建立基于临床的生物样本库

摘要

皮肤肿瘤在莫氏显微外科手术后通常会被丢弃。本文介绍了一种方案，可使临床辅助人员在不影响临床操作的情况下，有效处理和储存皮肤肿瘤（例如，鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤）样本，用于后续的实验室应用。

摘要

皮肤癌（例如，鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤）的发病率在过去几年中持续上升。预计对皮肤肿瘤样本在生物医学研究中的需求也将相应增加。然而，由于建立生物样本库的成本较高，以及缺乏不影响临床操作的临床样本获取方案，组织样本的可获得性受到限制。为此，已制定一项方案，用于采集和处理皮肤肿瘤及其相关的血液和唾液样本，该方案在 Mohs 手术当日对常规临床操作的影响极小。皮肤恶性肿瘤经活检证实并接受 Mohs 手术治疗的患者，其肿瘤样本由 Mohs 组织技术员在其接受第一层 Mohs 手术时采集和处理。邻近的正常组织则在手术缝合时采集。此外还可采集全血和口腔拭子样本。通过利用通常会被丢弃的组织样本，建立了一个基于临床而非实验室环境的生物样本库，具有多项关键优势：样本种类广泛；可获取去标识化的患者病历资料，包括病理报告；对于典型供体，在随访期间还可获取额外的样本。

引言

癌症和生物标志物研究依赖于高质量的人体组织样本供应，而样本供应有限已阻碍了相关研究^1,2。许多皮肤病学研究受限于人体组织样本供应不足、质量参差不齐以及使用成本高昂等问题。建立一个大型专用生物样本库的成本估计约为两百万美元³，此类高昂成本使许多研究人员难以获取人体组织样本。此外，若操作不当，研究样本的采集和储存过程可能影响临床工作流程，延误患者诊疗。目前已建立一种经济高效的、基于临床的生物样本库，专注于皮肤癌样本，并遵循推荐的最佳实践和样本验证标准^4,5,6。

本方案是在一家进行大量皮肤鳞状细胞癌（SCC）、基底细胞癌（BCC）和黑色素瘤皮肤癌莫氏显微外科手术的皮肤科诊所中开发的。可从该患者群体中招募志愿捐献者。应在样本采集现场建立生物样本库，以便在不延误治疗的前提下，快速获取已签署知情同意书患者的组织和血液样本。从同一家诊所收集样本可最大限度减少采集技术的差异，并降低样本质量的变异，从而避免对后续应用造成问题^7,8

方案

所有关于人体组织样本的实验均经西方机构审查委员会批准（WIRB 方案编号 #20142461）。采集这些组织样本的唯一标准是经活检证实诊断为鳞状细胞癌（SCC）。原始机构审查委员会方案中未规定排除标准，但未使用已知患有血液传播传染病患者的样本。在采集皮肤组织、血液和唾液前，均已获得知情同意。中西部大学的中西部机构审查委员会已批准在中西部大学（AZ#807）使用基于临床的生物样本库样本进行验证工作。

1. 皮肤肿瘤组织处理

注意：此操作应由莫氏组织技术员执行。

1. 新鲜鳞状细胞癌（SCC）组织的RNA提取与外植体培养处理
   1. 在莫氏外科医生切除组织后，取10至50 mg（≥10 mm）的组织样本³在进一步处理之前，于组织松弛（即将组织进行操作以使其平展贴附于载玻片上的过程）期间，从组织顶端面中心采集组织样本。
      ​注意：仅当肿瘤足够大，能够提供10-50 mg（≥10 mm）大小的样本时，才可进行此操作²在进行组织学评估之前需将其切除，这是莫氏手术的一部分。如果肿瘤体积过小，无法保留至少 2 mm 的切缘³ 将被移除，无需进行RNA处理（跳过步骤5）。
   2. 使用镊子将存活组织转移至含有培养基（DMEM:Ham's F-12 培养基1:1混合液....

结果

肿瘤组织和邻近正常组织（ANT）已成功用于蛋白质分离，并通过蛋白质印迹法进行检测。如图3所示，在本临床生物样本库收集和保存的患者样本中，可检测到皮肤鳞状细胞癌标志物（Muc1¹⁴、FHL-1¹⁵ 和 p40^16,17）。

图3：ANT和SCC组织中提取蛋白质的分析。

讨论

据作者所知，本方案是首个专注于以经济高效且快速的方式获取皮肤组织样本的临床操作流程。接受莫氏显微手术的患者通常在特定时间段内安排手术，因此样本采集仅限于这些时段。样本采集过程需要参与患者护理的医助人员、负责处理肿瘤样本的莫氏组织技术员，以及负责样本登记和血液处理的指定实验室人员共同协作完成。

三名采集团队成员之间的密切配合即， 我们发现，现有的医疗助理人员能够在不影响门诊正常运作的情况下，完成每天收集3至5份组织样本的相关附加任务。获取患者知情同意以及采集口腔拭子和血液样本均在莫氏显微外科手术过程中的常规等待时间内完成。除决定样本处理方式外，莫氏组织技术员所负责的各项任务均在当日莫氏样本处理结束后进行，通常每日额外增加约30分钟工作时间。通常由一名门诊工作人员负责血液样本的标记与处理，并执行样本向数据库的转移和录入。根据处理样本数量的不同，这些职责可能需要工作人员投入大量原本用于其他工作的時間；因此，仅在实验室人员配备充足的情况下才应开展样本采集工作。具体而言，若单日采集超过5份样本，或从多名患者处采集血液样本，则需要实验室技术人员额外投入数小时工作时间。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer 含 K3EDTA 塑料采血管	ThermoFisher Scientific	02-685-2B
Electron Microscopy Sciences 双刃刀片	ThermoFisher Scientific	50-949-411
弯曲中头通用镊子	ThermoFisher Scientific	16-100-110
优质微量离心管	ThermoFisher Scientific	05-408-138
Lonza Walkersville KGM 角质形成细胞培养基	ThermoFisher Scientific	NC9791321
Electron Microscopy Sciences 组织包埋剂 TEK OCT	ThermoFisher Scientific	50-363-579
Leica CM1950 冷冻切片机	Leica Biosystems	14047743909
磨砂载玻片	ThermoFisher Scientific	12-550-343
Shandon 快速铬苏木精-伊红（H&E）冷冻切片染色试剂盒	ThermoFisher Scientific	99-900-01
Nalgene 长期储存冻存管	ThermoFisher Scientific	03-337-7X
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab	ThermoFisher Scientific	NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA 裂解缓冲液	ThermoFisher Scientific	50-195-822
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液	ThermoFisher Scientific	PI78443
Eppendorf 5424R 微型离心机	ThermoFisher Scientific	05-401-203
Pellet Morter 无线匀浆器	ThermoFisher Scientific	12-141-3
无 RNA 酶 Pellet Pestle	ThermoFisher Scientific	121-141-364
Forma SteriCycle CO2 培养箱	ThermoFisher Scientific	13-998-089
HyClone 胎牛血清	ThermoFisher Scientific	SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 培养基	ThermoFisher Scientific	12-634-028
Gibco 青霉素-链霉素溶液	ThermoFisher Scientific	15140148
Gibco 1 M Hepes 缓冲液	ThermoFisher Scientific	15-630-130
Nunc 细胞培养皿（35 mm，带透气盖）	ThermoFisher Scientific	1256591
抗 CFH 单克隆抗体，克隆 OX-24	Abnova	MAB12583
抗 p40（p63 delta）抗体	Abnova	ABX-144A
抗 MUC-1 抗体	Santa Cruz Biotech	sc-7313
抗 Snail + Slug（磷酸化 S246）抗体	Abcam	Ab63568
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488 标记	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 568 鬼笔环肽	Molecular Probes	A12380
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Molecular Probes	P36941
配备 Axiocam 相机的 Zeiss Axio Imager Z1 显微镜	Zeiss	4300009901
配备 DP72 相机的 Olympus IX51 相差显微镜	Olympus	IX511F3