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S100A12的表达、纯化及其抗菌活性

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DOI：

10.3791/55557

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2017年5月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life and Physical Sciences, Fisk University, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs, 3Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University Medical School, 4Department of Biochemistry, Vanderbilt University

本文内容

摘要

本文介绍了一种表达和纯化S100A12（钙粒蛋白C）的方法，并描述了一种检测其对人类病原体H. pylori抗菌活性的实验方案。

摘要

钙粒蛋白是一类重要的天然免疫介质，属于EF手家族钙结合蛋白中的S100蛋白类。某些S100蛋白能够以高亲和力结合过渡金属，并在称为“营养免疫”的过程中有效地将这些金属隔离，使其无法被侵入的微生物病原体利用。S100A12（EN-RAGE）可结合锌和铜，在巨噬细胞和中性粒细胞等天然免疫细胞中含量丰富。本文报道了一种优化的方法，用于表达、富集和纯化具有活性并能结合金属的S100A12蛋白。将该蛋白应用于细菌生长和存活分析发现，S100A12对细菌病原体Helicobacter pylori具有抗菌活性。这种抗菌活性依赖于S100A12的锌结合能力，其通过螯合营养性锌，使需要锌进行生长和增殖的H. pylori处于缺锌状态，从而抑制其生长。

引言

S100蛋白是一类属于EF-手型钙结合蛋白家族的蛋白质，具有多种多样的功能1。它们以组织和细胞特异性的方式表达，调控广泛的细胞功能2,3。与其他钙结合蛋白不同的是，S100蛋白兼具细胞内和细胞外功能4,5。在细胞内，Ca2+的结合会诱导构象变化，暴露出一个疏水表面，从而特异性地结合靶蛋白伴侣6。这种细胞内机制调控着细胞增殖、分化和能量代谢等重要过程。在细胞外环境中，S100蛋白表现出两种功能7。其一，它们作为损伤相关分子模式（DAMP）蛋白，通过与模式识别受体相互作用，启动促炎性免疫反应8,9。此外，S100蛋白家族中的多个成员能够螯合过渡金属，这一功能在一种称为营养免疫的过程中起到剥夺微生物病原体必需金属的作用10,11。

S100A12（也称为钙粒蛋白C和EN-RAGE）在巨噬细胞和中性粒细胞中高表达，已被鉴定为炎症性疾病的潜在生物标志物12,13。除了在其EF-手结构域结合钙离子外，S100A12在二聚体界面的两端还具有两个高亲和力的过渡金属结合位点14,15。每个结合位点由三个组氨酸残基和一个天冬氨酸残基组成，能够螯合锌或铜16,17。最近，我们报道了S100A12依赖性的锌饥饿在调控幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）生长及促炎性毒力因子活性中具有重要作用18。

H. pylori 感染了全球约一半人口的胃部，可以说是最成功的一种细菌病原体19。感染 H. pylori 可导致多种严重的胃部疾病，包括胃炎、消化性溃疡和十二指肠溃疡、黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤以及侵袭性胃腺癌（胃癌）。胃癌是全球非贲门癌相关死亡的首要原因，而胃癌最主要的危险因素就是 H. pylori 感染。

H. pylori 尽管受到机体对病原体的强烈免疫反应，仍能在胃部生态位中持续存在，这凸显了深入理解控制该细菌感染的免疫机制的重要性20,21,22,23。H. pylori 相关的炎症特征表现为大量多形核细胞（即中性粒细胞）浸润，这些细胞在感染部位释放一系列抗菌蛋白，包括 S100A1218,24,25。为了理解宿主与病原体之间复杂相互作用的机制，我们致力于优化 S100A12 的纯化技术，并利用该蛋白研究其对该临床重要病原菌的抗菌作用。以下方案概述了一种改进的 S100A12 纯化方法，可获得具有生物学活性的蛋白，能够高亲和力结合营养性金属离子，并将其螯合脱离入侵的微生物。此外，以下方法还强调了该蛋白作为关键试剂在研究天然抗菌分子如何限制细菌病原体生长机制中的应用价值。

S100A家族蛋白作为先天免疫系统的重要分子，参与免疫信号传导和宿主防御，近年来受到广泛关注27。其中研究最为深入的是钙卫蛋白（MRP-8/14、钙粒蛋白A/B、S100A8/A9）28,29,30。钙卫蛋白是一种与中性粒细胞相关的蛋白，由S100A8和S100A9两个亚基组成异源二聚体，并在二聚体界面结合过渡金属31。研究表明，钙卫蛋白具有两个金属结合位点：位点1可结合Zn2+、Mn2+或Fe2+，位点2可结合Zn2+31,32。大量研究报道显示，钙卫蛋白对多种病原体具有抗菌活性，包括Staphylococcus aureus、Candida albicans、Acinetobacter baumannii、Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli和H. pylori，其抑制作用归因于钙卫蛋白的金属螯合活性25,28,29。

先前的研究表明，钙卫蛋白对H. pylori具有多种作用，包括改变外膜中脂质A的结构、抑制cag型IV型分泌系统（该系统是H. pylori中主要的促炎性毒力因子）、诱导生物膜形成，并以剂量依赖的方式抑制H. pylori的生长和存活能力25,33。此外，遗传学和生化实验揭示，钙卫蛋白对H. pylori的抗菌活性主要源于其结合营养性锌的能力25。H. pylori的生长和增殖需要锌，这一点已通过先前使用化学成分明确培养基的研究得以证实，该研究确定了该病原体增殖所需的微量营养素34。此外，在H. pylori感染的组织中钙卫蛋白含量极为丰富，并与中性粒细胞浸润相关，表明宿主可能在感染及后续炎症过程中利用钙卫蛋白作为一种抗菌防御策略25,35。

近期基于非偏倚性蛋白质组学筛选技术的研究证据表明，在活性氧大量存在的条件下，钙卫蛋白会发生翻译后修饰，从而改变其六组氨酸结合位点，进而抑制该蛋白的金属结合活性36。因此，我们推测，在众多S100A家族蛋白中，其他成员也可能具有辅助性金属螯合功能。我们选择S100A12进行深入研究，原因是该蛋白未在前述翻译后修饰筛选实验中被检出，具有结合锌的能力，且在来源于幽门螺杆菌（H. pylori）感染个体的人体组织中含量丰富。

我们的研究结果表明，S100A12 能够抑制 H. pylori 以剂量依赖性方式影响G27菌株的生长和存活能力 H. pylori，且该蛋白的抗菌活性可通过添加过量的营养性锌而被逆转。这项工作补充了我们之前的研究结果，表明S100A12对PMSS1和7.13菌株具有抗菌活性 H. pylori，表明其对多种临床分离株和实验室适应菌株具有广谱抗菌活性 H. pylori18综上所述，这些结果证实了S100A12通过营养免疫机制控制细菌生长与增殖的重要性。未来针对这一重要宿主-细菌相互作用的研究可包括利用S100A12的活性以减少宿主组织中的细菌负荷，或明确该蛋白在免疫信号传导中的作用。 H. pylori 感染

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方案

1. S100A12 的表达

  1. 使用标准热激方法将 pGEMEX-S100a12 质粒转化至 BL21 DE3 感受态细胞18。在冰上向 50 µL 细菌中加入 1 至 5 µL 质粒，置于微量离心管中，孵育 20 分钟。
  2. 在 42 °C 下热激 30 秒。
  3. 将细胞置于冰上孵育 2 分钟。
  4. 向细胞中加入 500 µL SOC 培养基，在 37 °C 下以 250 rpm 的转速在摇床中振荡培养 1 小时。
  5. 取 150 µL 转化产物涂布于 LB-琼脂培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）。在 37 °C 下孵育 12–16 小时。
  6. 挑取单菌落，接种至 2 mL LB 培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）中。
  7. 在 37 °C 下以 300 rpm 的转速在摇床中振荡培养 4–6 小时，OD600 应达到 1–3 吸光度单位。
  8. 将 500 µL 起始培养物接种至 50 mL ZYM-5052 自诱导培养基26（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）中。为获得最佳通气效果和最大表达量，使用 250 mL 带挡板的锥形瓶，在 37 °C 下以 300 rpm 振荡培养 24 小时。
  9. 将细菌悬液转移至离心管中，在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 10 分钟，收集菌体沉淀。
  10. 弃去上清液，记录样品信息，并将菌体沉淀在 -80 °C 下保存。样品可稳定保存数年。

2. 使用低压色谱法纯化 S100A12

  1. 将细胞重悬于 30 mL 的 20 mM Tris（pH 8.0）中。
  2. 在冰上对悬液进行超声处理以裂解细胞。使用约 20 W 输出功率，以 5 秒开启、5 秒关闭为一个循环，持续 5 分钟。
  3. 将溶液转移至高速离心管中。在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心 30 分钟，澄清细胞裂解物。
  4. 倾去上清液并转移至洁净的 100 mL 聚丙烯烧杯中。将烧杯置于冰上冷却溶液。加入搅拌子，并缓慢加入 11.20 g 硫酸铵。让溶液在冰上继续搅拌 1 小时。此步骤将形成 60% 的硫酸铵溶液，使大多数 E. coli 内源性蛋白质沉淀，而 S100A12 保持可溶状态。
  5. 在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心 20 分钟，使沉淀的蛋白质形成沉淀物。
  6. 倾去上清液并转移至透析袋（截留分子量 3,500 kDa）中。在 4 °C 条件下，用 1 L 的 20 mM Tris（pH 8.0）缓冲液进行透析。更换透析缓冲液两次，每次间隔 4 小时。
  7. 阴离子交换层析
    1. 在低压系统上进行层析，典型流速为 1 mL/min。
    2. 用 10 mL 的 20 mM Tris（pH 8.0）平衡 5 mL Sepharose 柱。
    3. 使用样品泵上样约 40 mL 的 S100A12 溶液（收集穿流液）。
    4. 用 10 mL 的 20 mM Tris（pH 8.0）洗涤层析柱。
    5. 使用 0–30% 的梯度（B 缓冲液为 20 mM Tris，pH 8.0，含 1 M NaCl）对层析柱进行洗脱，总体积为 19 个柱体积（CV，95 mL）。收集 5 mL 的组分。
    6. 取每管 10 µL 等分试样，使用 MES SDS-PAGE 配合考马斯亮蓝染色进行分析。以恒定电压（20 V/cm）电泳 30 分钟。
    7. 合并含有 S100A12 的组分。S100A12 在变性凝胶上的迁移分子量约为 10 kDa。
    8. 使用超滤装置（截留分子量 10 kDa）将组分浓缩至 5 mL。在约 8 分钟内以 3,000 × g 离心，取上层组分。
  8. 凝胶过滤层析
    1. 用 1 个柱体积（120 mL）的 20 mM Tris（pH 8.0）、100 mM NaCl 缓冲液平衡 S75 柱。
    2. 注入 < 5 mL 浓缩后的 S100A12 组分（来自离子交换层析）。
    3. 以 1 mL/min 的流速在 120 mL 范围内进行洗脱，收集 5 mL 的组分。
    4. 取每管 10 µL 等分试样，使用 SDS-PAGE 配合考马斯亮蓝染色进行分析。通过 Western 印迹或质谱法验证蛋白质身份（单体亚基的计算分子质量为 10,575.0 Da，实测值为 10575.4 Da）。
  9. 合并组分
    1. 使用分光光度计测定蛋白质在 A280 处的吸光度，以 SEC 缓冲液作为空白对照。S100A12 同源二聚体的计算消光系数为 5960 M-1 cm-1。
      注：每 50 mL 培养物通常可获得 35–45 mg 的 S100A12。
    2. 将 S100A12 分装至 1.5 mL 微量离心管中（每管 1 mg），在液氮中快速冷冻后于 -80 °C 保存。

3. 抗微生物活性检测

  1. 将幽门螺杆菌（H. pylori）G27菌株划线接种于添加5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板（血琼脂平板）上。在37 °C、含5%二氧化碳的空气中培养2-3天。
  2. 将幽门螺杆菌（H. pylori）接种至添加1×胆固醇的布氏肉汤中。在37 °C、含5%二氧化碳的空气中，以250 rpm振荡培养过夜。
  3. 将幽门螺杆菌（H. pylori）按1:10比例稀释至50%布氏肉汤和50%钙卫蛋白缓冲液中，加入1×胆固醇，分别培养于仅含基础培养基，或添加100 µM氯化锌及0、100或1,000 µg/mL纯化S100A12的培养基中。在37 °C、含5%二氧化碳的空气中，以250 rpm振荡培养过夜。
  4. 次日，进行系列稀释后涂布于血琼脂平板。在37 °C、含5%二氧化碳的空气中培养2-3天，使细菌菌落生长。计数菌落形成单位，以计算在有或无S100A12和/或外源性锌条件下细菌的生长情况。

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结果

S100A12 的表达与纯化

三步纯化法从 50 mL 细菌培养物中获得了约 40 mg 的重组 S100A12。第一步为硫酸铵沉淀法去除内源性杂质。 E. coli 蛋白质。随后进行阴离子交换层析（图1A）。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE追踪蛋白质图1B). 纯化过程的最后一步是合并含有 S100A12 的组分，进行凝胶过滤层析，该方法依据蛋白质的分子量和形状进行分离。图2A）。S100A12 是一种同源二聚体（每个亚基含 92 个氨基酸），总分子量约为 21 kDa。通过尺寸排阻色谱收集的组分经 SDS-PAGE 分析，并通过考马斯亮蓝染色显影（图2B).

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讨论

本文介绍了一种高效表达和纯化人源S100A12蛋白的实验方案。E. coli表达系统是生产重组蛋白最常用的工具，尤其适用于生化与生物物理研究中所需毫克级蛋白的制备。本方案的一个关键改进是采用自诱导培养基26，与标准的LB培养基相比，该方法可使纯化蛋白的产量提高近三十倍18。此外，自诱导培养基显著简化了蛋白表达的操作流程。使用传统培养基时，必须持续监测菌液生长状态，以便在对数生长期加入诱导剂；而使用自诱导培养基则无需监测倍增时间，菌液可直接培养至饱和状态。在自诱导培养基的初始生长阶段，E. coli以葡萄糖作为碳源；当葡萄糖耗尽后，细菌会转而利用乳糖作为碳源，从而启动蛋白表达26。自诱导培养基的组分经过精确优化，可支持高密度菌体生长，进而提高重组蛋白的表达水平。根据我们对S100A12蛋白的实验经验，自诱导培养基能显著增加目标蛋白的表达量，但需注意该效果可能因蛋白而异，应通过实验加以验证。

E. c...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究得到了美国退伍军人事务部职业发展奖1IK2BX001701、美国国家转化科学促进中心通过国家卫生研究院转化科学奖UL1TR000445、美国国家科学基金会奖号1547757和1400969，以及美国国立卫生研究院资助项目GM05551的支持。本研究内容的全部责任由作者承担，不代表国家转化科学促进中心或美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
S100A12 表达
表达细胞
BL 21 (DE3) 感受态细胞New England BiolabsC25271
自诱导培养基组分
酵母提取物Research Products InternationalY20020-250.0
NaClResearch Products InternationalS23020-500.0
胰蛋白胨Research Products InternationalT60060-250.0
FeCl3Sigma-AldrichF2877
MgSO4Research Products InternationalM65240-100.0
Na2HPO4Research Products InternationalS23100-500.0
KH2PO4Research Products InternationalP41200-500.0
NH4ClResearch Products InternationalA20424-500.0
Na2SO4Research Products InternationalS25150-500.0
甘油Research Products InternationalG22020-1.0
D-葡萄糖Research Products InternationalG32040-500.0
乳糖Sigma-AldrichL2643
筛选剂
氨苄青霉素Research Products InternationalA40040-5.0
S100A12 纯化
AKTA Start 层析系统GE29-220-94
HiTrap Q Sepharose Fast FlowGE17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HRGE17-1166-01
Nanodrop Lite 分光光度计Thermo Fisher ScientificND-LITE
Tris 碱Research Products InternationalT60040-1000.0
H. pylori 培养
血琼脂平板Lab Supply CompanyBBL221261
布鲁氏菌肉汤Sigma-AldrichB3051
胆固醇（250倍）Thermo Fisher Scientific12531018
NaClSigma-Aldrich793566
CaCl2Sigma-AldrichC4901
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250
Tris 碱Sigma-AldrichT1503
氯化锌Sigma-Aldrich229997

参考文献

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