重组蛋白表达，结晶和生物物理研究芽孢杆菌 - 保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG

摘要

炭疽芽孢杆菌是致命性吸入性炭疽的专性病原体，因此对其基因和蛋白质的研究受到严格管制。另一种方法是研究直系同源基因。我们描述了蜡状芽孢杆菌Bc1531中的炭疽杆菌直系同源物的生物物理化学研究，需要最少的实验设备和缺乏严重的安全性问题。

摘要

为了克服从真菌病​​原体研究基因和蛋白质时的安全限制和规定，可以研究其同源物。 炭疽芽孢杆菌是引起致命性吸入性炭疽的专性病原体。 蜡状芽孢杆菌被认为是研究炭疽杆菌由于其进化关系密切的有用模型。 炭疽杆菌的基因簇ba1554 -ba1558与枯草芽孢杆菌中的bc1531-bc1535簇以及苏云金芽孢杆菌中的bt1364-bt1368簇具有高度保守性，表明了相关基因在芽孢杆菌属中的关键作用。该手稿描述了使用其在蜡样 芽孢杆菌bc1531中其直向同源物的重组蛋白质来制备和表征来自炭疽杆菌的基因簇的第一基因（ ba1554 ）的蛋白质产物的方法。

引言

重组蛋白表达被广泛用于克服与天然蛋白质来源有关的问题，如有限的蛋白质量和有害的污染。此外，在致病基因和蛋白质的研究中，可以使用不需要额外的安全预防措施的替代实验室菌株。例如， 蜡状芽孢杆菌是研究炭疽芽孢杆菌的有用模型，由于它们的进化关系密切。

B.炭疽病是一种专门的病原体，在人类和家畜中引起致命的吸入性炭疽病，可能被用作生物武器² 。因此，炭疽杆菌的实验室研究受到美国疾病控制中心的严格监管，要求生物安全3级（BSL-3）的做法，要求实验室区域以负压力隔离。与炭疽杆菌相反 。，蜡状芽孢杆菌被分类为BSL-1代理，因此具有最小的安全性问题。 蜡状芽孢杆菌是一种机会性病原体，在感染后会导致食物中毒，可以在没有医疗帮助的情况下治疗。然而，由于蜡状 芽孢杆菌与炭疽杆菌共享许多关键基因，可以使用蜡样芽孢杆菌 ¹的相应同系物研究炭疽杆菌蛋白质的功能。

炭疽杆菌的ba1554 - ba1558基因簇与bc1531 - bc1535簇高度保守 的蜡状 芽孢杆菌 ，以及苏云金芽孢杆菌的bt1364-bt1368簇，在基因组织和序列方面。此外，各簇的第一个基因（ ba1554 ， bc1531和bt1364 ）是绝对保守的（ 即 100％核苷酸序列同一性），暗示在芽孢杆菌属中引起基因产物的关键作用。由于其在这些基因簇中的位置， ba1554被误认为是推定的转录调节因子³ 。然而， ba1554产品的氨基酸序列分析表明它属于MazG家族，其具有核苷酸的焦磷酸水解酶活性，与转录因子活性无关^4,5 。虽然属于MazG家族的蛋白质在总体序列和长度上是不同的，但它们共有一个共同的〜100个残基的MazG结构域，其特征在于EXXE _12-28 EXXD基序（"X"代表任何氨基酸残基，表示X残基数）。

MazG域并不总是直接涉及某种催化活性。来自大肠杆菌 （EcMazG）的MazG成员具有两个MazG结构域，但是C末端MazG结构域具有酶活性⁶ 。此外，MazG酶的底物特异性从非特异性核苷三磷酸（对于EcMazG）到特异性dCTP / dATP（用于整联蛋白相关MazG）和dUTP（对于dUTP酶） ^{6,7,8,9不同} 。因此，BA1554蛋白的生物物理化学分析是确定其NTPase活性和破译其底物特异性所必需的。

在这里，我们提供了一个分步骤方案，大多数没有BSL-3设施的实验室可以跟踪分子水平上表现为蜡状芽孢杆菌b1515基因的蛋白质产物，这是B. anthracis ba1554的直系同源物。简言之，重组BC1531（rBC1531）在大肠杆菌中表达 ，并使用亲和标签纯化。对于X射线晶体学实验，结晶筛选和优化rBC1531蛋白的定位条件。为了评估rBC1531的酶活性，以比色法监测NTPase活性，以避免常规使用的放射性标记的核苷酸。最后，对获得的生物物理化学数据的分析使我们能够确定rBC1531的低聚状态和催化参数，以及从rBC1531晶体获得X射线衍射数据。

方案

重组蛋白的生产和纯化rBC1531

1. 制备重组BC1531蛋白（rBC1531）表达质粒
   1. 准备蜡样芽孢杆菌的基因组DNA ¹⁰ 。
   2. 分别使用正向和反向引物（参见材料列表），通过聚合酶链反应（PCR）从蜡样芽孢杆菌基因组DNA模板扩增bc1531基因，分别产生BamHI和SalI限制酶位点。
   3. 使用Bam HI和Sal I，如前所述，对PCR产物和修饰的pET49b载体（pET49bm）进行消化 。
   4. 如前所述，将步骤1.1.3中的消化PCR产物和载体（3:1比例）与T4 DNA连接酶在10μL反应中混合。在18℃孵育30分钟。
   5. 将3μL连接反应液移取到50μL化学品中将大肠杆菌 DH5α细胞置于管中。通过上下移动轻轻混合，放在冰上30分钟。在42°C下热冲击45秒。加入1mL Luria-Bertani（LB）培养基，并在剧烈振荡（250rpm，37℃，45min）下培养细胞。
   6. 取100μL来自步骤1.1.6的转化细胞，并用100μg/ mL卡那霉素（Kan）将它们扩散到LB-琼脂平板上。在37°C孵育〜18 h。
   7. 使用无菌尖端挑取菌落，并在含有100μg/ mL Kan的3mL LB培养基中培养细胞;剧烈振荡（250rpm，37℃，18h）。
   8. 如上所述，使用碱性SDS裂解法制备质粒DNA。
   9. 使用DNA测序确认rBC1531表达构建体的核苷酸序列¹² 。
2. rBC1531蛋白的过表达
   1. 用rBC1531-exp重新转化大肠杆菌 BL21（DE3）菌株对于过表达，如步骤1.1.5-1.1.6所述。
   2. 选择菌落并在含有50μg/ mL Kan（LB + Kan）的LB培养基中培养;在37℃下剧烈振荡18小时。
   3. 在1L LB + Kan培养基中接种10mL的过夜培养物，并在37℃下生长，直到OD ₆₀₀ （ _600nm的光密度）达到〜0.7。
   4. 将培养物在冰冷水中浸泡约15分钟，将温度降至18℃，并加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1mM的培养物中用于重组蛋白表达。在18°C下培养另外约16-18小时的培养物。
3. 纯化rBC1531
   1. 通过离心（5,000×g，4℃，30分钟）收获细胞。仔细丢弃上清液，以免干扰细胞。将细胞重新悬浮在50mL含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中。
   2. 通过在冰上超声处理细胞两次以防止细胞裂解物过度​​加热（时间:2分30秒;周期:5秒;循环:10秒;振幅:38％）。
   3. 通过离心（约25,000 xg，4℃，30分钟）清除细胞裂解物。
   4. 混合3 mL镍珠和60 mL含有10 mM咪唑的PBS，并重新流过额外的缓冲液，以在2.5 x 10 cm玻璃色谱柱中沉淀平衡的镍珠。
   5. 移液以将步骤1.3.3的上清液转移到具有预平衡镍珠的柱上，并在低速（〜20rpm）的旋转轮上在4℃下孵育2小时。
   6. 允许上清液通过重力排出并用含有10mM咪唑的PBS洗涤柱中的镍珠三次。
   7. 通过应用含有250mM咪唑的4×5mL PBS洗脱rBC1531蛋白。
   8. 取15μL步骤1.3.7的洗脱液，并在15％SDS-PAGE上进行洗脱。可视化蛋白质条带凝胶采用考马斯蓝染色¹⁰ 。
4. 通过凝血酶蛋白水解去除rBC1531蛋白的亲和标签
   1. 将各部分吸入透析管（分子量切断:3kDa），并将管置于含有4μL凝血酶裂解相容缓冲液（20mM HEPES，pH7.4,150mM NaCl和1.5mMβ-巯基乙醇）的烧杯中，在4℃过夜。
   2. 移取馏分并将其转移到锥形管中。
   3. 测量280nm处的吸光度并估计rBC1531蛋白质浓度，如图^13所示 。
   4. 在0.5 mL管中取50μgrBC1531，加入不同量的凝血酶（ 即 2,1,0.6和0.3单位）。将rBC1531和凝血酶反应在20℃孵育〜3小时，以确定切割N端亲和标记所需的凝血酶最少量。
   5. 运行rBC1531和凝血酶反应15％SDS-PAGE，并确定最终量的凝血酶（ 例如，每50μgrBC1531的0.3单位凝血酶），其完全消化N端亲和标签并产生无标记的rBC1531。
   6. 在15 mL管中加入10 mg rBC1531蛋白和60单位凝血酶，并在20℃下孵育约3 h，进行凝血酶 - 蛋白水解反应。
   7. 将凝胶过滤标准品应用于尺寸排阻色谱（SEC）色谱柱，以制备分子量和洗脱体积的标准曲线，如¹³所述。
   8. 将来自步骤1.4.6的凝血酶消化的rBC1531蛋白置于离心过滤管（分子量切断:3kDa）中，并在4℃下以3,000g离心以减少至小于5mL的体积。
   9. 将浓缩的rBC1531蛋白应用于SEC柱，并以每管0.5mL收集60个洗脱级分¹³ 。
   10. 取15μL每个级分，在15％SDS-PAGE上运行，在使用考马斯染色溶液（0.15％（w / v）考马斯亮蓝，40％（v / v）甲醇和10％（v / v）冰乙酸）的凝胶上。
   11. 移取含有rBC1531的级分，并将其收集在一个管中。

rBC1531的结晶筛选和优化

1. rBC1531蛋白结晶筛选条件
   1. 使用离心过滤管将rBC1531从步骤1.4.11浓缩至约18.5mg / mL，如步骤1.4.8所述。
   2. 将每个结晶筛选溶液（见2.2）的50μL添加到96孔定滴结晶板的孔中。将0.5μL18.5 mg / mL rBC1531蛋白质溶液放在一张坐卧上。将蛋白质溶液与0.5μL井溶液混合，重复整个板的过程。
   3. 用透明粘合膜覆盖板。将96孔板置于18°C，允许蒸气扩散。
   4. 使用光学显微镜以20-40倍的放大倍数扫描液滴，每天监测晶体形成2-3周。
   5. 使用获得的rBC1531蛋白晶体收集X射线衍射数据¹² 。
2. 优化rBC1531结晶条件
   1. 准备500μL所选择的初始结晶条件溶液（ 例如， 0.1M二甲胂酸钠，pH 6.5和1.0M柠檬酸钠），并填充24孔结晶板用于坐下水滴。
   2. 将0.5μL的18.5mg / mL rBC1531蛋白溶液加入到坐式床上，与0.5μL的溶液混合，并用透明的粘合剂膜立即盖住板。将板放在18°C。
   3. 在光学显微镜下观察晶体生长一周。
   4. 通过改变pH来优化各种结晶条件（ 即，pH5.5-6.8）和柠檬酸钠的盐浓度（ 即 0.9-1.2M），以获得单晶。监测晶体生长约1周，并收集X射线衍射数据¹² 。

3.RBC1531的核苷三磷酸酶（NTPase）活性的表征

1. 无机磷酸盐依赖性比色研究的验证
   1. 制备焦磷酸钠（100mM），并在200μL反应缓冲液（20mM HEPES，pH 7.4;150μl）中稀释至0.1,0.25,0.5,1.0,5.0,10,50,100和250μM的终浓度mM NaCl;和2mM MgCl ₂ ）复制96孔板。使用第一块板作为对照（不含焦磷酸酶）。确保第二块板含有焦磷酸酶作为工作板，如步骤3.1.2中所述。
   2. 加入0.01单位酿酒酵母无机p将γ-磷酸酶（1μL）加入到工作板的孔中，并在20℃下孵育30-60分钟。
   3. 通过以7:3的比例混合钼酸铵（0.86％v / v）和抗坏血酸（14％v / v）溶液来制备钼酸盐溶液。在工作井和对照井中加入16μL钼酸溶液，并等待15 min。
   4. 读取690nm（OD _690nm ）的光密度。
2. 比色NTP酶测定
   1. 准备100微克核苷三磷酸（NTP）底物，并稀释至所需浓度（ 如 0,0.2,4.4,11,22,44,88或132μM），在180μL测定缓冲液（20mM HEPES， pH 7.4; 150mM NaCl;和2mM MgCl ₂ ）。
   2. 在96孔板中加入20μgrBC1531（1.5mM）和步骤3.2.1中的NTP底物，每个反应最多200μL，上下移液以混合。用盖盖住板，并将其置于37℃的培养箱中30分钟进行底物水解反应。
   3. 将板转移到70℃的水浴中，静置15分钟以停止rBC1531介导的催化反应。
   4. 向反应板的每个孔中加入0.01单位的酿酒酵母无机焦磷酸酶（1μL）（步骤3.2.3），并在20℃下孵育30分钟。向反应板中加入16μL钼酸溶液以显色（〜15分钟）。读取OD _690nm 。
   5. 使用Michaelis-Menten方程进行分析，如第¹²节所述。

结果

本研究中所关注的蛋白质的表征开始于制备足量的重组乙型肝炎杆菌bc1531 （rBC1531）蛋白，优选多于几毫克。通过使用蜡状芽孢杆菌的基因组DNA作为模板，通过PCR制备编码BC1531蛋白的DNA片段，因为它含有与ba1554相同的直系同源基因。 rBC1531在大肠杆菌细胞中被过表达为可溶性蛋白。 rBC1531蛋白在其N末端¹²处用6x-组氨酸标签和凝血酶切割位点表达。作为纯化的第一步，通过镍亲和层析纯化rBC1531（ 图1A ）。接下来，进行凝血酶消化试验以确定从rBC1531完全消化亲和标签所需的凝血酶的最低量（ 图1A ）。在我们手中，0.3单位的凝血酶是suf无法从rBC1531中完全删除亲和性标签。因此，当结垢时，用60单位凝血酶处理10mg rBC1531以进行标签去除。凝血酶消化后，将无标记的rBC1531应用于SEC柱以除去任何可溶性聚集体和较高或较低分子量的污染物。通过SDS-...

讨论

由于安全限制和法规，对真实病原体的研究受到限制。或者，可以使用进化相关的非病原体或致病性较低的物种来研究病原体。 ba1554 基因被认为是 炭疽杆菌的关键基因。幸运的是，非临床 蜡样芽孢杆菌 中存在相同的基因。因此，在没有严重安全问题的情况下，重组 BC1531 蛋白可用于生物物理和酶促表征。在这里，我们描述了详细的程序，从基因转移到纯化的重组蛋白。利用重组蛋白进行生物物理表征分析，发现四聚体rBC1531催化NTP水解成NMP和PPi。

SEC被用作蛋白质纯化的最后一步，以去除来自细胞裂解物的任何蛋白质污染物，这些污染物的大小与rBC1531不同。还使用SEC色谱柱测定rBC1531（四聚体）的寡聚化状态。rBC1531的晶体结构一致被确定为四聚体¹²。

在生物物理技术中，X射线晶体学是生成蛋白质原子模型的最佳技术。一般来说，X射线衍射需要尺寸大于0.1mm的三维奇异晶体。为了获得适合X射线衍射的晶体，优化了结晶条件。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bacillus cereus ATCC14579	韩国组织培养保藏品	3624
基因组 DNA 制备试剂盒	GeneAll	106-101	基因组 DNA 制备
正向引物	Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA	BamHI 位点下划线
反向引物	Macrogen	CTTGTCGACTTATTCTTTCTCTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI 位点带下划线
nPfu-Forte	Enzynomics	P410	PCR 聚合酶
BamHI	Enzynomics	R003S
SalI	Enzynomics	R009S
pET49b 表达载体	Novagen	71463	修饰表达载体以添加亲和标签和 BamHI/SalI 位点10
T4 DNA 连接酶	酶学	M001S
透析 memebrane	Thermofisher	18265017
干块加热器	JSR	JSBL-02T
LB 肉汤 （Luria-Bertani）	LPS 溶液	LB-05
LB 琼脂，Miller （Luria-Bertani）	Becton， Dickinson and Company
卡那霉素	LPS 溶液	KAN025
小量制备试剂盒	Favorgen	FAPDE300	质粒 DNA 制备
BL21（DE3） 感受态细胞	Novagen	69450-3CN
异丙基 &β;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）	Fisher BioReagents	50-213-378
氯化钠	大中	7548-4100	PBS 材料
氯化钾	大中	6566-4405	PBS 材料
磷酸钾	Bio Basic Inc	PB0445	PBS 材料
磷酸钠	Bio Basic Inc	S0404	PBS 材料
咪唑	Bio Basic Inc	IB0277
Sonics		VCX 130
Ni-NTA 琼脂	Qiagen	30210	镍珠
旋转器	Finepcr	AG
Precision Plus 蛋白质双色标准品	生物辐射	1610374	SDS-PAGE 蛋白质标准品
考马斯亮蓝 R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	考马斯染色液
甲醇	三春化工	M0585	考马斯染色液
乙酸	Daejung	1002-4105	考马斯染色液
透析	Thermofisher	68035
2-巯基乙醇	Sigma-aldrich	M6250
凝血酶	Merckmillipore	605157-1KUCN	制备 20 μ 的等分试样;L （每亩 1 单位;L） 并储存在 70 °使用前试炼
Superdex 200 16/600	通用电气	28989335	尺寸排阻色谱
凝胶过滤标准	Bio-rad	151-1901
离心过滤器	Amicon	UFC800396
水晶化板	Hampton research	HR3-083	96 孔坐式滴板
JCSG 核心套件 I-IV	Qiagen	130924-130927	结晶分离溶液
显微镜	尼康	SMZ745T
Cryschem 板	汉普顿研究	HR3-158	24 孔坐式滴板
无机焦磷酸酶	Sigma	10108987001
钼酸铵溶液	Sigma	13106-76-8
L-抗坏血酸	Sigma	50-81-7
NTP 底	Startagene	200415-51
分光光度计	Biotek	SynergyH1	微孔板检测仪
GraphPad Prism 5	GraphPad	Prism 5 用于窗口