光生物反应器（PBR）后，pH 值立即上升至高于设定的目标值 7.6。这一变化是预期之中的，因为接种到 PBR 中的培养物种子本身 pH 值高于设定点，这是由于用于培养接种物的摇瓶未进行 pH 控制所致。其次，该实时数据凸显了 pH 电极对外部电噪声的高度敏感性。这一点在第 1 天与第 2 天之间电极读数出现剧烈跳变时尤为明显。这些 pH 值的突变很可能是由相邻实验装置中的电磁阀产生的电噪声引起的。这种电气干扰导致 pH 控制算法被过早触发，向 PBR 中注入 CO2，从而造成 pH 值下降至目标设定值以下。pH 电极的敏感性可能导致极端异常值，并可能干扰整个控制系统。
图3：pH响应与校准示例图。（a）pH传感器的响应示例图（b）pH传感器的校准示例图，附有用于转换的方程。回归分析显示了95%的置信区间。误差棒不可见（标准误差小于0.03%）。这些图表明pH传感器连接正确，且其信号非常稳定。请点击此处查看此图的放大版本。
图6：7天实验期间光生物反应器（PBR）内的温度测量结果。深蓝色点表示传感器数据的每小时平均值，浅蓝色点表示在1分钟内采集的传感器读数（采集时间间隔为1秒，平均时长为60秒），并使用制造商提供的转换系数转换为温度值。黑色箭头指示为维持培养温度在约25 °C而调整培养箱温度设定的时间点（该目标设定值以红色虚线表示）。温度波动主要由藻类生长及培养箱温度变化引起。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：7天实验期间光生物反应器内的光照测量结果。 深蓝色点表示传感器数据的每小时平均值，浅蓝色点表示每分钟采集的传感器读数（采集时间间隔为1秒，平均时长为60秒），并通过默认的光照传感器出厂校准值转换为光合光子通量密度（PPFD）。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：在为期7天的实验中光生物反应器（PBR）内的pH测量结果。 深蓝色点表示传感器数据的每小时平均值，浅蓝色点表示每1分钟记录一次的传感器读数（采集时间为0.1秒，平均时长为600秒），并通过校准建立的转换方程换算为pH值。通过注入99%的CO2气体将pH维持在7.6至7.5之间。红色虚线表示目标pH范围。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
该光生物反应器系统能够监测和控制小规模藻类动力学生长实验，从而提高用于量化生长的实验测定结果的可重复性。然而，了解传感器测量的局限性和不确定性对于确保传感器读数准确反映反应器条件至关重要。这种理解包括对传感器涉及的测量原理、校准过程与频率、测量不确定度以及传感器能够和不能测量的内容的基本认识。例如，此处描述的光照传感器的电学响应在可见光谱范围内并非均匀分布，因此根据该传感器数据的分析方式，可能需要对传感器输出应用特定的校正因子。
温度水平及其变化也极为重要，因为温度的改变会显著影响传感器的响应。了解可能影响传感器读数的各种干扰因素同样至关重要；这些干扰可能来自建筑物中的环境电噪声，也可能源于测量环境本身。例如， 钠离子在pH值超过10时会显著影响pH读数12此外，将多个探针浸入溶液中，特别是高离子强度且具有导电性的盐溶液中，也可能产生干扰。用于测量pH值（或离子强度、溶解氧、溶解CO₂）的电极2, 等等。电极信号对环境电噪声特别敏感，容易受到干扰。尽管使用了信号调节技术来保护电极信号，但仍无法确保其他因素不会影响探针读数。作为质量控制的一部分，应使用其他实验室设备（如手持式pH探针、手持式光谱仪和温度计）来验证传感器读数，确保系统正确安装并正常运行。
另一个必须解决的局限性是藻类和/或培养环境对传感器可能产生的影响。例如，如果藻类残渣或气泡覆盖了光传感器的光电二极管受体，读数将受到影响。同样，pH电极极为敏感，需要格外小心以确保读数准确。这些电极通过测量由于H+离子积聚而在内部结点两侧产生的电压差来工作；探针内部需要一层水合缓冲层以维持准确测量12。根据反应器内的条件，该缓冲层会逐渐损耗，导致探针在浸入期间传感器响应可能发生改变。在初步测试中，pH电压输出在为期20天的实验过程中漂移不超过约0.2个pH单位，但仍需进一步评估以表征传感器响应的这种变化，并确定最长实验运行时间，特别是在需要精确pH调节或定量的情况下。
目前许多用于研究藻类生长的小型光生物反应器（PBR）系统对培养环境的内部监测与控制精度不足，难以准确区分不同因素对藻类生长的影响，因为实现此类高精度控制系统的搭建具有挑战性。本实验方案通过提供带有实时监测功能的光生物反应器构建的逐步操作指南，有助于开展更为可控的实验。此外，这些实时数据不仅可用于更精确地控制实验条件，还可能用于估算生长动力学参数（例如，以光密度读数作为生长速率的参考指标）。
受控的实验系统有助于提高藻类研究的可重复性。通过监测和控制的台式规模光生物反应器（PBR）装置，能够最大限度地减少实验设计中的非预期干扰因素，从而提高实验效率，并推动藻类生物燃料成为可持续的替代能源。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国国家科学基金会前沿研究与创新项目（资助号：1332341）对本研究的资助。 作者还感谢 Andrew Grieshop 博士，以及 LabJack 和 DAQFactory 在线支持社区在本研究过程中提供的协助与帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 浇铸亚克力板 | McMaster Carr | 8560K244 | 厚度为 7/8''，尺寸为 12 x 36''，光学透明，所购板材尺寸需根据反应器的具体尺寸确定。 |
| 亚克力胶水 | McMaster Carr | 7517A4 | Scigrip 塑料管胶水，#4SC 不发白型，适用于亚克力。若使用垫圈和螺钉组装光生物反应器（PBR），则无需此胶水。 |
| 亚克力胶水施用针头 | McMaster Carr | 75165A136 | 亚克力胶水施用针头，25 规格，1"，不锈钢材质，PTFE 内衬。 |
| 亚克力胶水用塑料分液瓶 | McMaster Carr | 7544A67 | 塑料分液瓶，2 盎司容量，每包 5 个。 |
| 高粘度亚克力胶水 | McMaster Carr | 7515A11 | Scigrip 塑料管胶水。中等粘度的亚克力胶水，用于密封光生物反应器（PBR）本体中的任何缝隙。 |
| PG-13.5 螺纹丝锥 | McMaster Carr | 2485A14 | 可用于将 pH 电极固定在盖子上（如适用）。 |
| 光生物反应器（PBR）及盖子 | NCSU 精密机械加工车间 | Karam Algae 3.2L Reactor Revision E | 该机械加工车间对公众开放营业。请联系车间经理。 |
| pH 传感器 | Hamilton | 238643 | EasyFerm Plus 120，可高压灭菌，输出毫伏信号。 |
| 光照传感器 | Apogee Instruments | SQ-225 | 放大式 0–5 伏电学校准量子传感器，防水。 |
| 温度传感器 | LabJack | EI1034 | 不锈钢材质，防水温度传感器。 |
| 带 BNC 接头的 pH 变送器导线 | Sigma-Aldrich | HAM355173-1EA | 该导线型号取决于所用 pH 探头类型。请确保导线与 pH 探头兼容，并带有 BNC 连接端。 |
| 单位增益前置放大器 | Omega Engineering | PHTX-21 | 用于 pH 电极的信号处理放大器，适用于高阻抗 pH 信号读取。 |
| 同轴适配器，BNC 母头转接线柱 | Amazon | SMAKN B00NGD5K80 | 用于将前置放大器输出的 pH 信号连接至微控制器。 |
| 电容（1000 uF） | Amazon | Nichicon BCBI4950 | 用于低通滤波器。 |
| 电阻（1000 欧姆） | Radio Shack | 2711321 | 用于低通滤波器。 |
| 连接导线 | RadioShack | 2781222 | 用于制作低通滤波器、连接传感器至微控制器，以及电机布线。 |
| 热缩管 | RadioShack | 2781611 | 用于低通滤波器组装。 |
| 数据采集与控制单元 | LabJack | LabJack U6 | 用于处理来自传感器的电信号，并与数据采集和控制软件通信。 |
| DAQFactory 数据采集软件 | DAQFactory | DAQFactory Express Release 5.87c Build: 2050 | 可免费下载，支持最多 10 个通道。 |
| 微型直流齿轮电机 | McMaster Carr | 6331K31 | 用于搅拌器叶轮的电机。 |
| 叶轮和轴 | N/A | N/A | 请通过电子邮件联系作者获取 3D 文件。 |
| 可调直流电源 | Amazon | Tekpower HY1803D | 可调直流电源，输出范围为 0–18V @ 0–3A。 |
| 植物生长灯 | HydroGrow | SOL-1 | 此特定型号已不再供应。 |
| 培养箱 | Thermo Scientific | Precision Model 818 | 该型号培养箱可承受内部热源，因其冷却压缩机无论温度设定如何均持续运行。 |
参考文献
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