下一代电穿孔技术是一种高效的方法，可用于将小RNA转染至人Th17细胞中，从而改变基因表达和细胞行为。
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摘要
摘要
CD4+ T细胞可根据周围细胞因子环境的不同，分化为多种效应性辅助T细胞亚群。Th17细胞可由初始CD4+ T细胞 体外 通过在极化性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-23和TGFβ存在的情况下激活T细胞，可诱导其分化为Th17细胞。Th17细胞在抵御胞外细菌和真菌感染的免疫应答中发挥关键作用，但其异常活化也与多种自身免疫性和炎症性疾病相关。Th17细胞的特征包括表达趋化因子受体CCR6，以及由其主调控转录因子RORγt和特征性效应细胞因子IL-17A所定义。优化的Th17细胞分化培养条件，有助于在可控环境中深入研究人类T细胞生物学的分子机制，同时也为通过RNA干扰技术或导入microRNA（miRNA）模拟物及抑制剂来探究特定基因及其表达程序的功能提供了实验平台。本实验方案提供了一种简便、可重复且高效的方法，利用新一代电穿孔设备，对正在分化的原代人类Th17细胞进行小RNA的瞬时转染。
引言
CD4+ T细胞是适应性免疫应答的关键调控者。初始CD4+ T细胞能够分化为多种不同的效应T细胞（例如 Th1、Th2、Th17 等等。），每种亚型具有其独特的细胞因子和转录因子谱，具体特征取决于局部微环境1T细胞的谱系分化决策对于保护性免疫和自身耐受均至关重要。Th17细胞是T细胞的一个亚群，能够抵御胞外细菌和真菌感染，但其异常反应也与多种自身免疫性和炎症性疾病（如多发性硬化症和银屑病）的发病机制相关。2,3人类Th17细胞可由初始CD4+ T细胞 体外 通过为它们提供适当的极化环境4已使用多种细胞因子组合（包括IL-1β、IL-23、TGFβ和IL-6）来诱导人Th17细胞的分化。人Th17细胞表达趋化因子受体CCR6，该受体常用于鉴定此类细胞群体，并以其主要转录因子RORγt（由RORC基因编码）的表达为特征。 RORC)5,6Th17细胞能够表达多种细胞因子，但IL-17A是这类细胞谱系特征性的效应细胞因子。我们检测了所有三种与Th17相关的标志物（CCR6、RORγt、IL-17A），以评估人Th17细胞诱导的稳定性 体外 分化实验。此外，我们培养了人CD4+ 在非极化条件下培养的T细胞，培养基中未添加任何细胞因子或阻断抗体，用作阴性对照，因为这些Th17标志物的表达应极低或缺失。
研究正常人类T细胞发育和生物学的一种方法是在其发育过程中调控基因表达。短干扰RNA（siRNA）是可靶向蛋白质编码mRNA的合成小RNA分子，可用于降低特定基因的表达水平。微小RNA（miRNA）是一类内源性非编码小RNA，已知可在转录后水平调控基因表达。研究表明，miRNA在小鼠和人类T细胞生物学中均发挥重要作用，包括在Th17细胞中的作用7,8,9。为了研究小RNA对基因表达以及最终对人类T细胞生物学的影响，建立可靠的人类T细胞中小RNA活性操控方法至关重要。本文中，我们描述了一种简便、稳定且可靠的实验方案，用于将合成小RNA和锁核酸（LNA，一种化学修饰后稳定性增强的核酸）导入免疫细胞，特别是人类Th17细胞。
将小RNA导入哺乳动物细胞有多种替代方法，通常可分为化学法、生物学法或物理法10。常用的化学方法包括基于脂质的转染和磷酸钙转染，这些方法依赖于形成化学-DNA复合物，使细胞更高效地摄取。一般来说，化学方法在原代T细胞转染中的效率较低。最常见的生物学方法是使用病毒载体（例如逆转录病毒或慢病毒），在病毒自然复制周期中将其外源RNA直接插入宿主细胞。病毒转导通常需要较长时间才能完成，尤其是当需要考虑前病毒质粒分子克隆所需时间时。此外，病毒转导载体可能对人类研究人员具有潜在危害。电穿孔是一种物理方法，通过向细胞施加高电压脉冲诱导细胞膜通透性增加，从而使核酸短暂进入细胞并作用于其靶标。传统的电穿孔仪器在转染原代淋巴细胞方面效果不佳。然而，经过优化的新一代电穿孔技术已被证明能够以非常高效率转染T细胞，特别是当待转染物质为小RNA时。术语“新一代”通常用于区分两种较新的平台（例如 Neon、Amaxa）与传统电穿孔设备。此外，该方法易于扩展，适用于中等通量筛选，在单次实验中可处理多达约120种小RNA，通常使用经过验证的合成试剂。重要的是，T细胞激活后仅需约16小时即可实现成功的转染。然而，该方法的缺点在于不会导致基因组的稳定整合，因此其表达是瞬时的。因此，在需要小RNA长期表达的情况下，值得额外投入精力构建稳定的表达载体，并将其包装进病毒载体中，以实现在T细胞中的成功表达。
我们已采用新一代转染技术（例如，Neon）递送多种合成的单链或双链 RNA 或 LNA 寡核苷酸工具，以实现不同目的11,12,13。利用双链小干扰 RNA（siRNA）可在原代小鼠和人 T 细胞中高效诱导 RNA 干扰。本方案描述了在人 Th17 细胞中应用该技术的优化条件。除 siRNA 外，还可使用 commercially available 合成 miRNA 模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitors）来研究 miRNA 功能的获得与缺失。miRNA 模拟物是双链 RNA 分子，结构与 siRNA 相似，但其序列设计为与内源性成熟 miRNA 一致。miRNA 抑制剂则是经化学修饰的基于 RNA 和/或 LNA 的单链寡核苷酸，可结合内源性 miRNA 并拮抗其功能。我们发现，所有这些工具均可有效应用于培养的原代 T 淋巴细胞，包括但不限于人 Th17 细胞。
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方案
本方案遵循加州大学旧金山分校（UCSF）关于人类研究伦理的指南。
1. T细胞培养的准备、CD4+ T细胞的分离及Th17极化
- 第0天，在含有钙和镁的PBS中，用抗人CD3（2 µg/mL）和抗人CD28（4 µg/mL）对6孔组织培养板进行包被，每孔加入1.5 mL，于37 °C孵育至少2小时。
- 或者，可在4 °C过夜包被，并用封口膜包裹培养板。
- 按照制造商说明书，通过密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞（CBMCs）。
注意：操作人血时应小心谨慎，并确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），以避免接触血液传播病原体的风险。 - 单个核细胞分离并洗涤后，使用商用的人CD4+ T细胞分选试剂盒通过阴性选择法进行人CD4+ T细胞的分离。
备注：若单个核细胞分离后存在红细胞污染，可在CD4+ T细胞分离步骤前选择性地进行红细胞裂解。将单个核细胞重悬于1 mL分离缓冲液（含2% FBS的PBS）中，加入5 mL 1×裂解液，室温孵育15分钟。然后加入5 mL分离缓冲液，于4 °C以300 × g离心5分钟以收集细胞。- 将单个核细胞以50 × 106 /500 µL的密度重悬于新的5 mL离心管中的分离缓冲液中。
- 每管加入100 µL FBS和100 µL抗体混合液，然后在4 °C下于旋转摇床上孵育20分钟，充分混匀。
- 孵育结束后，加入3–4 mL分离缓冲液洗涤细胞。于4 °C以300 × g离心8分钟收集细胞，小心吸除上清液。
- 在此离心过程中，预先洗涤磁珠。将所需量的磁珠转移至新的离心管中（使用比例为1:1），加入等体积的分离缓冲液洗涤磁珠。使用1 mL移液器充分混匀 ，然后将离心管置于磁力架上至少1分钟。小心吸除上清液。将磁珠重悬于洗涤前转移的相同体积的缓冲液中。
- 将每管中的细胞用500 µL分离缓冲液重悬，并加入500 µL预洗过的磁珠。
- 将细胞与磁珠在室温（18 °C至25 °C）下于旋转摇床上孵育15分钟，充分混匀。
- 孵育结束后，使用1 mL移液器彻底吹打细胞至少10次。然后加入3–4 mL分离缓冲液，将每管置于磁力架上2分钟。
- 小心地将上清液中阴性分选得到的CD4+ T细胞转移至新的离心管中。
- 完成CD4+ T细胞分离后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞置于冰上保存。
- 用PBS洗涤抗体包被的培养板两次。然后每孔加入1.5 mL Th17极化培养基的2×混合液：含抗人IFNγ（20 µg/mL）、抗人IL-4（20 µg/mL）、人TGFβ（10 ng/mL）、人IL-1β（40 ng/mL）、人IL-23（40 ng/mL）、人IL-6（50 ng/mL），所有因子均稀释于无血清基础培养基中（补充 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠和100 µM 2-巯基乙醇）。
备注：转染和RNA干扰在含血清培养基中也可进行。本方案使用无血清培养基的目的是为了获得更好的IL-17A产生效果。 - 于4 °C以500 × g离心5分钟收集人CD4+ T细胞，小心吸除上清液。然后将细胞重悬于无血清基础培养基中，以每孔3 × 106细胞、1.5 mL体积接种，使每孔终体积为3 mL，极化细胞因子的终浓度为1×。
- 将培养板置于5% CO2、37 °C培养箱中培养两天。
2. 电穿孔 体外 极化的人类Th17细胞
- 第2天，在含钙和镁的PBS中，每孔加入250 µL抗人CD3（2 µg/mL）和抗人CD28（4 µg/mL），对48孔组织培养板进行包被，37 °C孵育至少2小时。
- 或者，将培养板在 4 °C 下包被过夜。用 Parafilm 封膜包裹培养板。
- 准备用于转染的小RNA。每次转染时，将5 µM siRNA储备液1 µL分装至1.5 mL微量离心管中。同时设置相匹配的化学性质的小RNA对照。所有离心管均需置于冰上保存。
- 用 PBS 洗涤抗体包被的板子两次。然后每孔加入 500 µL 1X Th17 极化培养基：抗人 IFNγ（10 µg/mL）、抗人 IL-4（10 µg/mL）、人 TGFβ（5 ng/mL）、人 IL-1β（20 ng/mL）、人 IL-23（20 ng/mL）、人 IL-6（25 ng/mL），均用无血清基础培养基稀释（补充有 2 mM L-谷氨酰胺，100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素，10 mM HEPES，1 mM 丙酮酸钠和 100 µM 2-巯基乙醇。
- 在培养板和转染试剂制备完成后，使用1 mL移液器重悬细胞，轻轻吹打以确保所有细胞从孔底脱离。将细胞收集至一个锥形管中，在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。
注意：若培养时间超过本方案所述的四天，应每隔约三天使用本方案进行一次转染。然而，第2.4步需作相应修改，因为经不同小RNA处理的细胞不应混合。所有待测条件的细胞均须分别收集、计数并单独转染。 - 小心吸除上清液，然后用至少 1 mL 的 PBS 重悬细胞以进行洗涤。计数活的 Th17 细胞（例如 使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法评估细胞活力后，将细胞转移至微量离心管中。
- 在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 小心吸除上清液，然后使用转染系统10 µL试剂盒中提供的重悬缓冲液将细胞重悬，细胞密度为2.5–4 × 107 每毫升细胞数。将细胞置于室温保存。
注意：作为指导原则，尽量只准备可在30分钟内完成转染的细胞数量。可对多个批次进行比较。 - 向每个微量离心管中加入9 µL细胞和1 µL小RNA。用移液器轻轻吹打一次，混匀细胞与小RNA以进行转染，然后将混合液转移至提供的移液电极尖端中。
注意：通常加入 9.5 µL 细胞悬液，以确保混合液体积充足，防止转染前在移液器电极尖端产生气泡。 - 将3 mL室温的电解缓冲液E加入提供的比色皿中。将比色皿放入移液工作站，然后将移液管置于比色皿内指定位置。
- 立即使用电穿孔仪对每份10 µL细胞与小RNA混合物进行电穿孔，参数设置如下：脉冲电压1,500–1,550 V，脉冲宽度10 ms，共3次脉冲。
- 电穿孔完成后，立即将细胞混合物加入到已准备好的培养板孔中含500 µL 1X Th17极化培养基的孔内。将培养板置于5% CO₂培养箱中。2，37 °C 培养箱中再培养两天。
注意：每次转染之间，需通过在 PBS 中上下吹打移液管电极尖端进行清洗。
3. 收集人 Th17 细胞
- 用移液器轻轻吹打培养基中的细胞，确保所有细胞从孔底脱离。将细胞用于功能检测和/或基因表达分析。
注意：通常情况下，单孔转染的 Th17 细胞收获的细胞数量足以用于表面标志物、细胞内细胞因子和转录因子染色的流式细胞术分析，或用于制备 RNA 进行基因表达分析。
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结果
成功电转染人Th17细胞的可靠体系的第一步是建立稳定的 体外 分化的Th17细胞培养物。在Th17极化条件下培养的T细胞表达趋化因子受体CCR6和转录因子RORγt（图1A，左侧）。当T细胞在非极化（ThN）条件下培养时，这些标志物未表达。图1A， 右）。在Th17极化条件下培养的T细胞在再次刺激后也产生IL-17A（图1B，左侧）但在ThN条件下则无此现象（图1B，右侧）。在转染小RNA后，Th17细胞分化仍可发生，但在某些实验中可观察到IL-17A产生的频率有所降低（图1C）。小RNA转染对细胞因子产生的影响表明，在每个实验中使用化学性质匹配的小RNA对照进行比较具有重要意义。重要的是，小RNA转染后细胞活力得以维持，通常高于70%（图1D).
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讨论
本方案提供了一种改进的方法，用于将小RNA递送至人Th17细胞。尽管本实验中使用了人Th17细胞，但该小RNA电穿孔方法也可适用于其他原代人T辅助细胞亚群，如Th1、Th2和Treg细胞。然而，该方法在初始CD4+ T细胞中效果不佳，因此转染前必须在体外培养中预先激活细胞。在本方案中，我们首先优化了in vitro培养体系以提高IL-17A的产生水平。其中最关键的因素是基础培养基。我们发现，与传统含血清培养基相比，无血清培养基在诱导产生IL-17A的人Th17细胞方面更具优势。由于Th17细胞可在TGFβ、IL-1β、IL-23和IL-6等部分或全部细胞因子组合的诱导下生成，我们测试了不同的细胞因子组合。在本研究中，当四种极化细胞因子均存在时，IL-17A的产生水平更高。此外，我们优化了培养周期，缩短培养时间，以确保在培养期间仅需一次转染即可。虽然该四天方案可加快实验进程并仅需一次转染，但也可延长培养时间以进一步提高IL-17A的产量。对于其他原代T细胞亚群的最佳分化，可能需要更长的培养周期。由于此类转染为瞬时转染，在较长的培养周期中可能需要多次转染。我们建议在约3天后通过再次电穿孔补充小RNA试...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院基金（R01HL109102、P01HL107202、U19CA179512、F31HL131361）、白血病与淋巴瘤学会学者奖（K.M.A.）以及美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）医学科学家培训项目（基金号 #T32GM007618）（M.M.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗人 IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | 克隆：eBio64DEC17 |
| 抗人 IFNγ FITC | ebioscience | 11-7319-82 | 克隆：4S.B3 |
| 抗人 CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | 克隆：SK3 |
| 小鼠抗人 CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | 克隆：11A9 |
| 抗人 RORγt AF647 | BD biosciences | 563620 | 克隆：Q21-559 |
| 抗人 CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | 克隆：2D1 |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | ebioscience | 00-5523-00 | 用于细胞内转录因子流式细胞术染色 |
| Hu FcR 结合抑制剂（纯化） | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T 细胞扩增培养基 | Stemcell Technologies | 10981 | "无血清基础培养基" |
| MACS CD28 纯化级功能性抗体，人源 | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | 克隆：15E8 |
| 抗人 CD3 纯化抗体 | UCSF 单克隆抗体核心 | N/A | 克隆：OKT-3 |
| LEAF 纯化抗人 IL-4 | Biolegend | 500815 | 克隆：MP4-25D2 |
| 抗人 IFNγ，功能性纯化级 | ebioscience | 16-7318-85 | 克隆：NIB42 |
| 重组人 IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| 重组人 IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| 重组人 TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| 重组人 IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME 对照池，非靶向 #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool 人 RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool 人 PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads 未接触人 CD4 T 细胞试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 11346D | 人 CD4+ T 细胞分离试剂盒 |
| Neon 转染系统 | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | 下一代电穿孔仪器 |
| Neon 转染系统 10 μL 试剂盒 | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| 重悬缓冲液 T | ThermoFisher Scientific | 试剂盒内提供 (MPK1096) | "转染重悬缓冲液" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | 密度梯度介质 |
| Corning 6 孔组织培养处理板 | Corning | 3516 | 平底板 |
| Corning 48 孔组织培养处理板 | Corning | 3548 | 平底板 |
| BD Pharm Lyse 溶解缓冲液，10x | BD biosciences | 555899 | 使用前需用蒸馏水配制成 1x 溶液 |
参考文献
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
- Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
- Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
- Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
- Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
- Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).
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