对在Xenopus卵提取物中重建β-catenin降解过程一文进行了更正。在发表时,存在若干使用了不正确体积单位标注的情况。这些情况已更正如下:
2.1.2. 将提取物加入到与抗体沉淀或亲和磁珠体积的1/10相等的量中(例如,将20 ml压紧的珠子加入200 ml提取物中)。为尽量减少提取物的稀释,在加入提取物之前,使用带有长锥形尖端的凝胶上样吸头尽可能吸除珠子中的液体。
2.2.5. 将适量体积的样品分装至预冷的微量离心管中,置于冰上用于降解实验。对于放射性标记的 β-catenin 降解实验,每个时间点需吸取 2–5 ml 提取物。
3.2.3. 在指定时间点,取出 1–5 ml 样品,立即与 5 倍体积的 SDS 上样缓冲液混合以终止反应。为确保降解反应完全终止,需轻轻振荡离心管数次,并剧烈涡旋混匀。
3.2.4. 进行SDS-PAGE/放射自显影。每个时间点/泳道上样等体积(约50 mg蛋白)的提取物。β-catenin在Xenopus卵提取物中的降解应表现为放射性标记的β-catenin条带信号随时间推移而减弱(见图2)。如有需要,可使用ImageJ、ImageQuant或其他首选成像软件对结果进行定量分析。
4.2.2. 加入 体外-将4.1中制备的β-catenin-luciferase融合蛋白转染至已准备好的细胞中 非洲爪蟾 反应混合物(来自步骤2.2)置于冰上,并按照3.2.1节所述充分混匀。注意:加入提取物中的β-catenin荧光素酶活性通常为每毫升提取物20–50,000相对发光单位(RLU/mL)(依据4.1.2节测得结果)。起始信号应约为100,000 RLU(2–5 mL的 体外-翻译的β-catenin-荧光素酶融合蛋白)
至:
2.1.2. 将提取物加入到与抗体沉淀或亲和磁珠体积的1/10相等的量中(例如,将20 µl沉淀的珠子加入200 µl提取物中)。为尽量减少提取物的稀释,在加入提取物之前,使用带有长锥形尖端的凝胶上样吸头尽可能吸除珠子中的液体。
2.2.5. 将适当体积的样品分装到预冷的微量离心管中,置于冰上用于降解实验。对于放射性标记的 β-catenin 降解实验,每个时间点取 2–5 µl 提取物。
3.2.3. 在指定时间点,取出 1–5 µl 样品,立即与 5 倍体积的 SDS 上样缓冲液混合以终止反应。为确保降解反应完全终止,需轻轻弹击离心管数次,并剧烈涡旋振荡。
3.2.4. 进行 SDS-PAGE/放射自显影。每个时间点/泳道上样等量的 1 µl 提取物(约含 50 mg 蛋白)。β-catenin 在 Xenopus 卵提取物中的降解应表现为放射标记的 β-catenin 条带强度随时间推移而减弱(图 2)。如需定量结果,可使用 ImageJ、ImageQuant 或其他首选成像软件进行分析。
4.2.2. 加入 体外-将翻译后的β-catenin-luciferase融合蛋白(来自4.1)转入已制备的 非洲爪蟾 将2.2中的反应混合物置于冰上,按3.2.1步骤充分混匀。注意:加入提取物中的β-catenin荧光素酶活性通常为20–50,000相对发光单位(RLU)/µl提取物体积(依据4.1.2测得结果)。起始信号应约为100,000 RLU(对应2–5 µl的 体外-翻译的β-catenin-荧光素酶融合蛋白)