本论文描述了一种利用PEI/MNP载体高效、非病毒性地将miR递送至内皮细胞并实现其磁化的方法。因此，该方法除了可实现遗传修饰外，还可实现磁性细胞导向和磁共振成像（MRI）检测。该技术可用于改善治疗性细胞产品的特性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
迄今为止，心血管疾病（CVD）的可用外科和药物治疗手段有限，且多为对症治疗。与此同时，基因治疗和细胞治疗已成为治疗CVD极具前景的替代策略。然而，由于缺乏合适的基因递送系统，基因治疗的广泛应用受到极大限制。开发适当的基因递送载体可为当前细胞治疗面临的挑战提供解决方案。特别是通过适当的细胞工程手段，有望克服现有方法中存在的诸多缺陷，例如转导效率有限以及细胞在损伤器官中的滞留率低等问题。即， 在移植前对细胞进行遗传学修饰。本方案描述了一种利用聚乙烯亚胺超顺磁性磁性纳米颗粒（PEI/MNP）递送载体高效、安全地瞬时修饰内皮细胞的方法。同时，本文定义了细胞表征的算法与相关方法。该方法已成功将微小RNA（miR）递送至人脐静脉内皮细胞（HUVECs）胞内，且未影响细胞活力、功能或细胞间通讯。此外，该策略被证实可对导入的外源性miR产生显著的功能性效应。重要的是，采用该MNP基载体可实现细胞磁化，从而具备磁性靶向及无创MRI示踪的可能性。该技术有望为可磁引导、基因工程化细胞治疗提供基础，并实现MRI无创监测。
引言
基因治疗和细胞治疗是强大的工具，有望解决当前心血管疾病（CVD）治疗中的挑战。尽管这两种方法目前均已在临床试验中进行测试，但尚未准备好广泛应用于临床1。值得注意的是，应对基因治疗和细胞治疗挑战的一个共同策略是开发适用于临床应用的多功能基因递送载体。缺乏安全且高效的基因递送系统是基因治疗面临的主要问题。同时，在细胞移植前对细胞产物进行基因工程改造，有望克服细胞治疗中的严重挑战，例如效率低下（例如，在心脏领域，干细胞移植后仅实现约 5% 的功能改善1）以及在损伤部位的滞留/植入效果差（即，无论给药途径如何，细胞滞留率在给药后数分钟至数小时内即降至 5 - 10% 以下2,3,4）。
迄今为止，病毒载体在效率方面远超非病毒系统，因此在临床试验中得到了更广泛的应用（约67%）5。然而，病毒载体存在严重的风险，例如免疫原性（及其引发的炎症反应，可能导致严重并发症）、致癌性，以及所携带遗传物质大小受限等问题6。由于这些安全性问题以及病毒载体生产成本较高，在某些情况下使用非病毒系统....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
用于细胞分离的人类脐带已获取 产后 来自知情且健康的女性，她们根据《赫尔辛基宣言》签署了书面同意书，允许将其材料用于研究。罗斯托克大学伦理委员会已批准本研究（注册编号：A 2011 06，延期至2013年9月23日）。
1. 转染复合物的制备
- 聚乙烯亚胺（PEI）的生物素标记
- 在室温（RT）下，将支化型PEI溶于超纯水中，避光条件下以300–400 rpm转速磁力搅拌24小时，得到0.18 mM的溶液。将该溶液于4 °C保存。
- 测定所得溶液中伯氨基的浓度21,22.
- 使用2% 茚三酮试剂溶液作为胺类检测试剂23 将100 µL预稀释样品（用超纯水按1:200稀释）与75 µL茚三酮试剂混合，80 °C孵育30分钟。冷却后加入100 µL 50%乙醇以稳定反应体系，随后在分光光度计中于550 nm处测定吸光度。
- 使用甘氨酸绘制标准曲线。
- 配制0.1 M氨基-N储备液（将0.75 g甘氨酸溶于100 mL去离子水中），并依次稀释为1:1、1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:100、1:200、1:400和1:600的稀释液。按照步骤....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案的主要目的是制备具有磁响应性的miR修饰细胞，并对其进行精确表征（图1）。最终应获得转染效率高、可响应磁性筛选与导向，并可通过磁共振成像（MRI）检测的细胞。
首先，通过内皮细胞标志物 CD31（PECAM）的典型染色（图 2A）以及细胞在适当基底膜基质上形成管状结构的能力，确认了分离获得的 HUVEC 的身份（图 2B）。所获得的细胞对 PEI/MNP 介导导入的 miR 摄取效率很高；显微观察显示，转染后 24 小时，所有细胞均呈现标记 miR（Cy3）的阳性信号（图 3A）。重要的是，与未处理细胞相比，未观察到细胞死亡（图 3B），且细胞形态保持正常（图 3A）。共聚焦激光扫描显微镜观察显示，Cy3-miR 的信号主要位于细胞内部。此外，利.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案介绍了制备负载超顺磁性纳米颗粒的基因工程细胞，并实现其磁控定向引导的方法。成功应用该策略可解决细胞治疗中的一些难题，例如细胞在损伤区域的滞留率低和植入效果差2,3,4，从而提供一种可靶向的细胞移植产品。此外，同时引入适当筛选的遗传物质可增强细胞特性，进而提高其功能益处41。
本实验方案以HUVECs作为模型细胞进行开发。已知这些细胞转染难度较大，且易受毒性影响18,19,20。经PEI/MNP转染后，荧光标记miR的摄取率超过95%，该水平通常可由基于PEI的载体以及常用的阳离子脂质转染试剂（例如 Lipofectamine）实现
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的相互竞争的财务利益。
致谢
我们感谢德国罗斯托克大学电子显微镜中心的 G. Fulda 在获取超顺磁性纳米颗粒的透射电子显微镜图像及其X射线分析方面提供的技术支持。在罗斯托克跨学科技术中心（RTC Rostock）开展的研究工作得到了德国联邦教育与研究部（资助编号：0312138A、316159 和 VIP+03VP00241）、梅克伦堡-前波美拉尼亚州政府以及欧盟结构基金（ESF/IV-WM-B34-0030/10 和 ESF/IV-BM-B35-0010/12）的支持，同时也获得了德国研究基金会（DFG，项目号 DA 1296-1）、Damp 基金会和德国心脏基金会（F/01/12）的资助。Frank Wiekhorst 的研究得到了欧盟第七框架计划“Nanomag”项目（FP7-NMP-2013-LARGE-7）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素 | Thermo Scientific | 21335 | |
| PD-10 脱盐柱 | GE Healthcare | 17085101 | 含 Sephadex G-25 Medium |
| 2% 茚三酮试剂溶液 | Sigma Aldrich | 7285 | |
| 甘氨酸 | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Pierce 生物素定量试剂盒 | Thermo Scientific | 28005 | |
| 微量板读数仪 Model 680 | Bio-Rad | ||
| 链霉亲和素磁性微球 | Promega | Z5481 | |
| Millex-HV PVDF 滤膜 | Merck | SLHV013SL | 0.45 µm |
| Libra 120 透射电子显微镜 | Zeiss | 加速电压 120 kV | |
| Sapphire X射线探测器 | EDAX-Amatek | ||
| 细胞培养塑料器皿 | TPP | ||
| NHS-酯 Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
| NHS-酯 Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
| Cy5 miRNA 标记试剂盒 | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| 生物素-Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| IV型胶原酶 Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
| 内皮细胞生长培养基 EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| 抗 PECAM-1 抗体 | Santa Cruz | sc-1506 | |
| MS MACS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 近红外活/死细胞染色试剂盒 | Thermo Scientific | L10119 | |
| Cy3 荧光标记 Pre-miR 阴性对照 | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" 或文稿中的 "Cyanine-miR3" |
| Pre-miR miRNA 前体分子 - 阴性对照 | Thermo Scientific | AM17110 | 文稿中称为 "scr-miR" |
| 抗 hsa-miR92a-3p 合成抑制剂 | Thermo Scientific | AM10916 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 系统 | Zeiss | ||
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | 158127 | PBS 中的 4% 溶液 |
| DAPI 核染色剂 | Thermo Scientific | D1306 | |
| NucleoSpin RNA 提取试剂盒 | Machery-Nagel | 740955 | |
| mirVana miRNA 提取试剂盒 | Thermo Scientific | AM1560 | |
| TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒 | Thermo Scientific | 4366596 | |
| StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems | ||
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | Thermo Scientific | 4368814 | |
| hsa-miR-92a TaqMan 检测试剂 | Thermo Scientific | 000431 | 成熟 miRNA 序列：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
| FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
| ITGA5 TaqMan 检测试剂 | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
| RNU6B TaqMan 检测试剂 | Thermo Scientific | 001093 | |
| 18S rRNA 内参对照 | Thermo Scientific | 4333760F | |
| 明胶 | Sigma Aldrich | G7041 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | ||
| MACS 缓冲液 | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| 琼脂糖 | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 7.1 特斯拉动物 MRI 系统 | Bruker Corporation | A7906 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | 升级版，配备 AngiogenesisAnalyzer（NIH） | |
| MPS 设备 | Bruker Biospin | ||
| Matlab 软件 | Mathworks | ||
| 环形钕磁铁 | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm；剩磁约为 1.3 T，矫顽力 ≥ 955 kA/m |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒 | Thermo Scientific | C10340 | |
| FluorSave 封片剂 | Merck | 345789 | |
| 超声波清洗仪 | Bandelin electronic | 型号：RK 100 SH |
参考文献
- Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
- Zeng, L., Hu, Q., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
