Bacillus anthracis 是致命性吸入性炭疽病的专性病原体，因此对其基因和蛋白质的研究受到严格管制。一种替代方法是研究其直系同源基因。本文描述了对 B. anthracis 在 B. cereus 中的直系同源基因 bc1531 所开展的生物物理化学研究，该研究仅需最少的实验设备，且无重大安全顾虑。
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本文内容
摘要
摘要
为克服研究真实病原体基因和蛋白质时面临的安全限制与法规，可转而研究其同源物。 炭疽杆菌 是一种专性病原体，可引起致命的吸入性炭疽。 Bacillus cereus 被认为是研究的有用模型 B. anthracis 由于其密切的进化关系。该基因簇 ba1554 - ba1558 的 B. anthracis 高度保守，与 bc1531- bc1535 簇集 B. cereus以及与 bt1364-bt1368 簇集 苏云金芽孢杆菌 表明相关基因在其中的关键作用 芽孢杆菌属 属。本文描述了制备和表征第一个基因的蛋白质产物的方法ba1554) 来自基因簇中的基因 B. anthracis 使用其直系同源物的重组蛋白 B. cereus, bc1531
引言
重组蛋白表达被广泛用于解决天然蛋白来源相关的问题，例如蛋白产量有限和有害污染。此外，在致病基因和蛋白的研究中，可以使用无需额外安全防护措施的替代实验室菌株。例如，由于进化关系密切，Bacillus cereus 是研究 Bacillus anthracis 的有用模型1。
B. anthracis 是一种专性病原体，可导致人类和家畜致命的吸入性炭疽病，并且有可能被用作生物武器2。因此，针对 B. anthracis 的实验室研究受到美国疾病控制与预防中心的严格监管，要求在生物安全三级（BSL-3）条件下进行操作，其中包括将实验室区域隔离并维持负压环境。与 B. anthracis 不同，B. cereus 被归类为生物安全一级（BSL-1）病原体，因此其安全风险极低。B. cereus 是一种机会性病原体，感染后通常引起食物中毒，且多数情况下无需医疗干预即可自愈。然而，由于 B. cereus 与 B. anthracis 共享许多关键基因，因此可通过研究 B. cereus 中的同源蛋白来揭示 B. anthracis 蛋白的功能1。
这 ba1554 - ba1558 基因簇 B. anthracis 高度保守，与 bc1531- bc1535 簇 的 B. cereus以及与 bt1364-bt1368 簇 Bacillus thuringiensis，在基因结构和序列方面。此外，前几个基因（ba1554, bc1531，以及 bt1364）各自的簇是绝对保守的（即， 100% 核苷酸序列一致性），暗示该基因产物具有关键作用 芽孢杆菌属 物种。由于其位于这些基因簇中的位置， ba1554 被错误鉴定为一种假定的转录调控因子3然而，对氨基酸序列的分析表明 ba1554 产物表明其属于MazG家族，具有核苷酸焦磷酸水解酶活性，且不具有转录因子活性4,5尽管属于MazG家族的蛋白质在整体序列和长度上具有多样性，但它们共享一个约100个残基的MazG结构域，该结构域的特征为EXXE基序12-28EXXD基序"X" 代表任意氨基酸残基，数字表示X残基的数量。
MazG 结构域并不总是直接对应某种特定的催化活性。来自大肠杆菌（Escherichia coli）的 MazG 成员（EcMazG）含有两个 MazG 结构域，但只有C端的 MazG 结构域具有酶活性6。此外，MazG 酶的底物特异性各不相同，从非特异性的核苷三磷酸（如 EcMazG）到特异性的 dCTP/dATP（如整合素相关 MazG）以及 dUTP（如 dUTPase）均有所报道6,7,8,9。因此，有必要对 BA1554 蛋白进行生物物理化学分析，以确认其 NTPase 活性并阐明其底物特异性。
本文提供了一种分步实验方案，大多数不具备BSL-3设施的实验室均可遵循该方案在分子水平上表征B. cereus bc1531基因的蛋白质产物，该基因是B. anthracis ba1554的直系同源基因。简言之，将重组BC1531蛋白（rBC1531）在E. coli中表达，并利用亲和标签进行纯化。针对X射线晶体学实验，对rBC1531蛋白的结晶条件进行了筛选与优化。为评估rBC1531的酶活性，采用比色法检测其NTP酶活性，以避免传统方法中使用放射性标记核苷酸。最后，通过对所获得的生物物理化学数据进行分析，确定了rBC1531的寡聚状态和催化参数，并从rBC1531晶体获得了X射线衍射数据。
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方案
1. 重组蛋白 rBC1531 的表达与纯化
- 重组BC1531蛋白（rBC1531）表达质粒的制备
- 制备基因组DNA B. cereus10.
- 扩增 bc1531 基因来自模板 B. cereus 使用正向和反向引物（见材料列表）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增基因组DNA，以生成 Bam高感染性（HI）和 SalI 限制性内切酶位点，分别10.
- 使用限制性内切酶消化PCR产物和经修饰的pET49b载体（pET49bm） Bam高碘酸和 盐我，如上所述11.
- 将步骤 1.1.3 中获得的消化后 PCR 产物与载体按 3:1 的比例混合，使用 T4 DNA 连接酶进行 10 µL 体系的连接反应，具体操作如下所述11在18 °C下孵育30分钟。
- 将3 µL连接反应液加入50 µL感受态细胞中 E. coli DH5α细胞置于离心管中，用移液器轻轻吹打混匀，冰上放置30分钟。42 °C热激45秒。加入1 mL LB（Luria-Bertani）培养基，于37 °C、250 rpm剧烈振荡培养45分钟。
- 取1.1.6步骤中转化后的细胞100 µL，均匀涂布于含100 µg/mL卡那霉素（Kan）的LB-琼脂平板上，37 °C培养约18 h。
- 使用无菌枪头挑取菌落，将菌体接种于含 100 µg/mL Kan 的 3 mL LB 培养基中，剧烈振荡培养（250 rpm，37 °C，18 h）。
- 使用碱性-SDS 裂解法提取质粒 DNA，具体步骤如下所述10.
- 使用DNA测序确认rBC1531表达载体的核苷酸序列12.
- rBC1531蛋白的过表达
- 重新转化 E. coli BL21 (DE3) 菌株携带 rBC1531 表达质粒，用于过表达，具体步骤见 1.1.5–1.1.6。
- 挑选单菌落，接种于10 mL含50 µg/mL卡那霉素的LB培养基（LB+Kan）中，37 °C剧烈振荡培养18 h。
- 将10 mL过夜培养物接种至1 L LB+Kan培养基中，于37 °C培养至OD600 （600 nm 处的光密度）达到约 0.7。
- 将培养物浸入冰水中约15分钟，使其温度降至18 °C，然后向培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），终浓度为1 mM，以诱导重组蛋白表达。在18 °C下继续培养约16–18小时。
- rBC1531的纯化
- 通过离心收集细胞（5,000 × g，4 °C，30 分钟）。小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞重悬于 50 mL 含 10 mM 咪唑的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中。
- 在冰上进行两次超声处理以裂解细胞，防止细胞裂解物过热（时间：2分30秒；开启周期：5秒；关闭周期：10秒；振幅：38%）。
- 通过离心澄清细胞裂解液（约 25,000 x g，4 °C，30 分钟）。
- 将3 mL镍珠与60 mL含10 mM咪唑的PBS混合，倒入2.5 × 10 cm玻璃层析柱中，通过重力流排出多余缓冲液，使镍珠在柱中沉降平衡。
- 使用移液器将步骤1.3.3中的上清液转移至已预平衡的镍珠柱中，于4 °C、低速（约20 rpm）旋转摇床中孵育2小时。
- 让上清液依靠重力自然流尽，然后用含有10 mM咪唑的PBS缓冲液洗涤柱中的镍珠3次，每次100 mL。
- 用 4 × 5 mL 含 250 mM 咪唑的 PBS 缓冲液洗脱 rBC1531 蛋白。
- 取1.3.7步骤洗脱液15 µL，进行15% SDS-PAGE电泳。使用考马斯亮蓝染色法在凝胶上显色蛋白质条带10.
- 通过凝血酶蛋白水解去除rBC1531蛋白的亲和标签
- 将各组分用移液器转移至透析管（截留分子量：3 kDa）中，将透析管置于含有4 L凝血酶切割兼容缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，1.5 mM β-巯基乙醇）的烧杯中，4 °C下透析过夜。
- 用移液器吸取各组分并转移至锥形管中。
- 在280 nm处测定吸光度，并按照所述方法估算rBC1531蛋白浓度13.
- 取50 µg rBC1531于0.5 mL离心管中，加入不同量的凝血酶（即， 2、1、0.6 和 0.3 单位）。将 rBC1531 与凝血酶的反应体系在 20 °C 下孵育约 3 小时，以确定切割 N 端亲和标签所需的最低凝血酶用量。
- 在15% SDS-PAGE上进行rBC1531和凝血酶反应，并确定凝血酶的最低用量（例如， 每50 µg rBC1531使用0.3单位凝血酶，以完全消化N端亲和标签，获得无标签的rBC1531。
- 向15 mL离心管中加入10 mg rBC1531蛋白和60单位凝血酶，于20 °C孵育约3小时，进行凝血酶蛋白水解反应。
- 将凝胶过滤标准品上样至尺寸排阻色谱（SEC）柱，以制备分子量与洗脱体积的标准曲线，具体方法如下所述13.
- 将1.4.6步骤中经凝血酶消化的rBC1531蛋白置于离心过滤管（分子量截留值：3 kDa）中，在4 °C、3,000 g条件下离心，浓缩至体积小于5 mL。
- 将浓缩的rBC1531蛋白上样至SEC柱，每管收集0.5 mL，共收集60个洗脱组分13.
- 取每种组分15 µL，在15% SDS-PAGE上电泳，并按所述方法使用考马斯亮蓝染色液（0.15% (w/v) 考马斯亮蓝R-250、40% (v/v) 甲醇和10% (v/v) 冰乙酸）染色凝胶10.
- 用移液器收集含有 rBC1531 的组分，并将其合并至同一离心管中。
2. rBC1531 的结晶筛选与优化
- rBC1531蛋白结晶条件的筛选
- 使用离心滤管将步骤 1.4.11 中的 rBC1531 浓缩至约 18.5 mg/mL，操作方法同步骤 1.4.8 所述。
- 加入50 µL每种结晶筛选溶液（见第2.2节）14 将96孔坐滴结晶板的各孔中加入0.5 µL浓度为18.5 mg/mL的rBC1531蛋白溶液，置于坐滴基底上。再向每孔加入0.5 µL储液，与蛋白溶液混合，重复此操作完成整块板的加样。
- 用透明粘性封板膜覆盖平板。将96孔板置于18 °C条件下，进行蒸汽扩散。
- 使用光学显微镜以20-40倍放大倍数扫描液滴，每天监测晶体形成情况，持续2-3周。
- 收集X射线衍射数据12 使用获得的 rBC1531 蛋白晶体。
- rBC1531 结晶条件的优化
- 配制500 µL选定的初始结晶条件溶液（例如， 0.1 M 二甲胂酸钠，pH 6.5，以及 1.0 M 柠檬酸钠）并填充至24孔结晶板中用于悬滴法结晶。
- 向坐滴板中加入0.5 µL的18.5 mg/mL rBC1531蛋白溶液，与0.5 µL储液混合，立即用透明粘性膜封板。将板置于18 °C条件下。
- 在光学显微镜下观察晶体生长，持续一周。
- 通过改变pH值优化各种结晶条件即， pH 5.5–6.8）的0.1 M 卡可基酸缓冲液，并通过改变盐浓度（即， 0.9–1.2 M 的柠檬酸钠以获得单晶。监测晶体生长约 1 周，并收集 X 射线衍射数据12.
3. rBC1531 核苷三磷酸酶（NTPase）活性的表征
- 无机磷酸盐依赖性比色法研究的验证
- 配制焦磷酸盐储备液（100 mM），并用反应缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4；150 mM NaCl；2 mM MgCl₂）稀释至终体积为 200 µL，终浓度分别为 0.1、0.25、0.5、1.0、5.0、10、50、100 和 250 µM。2在两个96孔板中进行平行实验。第一个孔板作为空白对照（不含焦磷酸酶）。根据步骤3.1.2的指示，确保第二个孔板含有焦磷酸酶，作为工作板使用。
- 加入0.01单位的 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 向工作板的各孔中加入无机焦磷酸酶（1 µL），在20 °C孵育30–60分钟。
- 将钼酸铵溶液（0.86% v/v）与抗坏血酸溶液（14% v/v）按7:3体积比混合，配制钼酸溶液。向工作孔和对照孔中各加入16 µL钼酸溶液，室温避光孵育15分钟。
- 在 690 nm 处读取光密度（OD）690 nm).
- 比色法NTP酶活性检测
- 制备100 mM核苷三磷酸（NTP）底物储备液，并稀释至所需浓度（例如， 0、0.2、4.4、11、22、44、88 或 132 µM）溶于 180 µL 检测缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4；150 mM NaCl；2 mM MgCl₂）中2).
- 在96孔板中，每孔加入20 µg rBC1531（1.5 mM）及步骤3.2.1中的NTP底物，总体积补至200 µL，用移液器吹打混匀。盖上板盖，置于37 °C培养箱中孵育30 min，以进行底物水解反应。
- 将培养板转移至70 °C水浴中，静置15 min，以终止rBC1531介导的催化反应。
- 加入0.01单位的 S. cerevisiae 无机焦磷酸酶（1 µL）加入反应板的每孔中（来自步骤 3.2.3），20 °C 孵育 30 分钟。向反应板中加入 16 µL 钼酸溶液以显色（约 15 分钟）。在 OD 处读数690 nm.
- 使用米氏方程进行分析，具体方法如前所述12.
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结果
本研究中目标蛋白的表征首先需要制备足量的重组 B. cereus bc1531（rBC1531）蛋白，理想情况下应超过数毫克。通过 PCR 扩增编码 BC1531 蛋白的 DNA 片段，以 B. cereus 的基因组 DNA 作为模板，因其含有与 ba1554 相同的直系同源基因。rBC1531 在 E. coli 细胞中以可溶性蛋白的形式过表达。rBC1531 蛋白在其 N 端带有 6x-His 标签和凝血酶切割位点12。纯化的第一步采用镍亲和层析法对 rBC1531 进行纯化（图 1A）。随后进行凝血酶消化实验，以确定完全切除 rBC1531 上亲和标签所需的最低凝血酶用量（图 1A）。在本实验室条件下，0.3 单位的凝血酶足以完全去除 rBC1531 上的亲和标签。因此，在放大实验中，每 10 mg rBC1531 使用 60 单位凝血酶进行标签切除。凝血酶消化后，将去标签的 r...
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讨论
由于安全限制和法规要求，对真正病原体的研究受到限制。作为替代方案，可利用进化上相关的非致病菌或低致病性物种来研究病原体。在B. anthracis中，ba1554基因被认为是一个关键基因。幸运的是，在非临床来源的B. cereus中也存在一个完全相同的基因。因此，在无重大安全顾虑的情况下，可使用重组BC1531蛋白进行生物物理和酶学特性分析。本文详细描述了从基因到纯化重组蛋白的完整实验流程。利用该重组蛋白，我们开展了生物物理特性分析，结果表明四聚体形式的rBC1531能够催化NTP水解生成NMP和PPi。
凝胶过滤层析（SEC）被用作蛋白质纯化的最后一步，以去除来自细胞裂解液中与rBC1531分子大小不同的任何蛋白质污染物。同时使用SEC柱测定rBC1531的寡聚状态，结果显示其为四聚体。rBC1531的晶体结构也一致确定为四聚体形式12。
在生物物理技术中，X射线晶体学是获得蛋白质原子模型的最佳技术。通常，X射线衍射需要尺寸...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
X射线衍射数据集在韩国浦项加速器实验室（Korea）的7A光束线上收集。本研究由韩国国家研究基金会（NRF）管理的基础科学研究中心项目资助，资金来自韩国科学、信息通信技术与未来规划部（2015R1A1A01057574，MH）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bacillus cereus ATCC14579 | 韩国组织培养收藏中心 | 3624 | |
| 基因组DNA提取试剂盒 | GeneAll | 106-101 | 基因组DNA制备 |
| 正向引物 | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA | BamHI位点已加下划线 |
| 反向引物 | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG | SalI位点已加下划线 |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR聚合酶 |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b表达载体 | Novagen | 71463 | 表达载体经改造以添加亲和标签及BamHI/SalI位点10 |
| T4 DNA连接酶 | Enzynomics | M001S | |
| 透析膜 | Thermofisher | 18265017 | |
| 干式恒温仪 | JSR | JSBL-02T | |
| LB肉汤（Luria-Bertani） | LPS solution | LB-05 | |
| LB琼脂，Miller型（Luria-Bertani） | 贝克顿·迪金森公司 | ||
| 卡那霉素 | LPS solution | KAN025 | |
| 质粒小提试剂盒 | Favorgen | FAPDE300 | 质粒DNA制备 |
| BL21(DE3)感受态细胞 | Novagen | 69450-3CN | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| 氯化钠 | Daejung | 7548-4100 | PBS组分 |
| 氯化钾 | Daejung | 6566-4405 | PBS组分 |
| 磷酸钾 | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS组分 |
| 磷酸钠 | Bio Basic Inc | S0404 | PBS组分 |
| 咪唑 | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| 超声破碎仪 | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA琼脂糖 | Qiagen | 30210 | 镍珠 |
| 旋转混合仪 | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein双色蛋白标准品 | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE蛋白标准品 |
| 考马斯亮蓝R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | 考马斯亮蓝染色液 |
| 甲醇 | Samchun chemical | M0585 | 考马斯亮蓝染色液 |
| 乙酸 | Daejung | 1002-4105 | 考马斯亮蓝染色液 |
| 透析膜 | Thermofisher | 68035 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-aldrich | M6250 | |
| 凝血酶 | Merckmillipore | 605157-1KUCN | 分装为20 μL（每μL含1单位），于-70 °C保存，使用前解冻 |
| Superdex 200 16/600 | 通用电气 | 28989335 | 凝胶过滤层析 |
| 凝胶过滤标准品 | Bio-rad | 151-1901 | |
| 离心过滤器 | Amicon | UFC800396 | |
| 结晶板 | Hampton research | HR3-083 | 96孔坐滴板 |
| JCSG核心试剂套装I-IV | Qiagen | 130924-130927 | 结晶筛选溶液 |
| 显微镜 | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem板 | Hampton research | HR3-158 | 24孔坐滴板 |
| 无机焦磷酸酶 | Sigma | 10108987001 | |
| 钼酸铵溶液 | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP底物 | Startagene | 200415-51 | |
| 分光光度计 | Biotek | SynergyH1 | 微孔板读板仪 |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
参考文献
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重印与许可
