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方法文章

制备与 体外 磁化miR修饰内皮细胞的表征

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DOI：

10.3791/55567

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2017年5月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

本文内容

摘要

本论文描述了一种利用PEI/MNP载体高效、非病毒性地将miR递送至内皮细胞并实现其磁化的方法。因此，该方法除了可实现遗传修饰外，还可实现磁性细胞导向和磁共振成像（MRI）检测。该技术可用于改善治疗性细胞产品的特性。

摘要

迄今为止，心血管疾病（CVD）的可用外科和药物治疗手段有限，且多为对症治疗。与此同时，基因治疗和细胞治疗已成为治疗CVD极具前景的替代策略。然而，由于缺乏合适的基因递送系统，基因治疗的广泛应用受到极大限制。开发适当的基因递送载体可为当前细胞治疗面临的挑战提供解决方案。特别是通过适当的细胞工程手段，有望克服现有方法中存在的诸多缺陷，例如转导效率有限以及细胞在损伤器官中的滞留率低等问题。即， 在移植前对细胞进行遗传学修饰。本方案描述了一种利用聚乙烯亚胺超顺磁性磁性纳米颗粒（PEI/MNP）递送载体高效、安全地瞬时修饰内皮细胞的方法。同时，本文定义了细胞表征的算法与相关方法。该方法已成功将微小RNA（miR）递送至人脐静脉内皮细胞（HUVECs）胞内，且未影响细胞活力、功能或细胞间通讯。此外，该策略被证实可对导入的外源性miR产生显著的功能性效应。重要的是，采用该MNP基载体可实现细胞磁化，从而具备磁性靶向及无创MRI示踪的可能性。该技术有望为可磁引导、基因工程化细胞治疗提供基础，并实现MRI无创监测。

引言

基因治疗和细胞治疗是强大的工具，有望解决当前心血管疾病（CVD）治疗中的挑战。尽管这两种方法目前均已在临床试验中进行测试，但尚未准备好广泛应用于临床1。值得注意的是，应对基因治疗和细胞治疗挑战的一个共同策略是开发适用于临床应用的多功能基因递送载体。缺乏安全且高效的基因递送系统是基因治疗面临的主要问题。同时，在细胞移植前对细胞产物进行基因工程改造，有望克服细胞治疗中的严重挑战，例如效率低下（例如，在心脏领域，干细胞移植后仅实现约 5% 的功能改善1）以及在损伤部位的滞留/植入效果差（即，无论给药途径如何，细胞滞留率在给药后数分钟至数小时内即降至 5 - 10% 以下2,3,4）。

迄今为止，病毒载体在效率方面远超非病毒系统，因此在临床试验中得到了更广泛的应用（约67%）5。然而，病毒载体存在严重的风险，例如免疫原性（及其引发的炎症反应，可能导致严重并发症）、致癌性，以及所携带遗传物质大小受限等问题6。由于这些安全性问题以及病毒载体生产成本较高，在某些情况下使用非病毒系统更为可取7,8。非病毒系统尤其适用于需要短暂基因校正的疾病，例如调控血管生成的生长因子表达（e.g., 用于心血管疾病治疗）或疫苗递送。

在我们课题组中，设计了一种通过生物素-链霉亲和素相互作用将支化的25-kDa聚乙烯亚胺（PEI）与超顺磁性氧化铁纳米颗粒（MNP）结合在一起的递送系统9。该载体是一种可用于细胞基因工程的潜在工具，可在移植前实现细胞的同时磁化。后者为磁性导向/滞留提供了基础，这一点在当前尤为具有前景，因为先进的磁靶向技术正在被成功开发10。此外，所获得的磁响应性细胞有望通过磁共振成像（MRI）或磁粒子成像进行无创监测11,12。

对于PEI/MNP载体而言，聚胺能够确保核酸的压缩，从而保护其免受降解因素的影响，促进载体进入细胞以及实现内涵体逃逸5。磁性纳米颗粒（MNPs）不仅在磁导向方面补充了PEI的性能，还可降低PEI已知的细胞毒性7,13,14。此前，已利用成纤维细胞和人源间充质干细胞对PEI/MNP载体在递送效率（即质粒DNA和miRNA）和安全性方面的性能进行了优化15,16。

本文描述了应用PEI/MNPs制备miRNA修饰细胞的详细实验方案17为此，使用 HUVECs 并代表一种成熟的模型 体外 血管生成。它们难以转染，且易受毒性影响18,19,20此外，我们提供了一种用于评估此类细胞的算法 体外包括它们的靶向性、细胞间通讯以及磁共振成像检测。

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方案

用于细胞分离的人类脐带已获取 产后 来自知情且健康的女性，她们根据《赫尔辛基宣言》签署了书面同意书，允许将其材料用于研究。罗斯托克大学伦理委员会已批准本研究（注册编号：A 2011 06，延期至2013年9月23日）。

1. 转染复合物的制备

  1. 聚乙烯亚胺（PEI）的生物素标记
    1. 在室温（RT）下，将支化型PEI溶于超纯水中，避光条件下以300–400 rpm转速磁力搅拌24小时，得到0.18 mM的溶液。将该溶液于4 °C保存。
    2. 测定所得溶液中伯氨基的浓度21,22.
      1. 使用2% 茚三酮试剂溶液作为胺类检测试剂23 将100 µL预稀释样品（用超纯水按1:200稀释）与75 µL茚三酮试剂混合，80 °C孵育30分钟。冷却后加入100 µL 50%乙醇以稳定反应体系，随后在分光光度计中于550 nm处测定吸光度。
      2. 使用甘氨酸绘制标准曲线。
        1. 配制0.1 M氨基-N储备液（将0.75 g甘氨酸溶于100 mL去离子水中），并依次稀释为1:1、1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:100、1:200、1:400和1:600的稀释液。按照步骤1.1.2.1的方法测定这些溶液，并以浓度和吸光度为坐标轴绘制曲线图。
        2. 根据所得曲线及测得的PEI溶液吸光度，确定PEI中α-氨基的浓度。
          注意：使用茚三酮试剂溶液时必须在通风橱中操作，并应在氮气环境中储存。若溶液因氧化而变色，则不可再使用。
    3. 使用前立即用超纯水溶解100 mg生物素连接子，配制成0.01 mM溶液。通过将PEI中α-氨基基团的浓度（在步骤1.1.2中测得）乘以20，计算出所需添加的生物素化试剂的量（单位为mol）。
      1. 将生物素溶液加入PEI溶液（pH 8–9）中，室温下磁力搅拌孵育16 h。
    4. 通过尺寸排阻色谱法去除未反应的生物素23使用市售的凝胶过滤层析柱，该柱中填充的介质应适用于纯化25-kDa PEI，并按照制造商说明书进行操作。纯化后取等分试样，用胺检测试剂测定胺浓度（步骤1.1.2），并测定生物素偶联效率（步骤1.2.2）。将获得的生物素化PEI于4 °C保存。
  2. 生物素化PEI的表征
    1. 按照步骤1.1.2所述，测定生物素化后PEI中α-氨基的浓度。
    2. 确定PEI生物素化程度以验证偶联过程。为进行定量，使用市售试剂盒，该试剂盒基于HABA染料（4'-羟基偶氮苯-2-羧酸）的应用，以确保对生物素化水平进行准确的比色测定24,25按照制造商提供的说明进行操作。
  3. 磁性纳米颗粒的过滤及其表征
    1. 使用0.45 µm针筒式滤器过滤市售的链霉亲和素包被磁性纳米颗粒16 以排除较大的有毒聚集体。使用标准的光度法测定最终的铁浓度。26.
    2. 按照标准方案，通过记录磁化曲线和透射电子显微镜（TEM）成像来检测过滤后磁性纳米颗粒（MNPs）的质量27,28.
      1. 将MNP悬浮液用蒸馏水稀释，取3 µL稀释后的悬浮液滴加到300目Formvar碳支持膜铜网上，用于透射电子显微镜分析。随后将铜网置于加热板上的玻璃载片上，使其自然干燥。
      2. 使用透射电子显微镜在120 kV条件下分析样品，并利用X射线探测器验证其元素组成27.
  4. 用于超分辨率显微镜的转染复合物三色标记
    1. 按照说明书，用 NHS-酯 Atto 488 染料标记 PEI 中 0.5% 的测定初级氨基。通过尺寸排阻色谱法去除未结合的过量染料（如上文步骤 1.1.4 所述）。使用茚三酮测定法测定所得氨基浓度（步骤 1.1.2）。
    2. 使用合适的标记试剂盒，用花青素5（Cyanine5）染料标记市售的乱序miR（scr-miR）15 （见材料列表）。使用分光光度法测定所得荧光团-miR 的浓度。
    3. 每次均使用生物素偶联染料对磁性纳米颗粒（MNP）进行新鲜标记例如， atto 565-生物素) 按1:1,000（w/w）比例混合。在形成转染复合物过程中，将MNP加入miR/PEI后，直接加入染料，具体操作详见Delyangina 等16.

2. 细胞制备

  1. HUVEC 的分离
    1. 在获取脐带后，立即从脐静脉内部通过胶原酶消化法分离细胞；遵循先前建立的实验方案29.
      1. 将每根脐带与约 60 单位/毫升的 IV 型胶原酶溶液在缓冲液中于 37 °C 孵育 13 分钟，酶液通过脐静脉灌注。
    2. 所有实验均需汇集来自至少5位患者的HUVECs。
      注意：培养传代次数不应超过4-5代。不得使用支原体污染的细胞，因为这会降低转染效率。在开始本方案前，应使用高灵敏度的支原体PCR检测试剂盒检测支原体污染情况。
      1. 检测支原体污染
        1. 离心1 mL细胞培养上清液10分钟（13,000 × g）。将沉淀重悬于17 µL的dH₂O中2O并煮沸（93 °C）3分钟。取2 µL该悬浮液用于扩增编码多种支原体高度保守的核糖体RNA（16S-rRNA）的DNA区域。
        2. 使用商业PCR试剂盒，以各10 pmol的引物（正向引物：5′-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3′；反向引物：5′-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3′）进行PCR扩增，反应条件如下：94 °C 预变性3 min；94 °C 变性30 s、50 °C 退火30 s、72 °C 延伸30 s，共45个循环；最后72 °C 延伸10 min。
        3. 使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物（292 bp）。
    3. 将获得的细胞长期保存于液氮中，或在含100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的内皮细胞生长培养基中，于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养。2.
  2. HUVEC 表征
    1. 通过基底膜基质中形成管状结构的功能能力来表征分离的 HUVECs例如， 基质胶）及其对内皮细胞标志物CD31（血小板 内皮 细胞粘附分子，PECAM-1）按照标准方案进行30,31.

3. 转染

  1. 用胰蛋白酶消化储备的HUVEC细胞培养物（参见步骤4.1.2），并使用血细胞计数板手动计数细胞。在转染前48小时，将HUVEC细胞接种于适当大小的塑料细胞培养板孔中，接种密度约为13,000个细胞/cm2生长面积，直至细胞融合度达到70–80%。
  2. 每次均需新鲜配制miR/PEI/MNP复合物。
    注意：首先应制备miR/PEI复合物（步骤3.2.1–3.2.3）；随后将MNPs加入miR/PEI溶液中（步骤3.2.4），以获得用于转染的最终miR/PEI/MNP制剂（步骤3.3）。
    1. 根据厂家提供的储备液浓度，计算所需适量市售miR（随机序列、标记或功能性miR，参见步骤4）的用量。每cm2细胞生长面积使用2.5 pmol miR。将miR用5%葡萄糖溶液稀释，使其最终浓度为0.125 pmol miR/µL。
    2. 根据步骤3.2.1中的miR用量及最佳NP比2532，结合已测定的PEI浓度（步骤1.1.2），计算所需PEI的量。将PEI（按计算所得体积）用等体积的5%葡萄糖溶液稀释。将稀释后的PEI加入步骤3.2.1所得的miR溶液中，涡旋混合30秒。
    3. 将所得miR/PEI混合物在室温下孵育30分钟。
    4. 在室温下，将MNPs置于超声水浴中（参见材料列表）以35 kHz超声处理至少20分钟，然后向miR/PEI混合液中加入适量MNP溶液（每mL制备的miR/PEI/MNP混合液中含铁5–25 µg16），涡旋30秒，再于室温孵育30分钟，备用。
  3. 将制备好的miR/PEI/MNP混合液逐滴直接加入细胞培养孔中的培养基中。将含miR/PEI/MNP的细胞培养基与葡萄糖稀释液的混合物作为转染液使用。转染6小时后，更换为新鲜培养基。

4. 载体安全性的分析

  1. 细胞活力检测
    1. 将接种于24孔培养板中的HUVECs进行转染（步骤3.1和3.2）；以Cy3-miR作为检测探针，以随机序列miR（scr-miR）作为流式细胞术的对照门控探针。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育。2 24 小时。
    2. 使用 PBS 稀释的 1× 胰蛋白酶-EDTA 溶液处理细胞，在 37 °C 下孵育 4 分钟，通过胰蛋白酶消化收集上清液和转染的细胞。在 300 × g 下离心 10 分钟，用于后续分析。
    3. 转染后24小时，采用商品化染料通过流式细胞术检测细胞活力及miR摄取效率，以区分活细胞与死细胞；使用标准操作流程15将未转染的细胞作为活力的阳性对照。
  2. 在功能实验中检测miR/PEI/MNP复合物对细胞的安全性。
    1. 评估转染细胞的增殖活性。
      1. 在12孔培养板中接种的HUVECs（步骤3.1和3.2）转染功能性反义miR（例如， HUVECs 的抗 miR92a31）并在含5% CO₂的湿润环境中37 °C孵育2 24小时。
      2. 使用市售试剂盒通过EdU（5-ethynyl-2´-deoxyuridine）染色结合激光共聚焦显微镜扫描，确定增殖细胞数量。显微镜设置如下：40倍油镜；633 nm激发激光（用于647 nm染料）；每样本采集5个随机视野。通过EdU染色的细胞核数除以总细胞核数（Hoechst染色）计算细胞增殖率。
    2. 评估转染细胞形成管状结构的能力，方法如前所述17,31.
      1. 将接种于24孔培养板中的HUVECs（步骤3.1和3.2）转染scr-miR，并在含5% CO₂的湿润环境中于37 °C孵育48 h2收集转染的细胞（如步骤 4.1.1 所述）。
      2. 种子 3.5 × 104 在24孔板中接种经修饰的HUVECs，孔板预先用140 µL基底膜基质包被。于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育18小时2.
      3. 使用激光扫描共聚焦显微镜（微分干涉相差）记录每个孔中10个随机视野的图像，并利用ImageJ软件进行分析，结合 "血管生成分析仪" 插件。在评估中包含总分支长度、分支数量和连接点数量等参数，并与未经处理的对照组进行比较。
  3. 通过检测三维荧光漂白后恢复（FRAP）来评估转染复合物对缝隙连接（GJ）介导的细胞间通讯（GJIC）可能产生的毒性影响33 在三维中。
    1. 将细胞接种于底部较薄且经明胶包被的玻璃载片上，适用于活细胞成像（油镜）。按照上述第3.2步所述方法，使用未标记的非功能性miR（scr-miR）转染细胞，并培养24小时。
    2. 在显微成像前，将细胞加载钙黄绿素以进行成像准备。具体操作为：更换新鲜培养基，其中含5 µM钙黄绿素，37 °C孵育20分钟，随后用PBS洗涤，并更换为新鲜培养基。预先将显微镜的培养箱加热至37 °C，并调节CO₂浓度至5%2 浓度至5%。
      注意：所有试剂均需预热，以避免测量前细胞收缩。
    3. 使用561 nm激发激光进行细胞成像和FRAP实验。首先，手动选择待测细胞作为感兴趣区域（ROI）；待测细胞应至少具有3个相邻细胞。定义一个具有明亮且稳定荧光的参照细胞，该细胞不进行漂白。设定z轴层扫范围，从细胞顶部到底部记录荧光信号，共包含10–15层。
    4. 使用100%激光功率漂白检测细胞，并在接下来的15分钟内记录荧光恢复情况（由邻近细胞通过间隙连接特异性染料转移所致）。每60秒在z轴层扫中记录一次原始数据。每次实验至少对5–10个检测细胞进行FRAP测量。将结果与未转染细胞进行比较。

5. 转染效率的检测

  1. miR 摄取的检测
    1. 按照步骤4.1所述制备探针，并同时使用这些探针通过流式细胞术定义miR的摄取情况。
  2. 通过共聚焦显微镜和超分辨率结构光照明显微镜（SIM）确认并描述转染复合物的细胞内定位。
    1. 将HUVECs接种于置于24孔培养板孔中经明胶包被的玻璃盖玻片上，操作如前所述（步骤3.1）。用三色标记的miR/PEI/MNP转染细胞（步骤1.4），并在含5% CO₂的湿润环境中37 °C孵育24 h。2.
    2. 先用含 2% 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤盖玻片，再用 PBS 洗涤。将细胞在 37 °C 条件下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 15 分钟，随后按照标准方案用 DAPI 染色细胞核。16在摇床上洗涤3次（每次15分钟），以去除多余的染料。
      注意：PFA 具有致癌性，必须小心操作。
    3. 将制备好的盖玻片用适当的封片介质置于显微镜载玻片上，室温干燥至少1小时，随后按如下所述进行显微镜观察。
    4. 使用63倍油浸物镜和以下SIM设置获取图像：激发光源采用405 nm、488 nm、561 nm和633 nm激光线；z轴层扫模式，32位深度，5个角度，5个相位，平均4次；G2栅格使用405 nm激光线，G3使用488 nm，G4使用561 nm，G5使用633 nm。
  3. 通过RT-qPCR评估miR/PEI/MNP-HUVECs与未处理组相比所递送miR的功能活性。
    1. 将接种于12孔培养板中的HUVECs（按步骤3.1和3.2）用功能性反义miR转染例如， HUVECs 的抗 miR92a31）并在含5% CO₂的湿润环境中于37 °C孵育48小时2.
    2. 使用市售试剂盒（见材料部分），按照制造商说明并参考其他文献所述方法，通过RT-qPCR评估anti-miR92a的递送与加工情况17,31同时，检测目标基因的表达情况（例如， ITGA531).
      注意：相较于模拟物，优先选择针对内源性miR的antagomiR递送，因为它能够确保检测到miR的实际效应，而不仅仅是其在细胞内的累积情况。

6. 细胞靶向性评估与磁性细胞分离

  1. 静态条件下的细胞靶向 体外
    1. 在24孔板中转染HUVECs（2.5 pmol/cm²）2 scr-miR、NP 25 和 15-25 µg/mL MNP），孵育 24 小时，按上述方法洗涤并收集（步骤 4）。
    2. 将1个孔中获得的细胞沉淀与1 mL新鲜培养基混匀，接种至12孔板的孔中。用胶带将一小块磁铁固定在孔板底部的一侧。
    3. 将细胞悬液孵育24小时，观察磁铁区域上方及无磁铁区域的细胞贴壁和生长情况。进行定性评估时，使用常规倒置显微镜。
  2. 模拟动态条件下的细胞靶向 体外.
    1. 在24孔板中按照步骤3.1和3.2转染HUVECs（2.5 pmol/cm²）2 Cy3-miR、NP 25 和 15–25 µg/mL MNP，孵育 24 小时，洗涤后加入用 PBS 稀释的 1× 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 处理 4 分钟进行消化收集。300 × g 离心 10 分钟。
    2. 将从1个孔中获得的细胞沉淀与1 mL新鲜培养基混合，转移至12孔板的1个孔中。用胶带将一小块磁铁固定在孔的侧壁局部位置。将培养板置于摇床上，于150 rpm条件下孵育细胞悬液12小时，以模拟动态培养环境。34.
    3. 用4%多聚甲醛洗涤并固定细胞，然后用DAPI染色细胞核16使用514 nm激发激光，通过激光扫描共聚焦显微镜以z轴堆叠模式（5–12层切片）记录细胞贴附情况，获取原始数据，并采用最大强度投影图像处理方法生成用于分析的图像。
  3. 磁响应性与非磁响应性细胞的定量分析
    1. 在24孔板中转染HUVECs（2.5 pmol/cm²）2 scr-miR、NP 25 和 15–25 µg/mL MNP），孵育 24 小时，按前述方法洗涤并收集（步骤 6.2.1）。将 PBS 和细胞分选缓冲液（经过滤除菌，见材料列表）预热至 37 °C。用 500 µL 细胞分选缓冲液重悬每个孔中获得的细胞沉淀。
    2. 将该细胞悬液加入由所提供磁铁固定的磁性分选柱中，用新鲜的细胞分选缓冲液在磁铁上洗涤分选柱3次，收集流穿部分作为磁性无响应组分（mag-）。
    3. 将柱子从磁铁上取下，立即使用活塞将新鲜的细胞分选缓冲液推过柱子，收集具有磁响应性的细胞组分（mag+）。
    4. 将 mag- 和 mag+ 样品均在 300 × g 离心 10 分钟。用 PBS 重悬细胞沉淀，计数细胞，并通过台盼蓝排斥法检测细胞活力。35. 将获得的细胞沉淀用于长期分析（即， 重新接种并在培养24、48和72小时后进行评估17）或直接用于流式细胞术（步骤 4.1）。
  4. 确定转染细胞的铁负荷。
    注意：在制备过程中，必须避免细胞探针与氧化铁材料及仪器接触。
    1. 收集转染的 HUVECs 及未转染的对照细胞（同 4.1.1 步骤）。用含 2% BSA 的 PBS 洗涤收集的细胞两次36 通过将细胞与1 mL洗涤缓冲液仔细混匀，然后以300 × g离心10分钟。将所得细胞沉淀重悬于250 µL PBS中，加入100 µL 4% PFA，孵育20分钟以固定细胞。按照上述方法用PBS洗涤3次。
    2. 将所得的固定细胞沉淀重悬于110 µL PBS中，并转移至100 µL PCR管中。
      1. 取10 µL样品用于细胞计数，剩余样品用于磁性粒子谱分析（MPS）。
    3. 在市售的MPS设备上进行测量。测量过程中应用以下设置：磁场 B驱动 = 25 mT 和频率 f0 = 25 kHz。对于样品中铁含量的定量，需对第三次谐波进行归一化处理 A3 MPS谱与相应的 A3，参考文献 已知铁含量为2.1 µg的MNP参比样品37使用未经处理的细胞作为对照。

7. 定义 MRI 检测限

  1. 细胞制备。
    1. 在6孔板中接种HUVEC细胞并转染（2.5 pmol/cm²）2 scr-miR、NP 25 和 15–25 µg/mL MNP，根据所需细胞量（用于模体制备）设置重复两份或三份。将细胞孵育24小时后，按前述方法（步骤4）洗涤、收集并用4% PFA固定。
    2. 计数获得的细胞，用适当数量的细胞制备分装样本（例如， 103, 104, 105, 等等。），并将体积调至 50 µL。
  2. 琼脂糖仿体制备
    1. 在50 mL离心管中制备多层2%琼脂糖，将不同数量的转染细胞包埋于各层之间38在制备过程中，对热琼脂糖进行超声处理并离心38 以消除导致伪影的气泡。
      注意：重要的是，含有 5.5 x 105 应以相同方式制备经非磁性miR/PEI复合物处理的HUVECs，作为对照。
  3. 扫描获得的 体外 将模体置于线圈中心，与磁场的z轴平行，然后使用7.1 T动物MRI系统进行扫描。
    1. 应用以下序列参数进行梯度回波序列采集：TR = 66 ms；TE1/TE2/TE3/TE4/TE5/TE6 = 1.44/2.88/4.51/6.11/7.60/9.01 ms；翻转角 = 3°；矩阵 = 128 × 128，插值至 256 × 256；视野 = 42 mm，100%；平均次数 = 1；回波链长度 = 1；层厚 = 1.5 mm；共 16 层。
    2. 评估所有四个回波时间的信号衰减，并使用适当的软件计算 R2* 图谱（R2* = 1/T2*），具体方法见其他文献描述39.

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结果

本方案的主要目的是制备具有磁响应性的miR修饰细胞，并对其进行精确表征（图1）。最终应获得转染效率高、可响应磁性筛选与导向，并可通过磁共振成像（MRI）检测的细胞。

首先，通过内皮细胞标志物 CD31（PECAM）的典型染色（图 2A）以及细胞在适当基底膜基质上形成管状结构的能力，确认了分离获得的 HUVEC 的身份（图 2B）。所获得的细胞对 PEI/MNP 介导导入的 miR 摄取效率很高；显微观察显示，转染后 24 小时，所有细胞均呈现标记 miR（Cy3）的阳性信号（图 3A）。重要的是，与未处理细胞相比，未观察到细胞死亡（图 3B），且细胞形态保持正常（图 3A）。共聚焦激光扫描显微镜观察显示，Cy3-miR 的信号主要位于细胞内部。此外，利...

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讨论

本方案介绍了制备负载超顺磁性纳米颗粒的基因工程细胞，并实现其磁控定向引导的方法。成功应用该策略可解决细胞治疗中的一些难题，例如细胞在损伤区域的滞留率低和植入效果差2,3,4，从而提供一种可靶向的细胞移植产品。此外，同时引入适当筛选的遗传物质可增强细胞特性，进而提高其功能益处41。

本实验方案以HUVECs作为模型细胞进行开发。已知这些细胞转染难度较大，且易受毒性影响18,19,20。经PEI/MNP转染后，荧光标记miR的摄取率超过95%，该水平通常可由基于PEI的载体以及常用的阳离子脂质转染试剂（例如 Lipofectamine）实现

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披露

我们没有需要披露的相互竞争的财务利益。

致谢

我们感谢德国罗斯托克大学电子显微镜中心的 G. Fulda 在获取超顺磁性纳米颗粒的透射电子显微镜图像及其X射线分析方面提供的技术支持。在罗斯托克跨学科技术中心（RTC Rostock）开展的研究工作得到了德国联邦教育与研究部（资助编号：0312138A、316159 和 VIP+03VP00241）、梅克伦堡-前波美拉尼亚州政府以及欧盟结构基金（ESF/IV-WM-B34-0030/10 和 ESF/IV-BM-B35-0010/12）的支持，同时也获得了德国研究基金会（DFG，项目号 DA 1296-1）、Damp 基金会和德国心脏基金会（F/01/12）的资助。Frank Wiekhorst 的研究得到了欧盟第七框架计划“Nanomag”项目（FP7-NMP-2013-LARGE-7）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素Thermo Scientific21335
PD-10 脱盐柱GE Healthcare17085101含 Sephadex G-25 Medium
2% 茚三酮试剂溶液Sigma Aldrich7285
甘氨酸Sigma Aldrich410225
Pierce 生物素定量试剂盒Thermo Scientific28005
微量板读数仪 Model 680Bio-Rad
链霉亲和素磁性微球PromegaZ5481
Millex-HV PVDF 滤膜MerckSLHV013SL0.45 µm
Libra 120 透射电子显微镜Zeiss加速电压 120 kV
Sapphire X射线探测器EDAX-Amatek
细胞培养塑料器皿TPP
NHS-酯 Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-酯 Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA 标记试剂盒Mirus BioMIR 9650
生物素-Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
IV型胶原酶 GibcoThermo Scientific17104019
内皮细胞生长培养基 EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
青霉素/链霉素Thermo Scientific15140122100 U/mL, 100 µg/mL
MatrigelBD Biosciences356234
抗 PECAM-1 抗体Santa Cruzsc-1506
MS MACS 柱Miltenyi Biotec 130-042-201
近红外活/死细胞染色试剂盒Thermo ScientificL10119
Cy3 荧光标记 Pre-miR 阴性对照Thermo ScientificAM17120"Cy3-miR" 或文稿中的 "Cyanine-miR3"
Pre-miR miRNA 前体分子 - 阴性对照 Thermo ScientificAM17110文稿中称为 "scr-miR"
抗 hsa-miR92a-3p 合成抑制剂 Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 系统Zeiss
多聚甲醛Sigma Aldrich158127PBS 中的 4% 溶液
DAPI 核染色剂Thermo ScientificD1306
NucleoSpin RNA 提取试剂盒Machery-Nagel740955
mirVana miRNA 提取试剂盒Thermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒Thermo Scientific4366596
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems
高容量 cDNA 反转录试剂盒Thermo Scientific4368814
hsa-miR-92a TaqMan 检测试剂Thermo Scientific000431成熟 miRNA 序列：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan 检测试剂Thermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan 检测试剂Thermo Scientific001093
18S rRNA 内参对照Thermo Scientific4333760F
明胶Sigma AldrichG7041
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS 缓冲液Miltenyi Biotec 130-091-221
琼脂糖Sigma AldrichA9539
7.1 特斯拉动物 MRI 系统Bruker CorporationA7906
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（NIH）升级版，配备 AngiogenesisAnalyzer（NIH）
MPS 设备Bruker Biospin
Matlab 软件Mathworks
环形钕磁铁 magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm；剩磁约为 1.3 T，矫顽力 ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒Thermo ScientificC10340
FluorSave 封片剂Merck345789
超声波清洗仪Bandelin electronic型号：RK 100 SH

参考文献

  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27(2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023(2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23(1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159(2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30(2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85(2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184(2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149(2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

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