Method Article

制备和体外磁化的表征的miR-改性内皮细胞

DOI:

10.3791/55567

⸱

May 2nd, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In This Article

Summary

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这个手稿描述的miR的有效的，非病毒递送通过PEI / MNP矢量和它们的磁化与内皮细胞。因此，除了遗传修饰，该方法允许用于磁性细胞的指导和MRI可检测性。该技术可以被用来改善的治疗性细胞产品的特性。

Abstract

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迄今为止，用于治疗心血管疾病的可用外科和药物治疗（CVD）是有限的，经常姑息。与此同时，基因和细胞的疗法可用于CVD处理极有希望的替代方法。然而，基因治疗的广泛临床应用极大地受到缺乏合适的基因递送系统的限制。的合适的基因递送载体的发展可以提供解决方案，以在细胞疗法目前的挑战。特别是，现有的缺点，例如，在受伤器官限定的效率和低的细胞保留，可以通过适当的细胞工程来克服移植（ 即遗传）之前进行。所提出的协议描述了使用聚乙烯亚胺的超顺磁性纳米颗粒（PEI / MNP）系递送载体的内皮细胞的有效且安全的瞬时变形。此外，算法和细胞表征方法定义。成功intracellu微RNA（MIR）到人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的拉尔递送已经在不影响细胞生存力，功能，或者细胞间的通信被实现。此外，这种方法被证明会导致导入的外源的miR强大的功能效果。重要的是，这种基于MNP-矢量的应用确保细胞磁化，伴随磁靶向和非侵入性的MRI跟踪的可能性。这可以提供对于可以非侵入性地监测与MRI磁性引导，遗传工程细胞疗法的基础。

Introduction

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基因和细胞治疗是必须要解决的CVD处理当前挑战的潜在的强大工具。尽管这两种方法，目前正在临床试验，他们还没有准备好广泛的临床应用1。值得注意的是，以解决基因和细胞治疗的挑战的共同方法是开发适合于临床应用的多官能基因递送载体。缺乏安全，高效的基因传递系统是基因治疗的主要关注点。同时，细胞产物的基因工程移植前可以克服细胞治疗的严重挑战，如低效率（ 例如，在心脏字段，只有约5％的功能改善，实现后干细胞移植1 ）和差保留/植入在损伤部位（ 即，细胞保留低于5 - 10％几分钟到几小时内口服ST-应用，无论给药途径2,3，4）。

迄今为止，病毒载体大大超过在效率，这导致了在临床试验中其广泛应用方面非病毒系统（〜67％）5。然而，病毒载体携带在携带的遗传物质6的尺寸严重的风险，如免疫原性（和随后的炎症反应，有严重的并发症），致癌性，和限制。由于这些安全问题和病毒载体的生产成本高，使用非病毒系统的是在某些情况下

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Protocol

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从谁根据赫尔辛基宣言给他们的书面同意使用这种材料的研究得知，健康的妇女获得了细胞分离人类脐带产后 。罗斯托克大学的伦理委员会批准了提交研究报告（登记号:2011年的06，延长2013年9月23日）。

1.转染复合物的制备

  1. 聚乙烯亚胺的生物素化（PEI）。
    1. 溶解在300磁力搅拌下支链PEI的超纯水中 - 400rpm下在室温（RT）24个小时并避光以获得0.18 1mM溶液。存储在4℃下该溶液中。
    2. 测量在所获得的溶液21中 ，22个伯氨基的浓度。
      1. 通过混合100μL的PR的使用2％茚三酮试剂溶液作为胺检测试剂23ediluted样品（1:200，用超纯水）和茚三酮试剂的75μL。在80℃下温育30分钟。冷却下来并添加100μL50％乙醇的用于稳定。测量在对吸收分光光度计550nm处的吸光度。
      2. 创建使用甘氨酸的标准曲线。
        1. 制备0.1M的氨基-N原液及其稀释液（在100mL的去离子水0.75克甘氨酸），1:1,1:5，1:10，1:20，1:40，1:80，1: 100，1:200和1:400，1:600。测量这些溶液作为步骤1.1.2.1和创建与上轴进行的浓度与吸光度的曲线图。

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Results

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所提出的协议的主要目的是产生磁响应的miR-修饰的细胞，并进行其精确的表征（ 图1）。其结果是，有效地转染的细胞中，响应于磁选择和指导和可检测的与MRI，应当获得。

首先，分离的内皮细胞的身份，通过与内皮细胞标记物CD31染色的典型（PECAM）（ 图2A）和通过以在适当的基底膜基质（ 图2B）的管的能力证实。将所得到的细胞拿起所述miR非常有效地引入由PEI / MNP;显微镜表明，所有的细胞均为阳性标记的miR（Cy3标记）24小时后转染（ 图3A）的信号。重要的是，没有细胞死亡被记录相比，未经处理的细胞（ 图3B），并且normal外观保持（ 图3A）。如共聚焦激光扫描显微镜观察，的Cy3的miR的信号被主要位于细胞内。此外，转染载体和miR的所.......

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Discussion

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生产装载有超顺磁性纳米颗粒和其进一步磁控制的指导基因工程细胞的呈现在当前协议。这种策略的成功应用允许的细胞治疗的一些困难，例如在受伤区域2，3，4低保留和植入差分辨率，通过对移植提供靶向细胞产物。此外，同时引入适当选择的遗传物质的可促进细胞特性，从而可以增加功能性益处41。

目前的协议已经开发了血管内皮细胞的一种模式。这些细胞被称为是难以转染和易受影响有毒18，19，20。该DEM典型地用基于PEI的载体获得的PEI / MNP转染后的荧光团标记的miR摄取onstrated水平超过95％，并且通常使用的基于阳离子脂质的转染试剂（ 例如，脂质体

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Disclosures

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我们有没有竞争经济利益透露。

Acknowledgements

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我们要感谢G·富尔达（电子显微镜中心，罗斯托克大学，德国）用于收购过滤顺磁纳米颗粒的TEM图像，并履行其X射线分析技术支持。在RTC罗斯托克进行的工作是由联邦教育与研究部德国（FKZ 0312138A，FKZ 316159和VIP + 03VP00241）和国家梅克伦堡 - 前波莫瑞州与欧盟结构基金（ESF / IV-WM-B34-支持0030/10和ESF / IV-BM-B35-0010 / 12）和由DFG（DA 1296-1），则湿热基金会和德国心脏基金会（F / 01/12）。弗兰克·威克霍斯特由欧盟第七框架计划的研究项目 "Nanomag" FP7-NMP-2013-大7的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素Scientific21335
PD-10 脱盐柱GE Healthcare17085101含有 Sephadex G-25 培养基
茚三酮试剂溶液 2%Sigma Aldrich7285
甘氨酸Sigma Aldrich410225
Pierce 生物素定量试剂盒Thermo Scientific28005
酶标仪 Model 680Bio-Rad
链霉亲和素 MagneSphere 顺磁性颗粒PromegaZ5481
Millex-HV PVDF 过滤器MerckSLHV013SL0.45 µm
Libra 120 透射电子显微镜蔡司加速电压 120 kV
蓝宝石 X 射线探测器EDAX-Amatek
细胞培养塑料TPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA 标记 IT 试剂盒Mirus BioMIR 9650
生物素 Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
IV 型胶原 GibcoThermo Scientific17104019
内皮生长培养基、EGM-2LonzaCC-3156 和CC-4176
青霉素/链霉素Thermo Scientific15140122100 U/mL、100 µg/mL
MatrigelBD Biosciences356234
抗 PECAM-1 抗体Santa Cruzsc-1506
MS MACS 色谱柱Miltenyi Biotec 130-042-201
近红外活/死细胞染色试剂盒ScientificL10119
Cy3 染料标记的 Pre-miR 阴性对照Thermo ScientificAM17120Cy3-miR"或"Cyanine-miR3"，手稿中的
Pre-miRNA 前体分子 - 阴性对照 Thermo Scientific在中AM17110"scr-miR"&
nbsp;Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 系统蔡司
多聚甲醛Sigma Aldrich1581274% PBS
DAPI 细胞核染色Thermo ScientificD1306
NucleoSpin RNA 分离试剂盒Machery-Nagel740955
mirVana miRNA 分离试剂盒Thermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒Thermo Scientific4366596
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems
高容量 cDNA 逆转录试剂盒Thermo Scientific4368814
hsa-miR-92a TaqMan 检测Thermo Scientific000431成熟 miRNA 序列：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan 检测Thermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan 检测Thermo Scientific001093
18S rRNA 内源性对照Thermo Scientific4333760F
明胶Sigma AldrichG7041
CellTrace 钙黄绿素红橙色Thermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS 缓冲液Miltenyi Biotec 130-091-221
琼脂糖Sigma AldrichA9539
7.1 特斯拉动物 MRI 系统布鲁克公司A7906
ImageJ 软件美国国立卫生升级了血管生成分析仪 （NIH）
MPS 设备布鲁克 Biospin
Matlab 软件Mathworks
环形钕磁铁 magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; 剩余光度为 ~ 1.3 T， 矫顽力 & ge;955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 成像套件Thermo ScientificC10340
FluorSave 试剂Merck345789
超声波浴Bandelin 电子型号：RK 100 SH
Thermo Thermo "手稿抗 has-miR92a-3p 合成抑制剂溶液 研究院

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al.

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