利用下一代电穿孔技术在原代人Th17细胞中进行小RNA转染

摘要

下一代电穿孔技术是一种高效的方法，可用于将小RNA转染至人Th17细胞中，从而改变基因表达和细胞行为。

摘要

CD4⁺ T细胞可根据周围细胞因子环境的不同，分化为多种效应性辅助T细胞亚群。Th17细胞可由初始CD4⁺ T细胞 体外 通过在极化性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-23和TGFβ存在的情况下激活T细胞，可诱导其分化为Th17细胞。Th17细胞在抵御胞外细菌和真菌感染的免疫应答中发挥关键作用，但其异常活化也与多种自身免疫性和炎症性疾病相关。Th17细胞的特征包括表达趋化因子受体CCR6，以及由其主调控转录因子RORγt和特征性效应细胞因子IL-17A所定义。优化的Th17细胞分化培养条件，有助于在可控环境中深入研究人类T细胞生物学的分子机制，同时也为通过RNA干扰技术或导入microRNA（miRNA）模拟物及抑制剂来探究特定基因及其表达程序的功能提供了实验平台。本实验方案提供了一种简便、可重复且高效的方法，利用新一代电穿孔设备，对正在分化的原代人类Th17细胞进行小RNA的瞬时转染。

引言

CD4⁺ T细胞是适应性免疫应答的关键调控者。初始CD4⁺ T细胞能够分化为多种不同的效应T细胞（例如 Th1、Th2、Th17 等等。），每种亚型具有其独特的细胞因子和转录因子谱，具体特征取决于局部微环境¹T细胞的谱系分化决策对于保护性免疫和自身耐受均至关重要。Th17细胞是T细胞的一个亚群，能够抵御胞外细菌和真菌感染，但其异常反应也与多种自身免疫性和炎症性疾病（如多发性硬化症和银屑病）的发病机制相关。^2,3人类Th17细胞可由初始CD4⁺ T细胞 体外 通过为它们提供适当的极化环境⁴已使用多种细胞因子组合（包括IL-1β、IL-23、TGFβ和IL-6）来诱导人Th17细胞的分化。人Th17细胞表达趋化因子受体CCR6，该受体常用于鉴定此类细胞群体，并以其主要转录因子RORγt（由RORC基因编码）的表达为特征。 RORC)^5,6Th17细胞能够表达多种细胞因子，但IL-17A是这类细胞谱系特征性的效应细胞因子。我们检测了所有三种与Th17相关的标志物（CCR6、R....

方案

本方案遵循加州大学旧金山分校（UCSF）关于人类研究伦理的指南。

1. T细胞培养的准备、CD4⁺ T细胞的分离及Th17极化

1. 第0天，在含有钙和镁的PBS中，用抗人CD3（2 µg/mL）和抗人CD28（4 µg/mL）对6孔组织培养板进行包被，每孔加入1.5 mL，于37 °C孵育至少2小时。
   1. 或者，可在4 °C过夜包被，并用封口膜包裹培养板。
2. 按照制造商说明书，通过密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞（CBMCs）。
   注意：操作人血时应小心谨慎，并确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），以避免接触血液传播病原体的风险。
3. 单个核细胞分离并洗涤后，使用商用的人CD4⁺ T细胞分选试剂盒通过阴性选择法进行人CD4⁺ T细胞的分离。
   备注：若单个核细胞分离后存在红细胞污染，可在CD4⁺ T细胞分离步骤前选择性地进行红细胞裂解。将单个核细胞重悬于1 mL分离缓冲液（含2% FBS的PBS）中，加入5 mL 1×裂解液，室温孵育15分钟。然后加入5 mL分离缓冲液，于4 °C以300 × g离心5分钟以收集细胞。
   1. 将单个核细胞以50 × 10⁶....

结果

成功电转染人Th17细胞的可靠体系的第一步是建立稳定的 体外 分化的Th17细胞培养物。在Th17极化条件下培养的T细胞表达趋化因子受体CCR6和转录因子RORγt（图1A，左侧）。当T细胞在非极化（ThN）条件下培养时，这些标志物未表达。图1A， 右）。在Th17极化条件下培养的T细胞在再次刺激后也产生IL-17A（图1B，左侧）但在ThN条件下则无此现象（图1B，右侧）。在转染小RNA后，Th17细胞分化仍可发生，但在某些实验中可观察到IL-17A产生的频率有所降低（图1C）。小RNA转染对细胞因子产生的影响表明，在每个实验中使用化学性质匹配的小RNA对照进行比较具有重要意义。重要的是，小RNA转染后细胞活力得以维持，通常高于70%（图1D).

讨论

本方案提供了一种改进的方法，用于将小RNA递送至人Th17细胞。尽管本实验中使用了人Th17细胞，但该小RNA电穿孔方法也可适用于其他原代人T辅助细胞亚群，如Th1、Th2和Treg细胞。然而，该方法在初始CD4⁺ T细胞中效果不佳，因此转染前必须在体外培养中预先激活细胞。在本方案中，我们首先优化了in vitro培养体系以提高IL-17A的产生水平。其中最关键的因素是基础培养基。我们发现，与传统含血清培养基相比，无血清培养基在诱导产生IL-17A的人Th17细胞方面更具优势。由于Th17细胞可在TGFβ、IL-1β、IL-23和IL-6等部分或全部细胞因子组合的诱导下生成，我们测试了不同的细胞因子组合。在本研究中，当四种极化细胞因子均存在时，IL-17A的产生水平更高。此外，我们优化了培养周期，缩短培养时间，以确保在培养期间仅需一次转染即可。虽然该四天方案可加快实验进程并仅需一次转染，但也可延长培养时间以进一步提高IL-17A的产量。对于其他原代T细胞亚群的最佳分化，可能需要更长的培养周期。由于此类转染为瞬时转染，在较长的培养周期中可能需要多次转染。我们建议在约3天后通过再次电穿孔补充小RNA试.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗人 IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	克隆：eBio64DEC17
抗人 IFNγ FITC	ebioscience	11-7319-82	克隆：4S.B3
抗人 CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	克隆：SK3
小鼠抗人 CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	克隆：11A9
抗人 RORγt AF647	BD biosciences	563620	克隆：Q21-559
抗人 CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	克隆：2D1
Foxp3/转录因子染色缓冲液套装	ebioscience	00-5523-00	用于细胞内转录因子流式细胞术染色
Hu FcR 结合抑制剂（纯化）	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T 细胞扩增培养基	Stemcell Technologies	10981	"无血清基础培养基"
MACS CD28 纯化级功能性抗体，人源	Miltenyi Biotec	130-093-375	克隆：15E8
抗人 CD3 纯化抗体	UCSF 单克隆抗体核心	N/A	克隆：OKT-3
LEAF 纯化抗人 IL-4	Biolegend	500815	克隆：MP4-25D2
抗人 IFNγ，功能性纯化级	ebioscience	16-7318-85	克隆：NIB42
重组人 IL-23	Peprotech	200-23
重组人 IL-1β	Peprotech	200-01B
重组人 TGF-β1	Peprotech	100-21C
重组人 IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME 对照池，非靶向 #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool 人 RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool 人 PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads 未接触人 CD4 T 细胞试剂盒	ThermoFisher Scientific	11346D	人 CD4+ T 细胞分离试剂盒
Neon 转染系统	ThermoFisher Scientific	MPK5000	下一代电穿孔仪器
Neon 转染系统 10 μL 试剂盒	ThermoFisher Scientific	MPK1096
重悬缓冲液 T	ThermoFisher Scientific	试剂盒内提供 (MPK1096)	"转染重悬缓冲液"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	密度梯度介质
Corning 6 孔组织培养处理板	Corning	3516	平底板
Corning 48 孔组织培养处理板	Corning	3548	平底板
BD Pharm Lyse 溶解缓冲液，10x	BD biosciences	555899	使用前需用蒸馏水配制成 1x 溶液