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方法文章

建立基于临床的生物样本库

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DOI：

10.3791/55583

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2017年5月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

本文内容

摘要

皮肤肿瘤在莫氏显微外科手术后通常会被丢弃。本文介绍了一种方案，可使临床辅助人员在不影响临床操作的情况下，有效处理和储存皮肤肿瘤（例如，鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤）样本，用于后续的实验室应用。

摘要

皮肤癌（例如，鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤）的发病率在过去几年中持续上升。预计对皮肤肿瘤样本在生物医学研究中的需求也将相应增加。然而，由于建立生物样本库的成本较高，以及缺乏不影响临床操作的临床样本获取方案，组织样本的可获得性受到限制。为此，已制定一项方案，用于采集和处理皮肤肿瘤及其相关的血液和唾液样本，该方案在 Mohs 手术当日对常规临床操作的影响极小。皮肤恶性肿瘤经活检证实并接受 Mohs 手术治疗的患者，其肿瘤样本由 Mohs 组织技术员在其接受第一层 Mohs 手术时采集和处理。邻近的正常组织则在手术缝合时采集。此外还可采集全血和口腔拭子样本。通过利用通常会被丢弃的组织样本，建立了一个基于临床而非实验室环境的生物样本库，具有多项关键优势：样本种类广泛；可获取去标识化的患者病历资料，包括病理报告；对于典型供体，在随访期间还可获取额外的样本。

引言

癌症和生物标志物研究依赖于高质量的人体组织样本供应，而样本供应有限已阻碍了相关研究1,2。许多皮肤病学研究受限于人体组织样本供应不足、质量参差不齐以及使用成本高昂等问题。建立一个大型专用生物样本库的成本估计约为两百万美元3，此类高昂成本使许多研究人员难以获取人体组织样本。此外，若操作不当，研究样本的采集和储存过程可能影响临床工作流程，延误患者诊疗。目前已建立一种经济高效的、基于临床的生物样本库，专注于皮肤癌样本，并遵循推荐的最佳实践和样本验证标准4,5,6。

本方案是在一家进行大量皮肤鳞状细胞癌（SCC）、基底细胞癌（BCC）和黑色素瘤皮肤癌莫氏显微外科手术的皮肤科诊所中开发的。可从该患者群体中招募志愿捐献者。应在样本采集现场建立生物样本库，以便在不延误治疗的前提下，快速获取已签署知情同意书患者的组织和血液样本。从同一家诊所收集样本可最大限度减少采集技术的差异，并降低样本质量的变异，从而避免对后续应用造成问题7,8。

Mohs显微外科手术技术的目标是在尽可能保留健康组织的同时，确保完全切除所有癌变组织。该手术通过逐步切除肿瘤组织的薄层来进行，每切除一层后，均对组织进行冰冻切片并行H&E染色，再由皮肤科医生进行组织学检查，以判断是否已彻底清除癌变组织。整个切除与检查过程在患者留诊期间完成。该技术被认为是治疗鳞状细胞癌（SCC）的最佳选择9。此时，创面需要闭合，为促进愈合并改善外观，通常会同时切除邻近的正常组织（ANT）。因此，这种切除肿瘤的手术方法非常适用于为后续研究收集具有明确组织学特征的组织样本。

获取肿瘤组织、邻近正常组织、唾液和血液样本的采集流程已设计为对正常工作人员职责的影响降至最低（图1）。医疗助理在为患者准备手术操作的同时进行血液采集。莫氏手术完成后，莫氏组织技术员将为标本制备额外的组织学切片，并将组织转移至生物样本库。建立生物样本库的相关成本包括购买冷冻保存冰箱、建设适度规模的临床实验室空间，以及开发样本库存追踪程序。

样本采集流程；流程图；患者登记/离院、拭子采集、抽血、肿瘤切除。
图1：样本采集流程及负责人员。 在患者登记并获得知情同意后，医助人员采集口腔拭子并进行抽血。随后，皮肤科医生与医助人员共同切除肿瘤并缝合伤口，期间分别采集鳞状细胞癌（SCC）组织和邻近正常组织（ANT）。专职实验室技术人员负责处理血液样本，并对SCC和ANT组织样本进行切分，用于组织培养、保存以及入库至生物样本库。 请点击此处查看该图的放大版本。

所采集样本的多样性支持多种实验方法（图2）。从患者采集的样本包括口腔拭子（如有需要也可采集唾液）、全血以及切除的组织。口腔拭子及部分全血样本未经处理即保存，用于基因分型和组织匹配。全血则分离为白细胞（WBC）和血浆组分，以供后续分析。经莫氏手术处理后，冷冻肿瘤组织直接置于液氮中，随后转移至-80 °C冰箱保存。新鲜且具有活性的肿瘤组织和ANT样本采用既往技术的改良方法进行培养10,11，然后进行冷冻保存。在采集过程中，每种样本的数量均在录入库存追踪程序前记录于电子表格中，以确保处理过程的准确性（表1）。

莫氏显微外科患者样本处理流程图，离心，组织学分析。
图 2：基于临床的生物样本库样本采集与处理流程示意图。 从患者采集口腔拭子和血液样本，用于后续基因分型和组织匹配。全血进一步处理以分离白细胞（WBC）并进行循环肿瘤细胞（CTC）分析，同时收集血浆用于液体活检分析。莫氏手术中切除的组织经组织学处理用于诊断目的，之后组织学切片可实验性地用于进一步的免疫组织化学分析。若切除的组织样本足够大，则取部分新鲜组织进行切分，用于蛋白质和RNA提取，并用于建立培养细胞系。请点击此处查看该图的放大版本。

采集日期：
患者 1患者 2患者 3患者 4患者 5
姓名缩写和出生日期
眼睛颜色
样本类型
样本位置
唾液
全血
血浆
肿瘤活性组织
正常组织活性
肿瘤 Mohs 液氮冷冻样本
正常组织液氮冷冻样本
切片

表1：样本采集记录清单。 每次采集样本时需跟踪并记录的数据包括患者姓名首字母、出生日期和眼睛颜色（用于皮肤分型），以及标本采集部位。同时记录采集的唾液样本数量、血液采集体积，以及可存活和已保存的组织标本数量，作为后续使用分配的参考依据。请点击此处下载该文件。

为验证样本采集流程，已对每种样本类型在下游应用中进行了测试。通过改进既往技术12，肿瘤组织和癌旁正常组织（ANT）已成功用于蛋白质和RNA的提取，并有望用于DNA提取。由组织切片建立的活性外植体已通过显微镜进行评估，而保存的组织学切片则用于免疫组织化学和免疫荧光分析。

通过遵循本方案中所述的步骤，可将此模式推广至其他皮肤科诊所、其他肿瘤类型（如黑色素瘤）以及其他外科专科和临床实践，从而为人类癌症的多层面研究提供人体组织样本。对于不同的临床实践，可能需要对此方案进行少量修改，但原则上，该方案适用于所有在常规患者治疗过程中丢弃患者样本的外科临床实践。

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方案

所有关于人体组织样本的实验均经西方机构审查委员会批准（WIRB 方案编号 #20142461）。采集这些组织样本的唯一标准是经活检证实诊断为鳞状细胞癌（SCC）。原始机构审查委员会方案中未规定排除标准，但未使用已知患有血液传播传染病患者的样本。在采集皮肤组织、血液和唾液前，均已获得知情同意。中西部大学的中西部机构审查委员会已批准在中西部大学（AZ#807）使用基于临床的生物样本库样本进行验证工作。

1. 皮肤肿瘤组织处理

注意：此操作应由莫氏组织技术员执行。

  1. 新鲜鳞状细胞癌（SCC）组织的RNA提取与外植体培养处理
    1. 在莫氏外科医生切除组织后，取10至50 mg（≥10 mm）的组织样本3在进一步处理之前，于组织松弛（即将组织进行操作以使其平展贴附于载玻片上的过程）期间，从组织顶端面中心采集组织样本。
      ​注意：仅当肿瘤足够大，能够提供10-50 mg（≥10 mm）大小的样本时，才可进行此操作2在进行组织学评估之前需将其切除，这是莫氏手术的一部分。如果肿瘤体积过小，无法保留至少 2 mm 的切缘3 将被移除，无需进行RNA处理（跳过步骤5）。
    2. 使用镊子将存活组织转移至含有培养基（DMEM:Ham's F-12 培养基1:1混合液，25 mM HEPES，100 IU/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素）的已标记1.5 mL离心管中，并确保组织完全浸没于培养基中。在进一步处理前，将该离心管置于4 °C保存。
    3. 在24小时内将组织用于RNA提取和表达分析（见步骤5）和/或建立外植体培养（见步骤6）。
    4. 将从患者体内切除的肿瘤样本剩余部分（步骤 1.1.1）置于冷冻切片机组织托上（或 "夹头"将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在持载器内冷冻组织，以完成莫氏显微外科组织学检查，并为后续实验分析制备额外的组织学切片。
  2. 组织学切片的制备
    1. 使用冷冻切片机切割7 µm厚的组织切片，每份肿瘤样本制备两片或更多载玻片。确保每张载玻片包含最多三个完整的肿瘤切片。
      ​注意：将使用 H 对两张载玻片中的一张进行染色&E 由莫氏组织技术员处理，额外的切片可进行免疫荧光、免疫组化或荧光原位杂交分析。
    2. 将切片置于丙酮中固定组织 1–2 秒。将这些切片放置一旁晾干。不要进行 H&E 染色或加盖盖玻片，用于后续免疫荧光（IF）、免疫组织化学（IHC）或荧光检测的载玻片 原位 荧光原位杂交（FISH）分析，具体取决于实验方案。
  3. 莫氏手术后组织的处理
    1. 莫氏手术处理完成后（步骤1.1–1.2），在冷冻切片机舱内将样本从冷冻包埋介质中剥离，并将组织置于已标记的冷冻管中。
    2. 将标记好的小瓶置于液氮中，确保组织尚未解冻。若样品需用于蛋白质和/或DNA分析，可在数分钟内转移至液氮或-80 °C超低温冰箱中保存，以备后续进行蛋白质表达和DNA突变分析（见步骤4-5）。
      ​注意：若需从莫氏手术后样本中提取完整RNA，在将其从冷冻包埋介质中取出时，必须保持样本处于冷冻状态。若此步骤操作不够谨慎，则该莫氏手术后样本应仅用于蛋白质和/或DNA分析。
  4. 新鲜ANT的处理
    1. 在莫氏手术缝合时，从莫氏外科医生处获取前哨淋巴结活检标本（ANT）。
    2. 用镊子从正常组织的顶端去除与SCC样本中收获量相等或更多的ANT，并转移至含有培养基的标记1.5 mL离心管中（培养基为DMEM:Ham's F-12（1:1）混合液，添加25 mM HEPES、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。
    3. 将组织完全浸入相同的培养基中，并在 4 °C 下保存，直至后续处理（见步骤 4-6）。

2. 血液、唾液和口腔拭子处理

  1. 通过静脉穿刺采集约 10 mL 血液至 EDTA 采血管中。
  2. 将血液从采血管转移至无菌的 15 或 50 mL 离心管中。吸取约 200 µL 至 1.5 mL 冻存管中，避免产生气泡；将此全血样本储存于 -80 °C，以备将来进行基因分型和组织配型（如有需要）。
    1. 将剩余血液在 1,000 x g 条件下离心 30 分钟，并按照标准操作程序收集血浆组分。
    2. 将血浆以每份 1 mL 分装至 1.5 mL 冻存管中，于 -80 °C 保存，用于后续液体活检分析。
  3. 使用无菌拭子采集口腔黏膜细胞样本，并将拭子置于无菌管中，室温保存。
  4. 如有需要，可采集唾液样本，并置于无菌管中，室温保存。
    注：这些样本可用于将来进行基因分型和组织配型（如有需要）。

3. 样品记录保存

  1. 将患者样本清单中的信息转移至生物样本库数据库中，包括从患者病历中获取的患者信息和诊断结果。
  2. 为每份样本打印带有条形码的标签，并在数据库中逐一记录，以将每份采集的样本与患者数据关联。
  3. 在将去标识化样本转移至研究实验室之前，记录样本在生物样本库数据库中的分发情况。

4. 蛋白质分离与蛋白质印迹分析

  1. 将每个组织样本（SCC 和/或 ANT）放入含有 500 µL 细胞裂解缓冲液的离心管中，每 100 mg 组织加入含蛋白酶抑制剂的裂解液以裂解组织。
    注意：我们使用了放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液，其成分为 50 mM Tris（pH 8.0）、150 mM NaCl、0.5% 脱氧胆酸钠、1.0% NP-40 和 0.1% SDS。也可使用其他细胞裂解缓冲液。
  2. 在 4 °C 条件下，使用组织匀浆器以每 20 秒为间隔，总共 5 分钟的时间对组织进行匀浆。在 21,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟，收集含有蛋白质的上清液至新的离心管中。使用相同条件再次离心上清液，并将最终上清液转移至新的离心管中。
  3. 取每个样本中的 30–50 µg 蛋白质，使用 4–20% SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶进行电泳。如需观察蛋白条带，可用考马斯亮蓝对凝胶染色。
  4. 若需进行目标蛋白的 Western 印迹分析，可按照标准操作流程将凝胶中的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。转移完成后，如需观察蛋白条带，可用 Ponceau 染色法对 PVDF 膜进行染色。
  5. 按照标准操作流程封闭 PVDF 膜，并使用特异性一抗检测目标蛋白，同时选用针对一抗的相应二抗，抗体浓度应遵循生产商推荐用于 Western 印迹分析的用量。
  6. 使用化学发光底物孵育已结合抗体的膜，并利用成像系统对膜进行成像。

5. RNA 提取与定量聚合酶链式反应（qPCR）

  1. 立即按照制造商的说明，将新鲜组织样本（SCC和/或ANT）放入含有RNA稳定溶液的1.5 mL离心管中，将Mohs手术后组织样本放入含有冷冻组织过渡溶液的1.5 mL离心管中。确保组织完全浸没。将这些样本储存于-80 °C直至使用。
  2. 从-80 °C取出RNA样品，在冰上解冻。将组织转移至新的1.5 mL离心管中，每50–100 mg组织加入1 mL RNA提取缓冲液（苯酚/硫氰酸胍）。
  3. 使用组织匀浆器裂解组织。进行六个匀浆循环，每个循环后冷却样品；每个循环包括在 4 °C 下匀浆 20 秒，随后冷却 40 秒。匀浆完成后，将样品在室温下孵育 5 分钟。
  4. 每1 mL RNA提取缓冲液中加入0.2 mL氯仿，用手剧烈振荡试管15秒。室温孵育2–3分钟。
  5. 在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心样品 15 分钟。移除样品的水相，并将其转移至新的 1.5 mL 离心管中。
  6. 每使用1 mL步骤5.2中的RNA提取缓冲液，向水相中加入0.5 mL 100%异丙醇，室温孵育10分钟。
    注意：如果预期 RNA 产量较低（即， 起始组织体积小于10 mg时，样品可在-80 °C沉淀过夜。此外，在异丙醇沉淀步骤中，每500 µL RNA提取缓冲液可添加5 µg无RNase的糖原，以提高RNA得率。
  7. 在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 10 分钟。弃上清，用 1 mL 75% 乙醇洗涤沉淀。
  8. 短暂涡旋混匀样品，然后在 4 °C 下以 7,500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物在空气中干燥 5–10 分钟。
  9. 将RNA沉淀重悬于20 µL无RNase的水中。
    1. 如有需要，可使用RNA纯化试剂盒，按照制造商的说明对每个RNA样本进行纯化。
      注意：如果执行此步骤，样品中的小RNA将会丢失。
  10. 使用1.2%甲醛-MOPS琼脂糖凝胶对1 µg样品进行电泳，以分析RNA的质量。
    注意：作为替代方案，可使用生物分析仪分析样品以获得RIN值13.
  11. 使用逆转录方法将RNA反转录为cDNA，用于后续qPCR分析目标mRNA（或miRNA）。

6. 组织外植体培养

  1. 在培养前，将切除的组织浸入70%乙醇中进行灭菌。
  2. 将组织置于载玻片或培养皿上，加入足量培养基（DMEM与Ham's F-12按1:1混合，添加10%胎牛血清、25 mM HEPES、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），以完全覆盖组织（防止组织干燥）。使用手术刀片小心地将组织切成碎块（<1 mm3）。
  3. 将组织碎块转移至35 mm组织培养皿中，并在每一块碎块上滴加约20 µL胎牛血清（FBS）。
  4. 将培养皿在超净工作台中敞口放置20–30分钟，或直至几乎干燥。
  5. 向每个培养皿中加入1 mL培养基（DMEM与Ham's F-12按1:1混合，添加10%胎牛血清、25 mM HEPES、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），于37 °C、5% CO2条件下培养。如需进行传代培养或亚克隆，可适时操作。

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结果

肿瘤组织和邻近正常组织已成功用于蛋白质分离，并通过蛋白质印迹法进行检测。如图3所示，在本临床生物样本库收集和保存的患者样本中，可检测到皮肤鳞状细胞癌的标志物（Muc114、FHL-115 和 p4016,17）。

通过SDS-PAGE和Western blot进行蛋白质分析；MUC1、FHL-1、p40检测的凝胶泳道比较。
图3：ANT和SCC组织中提取蛋白质的分析。

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讨论

据作者所知，本方案是首个专注于以经济高效且快速的方式进行皮肤组织样本临床采集的方法。接受莫氏显微手术的患者通常在特定时间段内安排手术，因此样本采集仅限于这些时段。样本采集工作需要参与患者护理的医助人员、负责处理肿瘤样本的莫氏组织技术员，以及负责样本登记和血液处理的指定实验室人员共同协作完成。

通过采集团队三名成员之间的密切配合即， 我们发现，现有的医疗助理人员能够在每天采集3-5份组织样本的同时，完成相关附加任务，且不会明显影响门诊的正常运作。患者知情同意书的签署以及颊黏膜拭子和血液样本的采集均在莫氏显微外科手术过程中的常规等待时间内完成。除决定样本处理方式外，莫氏组织技术员所负责的各项任务均在当日患者样本的莫氏处理流程结束后进行，通常每日额外增加约30分钟的工作时间。通常由一名诊所工作人员负责血液样本的标记与处理，并执行样本向数据库的转移和录入工作。根据处理样本数量的不同，这些职责可能需要工作人员长时间脱离原有岗位；因此，仅在实验室人员配备充足的情况下方可开展样本采集工作。具体而言，若单日采集样本超过5份，或从多名患者处采集血液样本，则实验室技术人员需额外投入数...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了中西部大学健康科学学院研究促进基金（授予EEH）以及中西部大学研究与资助项目办公室内部基金（授予KJL）的资助。Affiliated Laboratories和Affiliated Dermatology提供了额外支持。我们感谢Sarah Potekhen、Jamie Barto、Stefani Fawks、Cody Jording、Stacie Schimke、Heather Kissel和Ali Zaidi在技术方面提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Vacutainer 含 K3EDTA 塑料采血管ThermoFisher Scientific02-685-2B
Electron Microscopy Sciences 双刃刀片ThermoFisher Scientific50-949-411
弯曲中头通用镊子ThermoFisher Scientific16-100-110
优质微量离心管ThermoFisher Scientific05-408-138
Lonza Walkersville KGM 角质形成细胞培养基ThermoFisher ScientificNC9791321
Electron Microscopy Sciences 组织包埋剂 TEK OCTThermoFisher Scientific50-363-579
Leica CM1950 冷冻切片机Leica Biosystems14047743909
磨砂载玻片ThermoFisher Scientific12-550-343
Shandon 快速铬苏木精-伊红（H&E）冷冻切片染色试剂盒ThermoFisher Scientific99-900-01
Nalgene 长期储存冻存管ThermoFisher Scientific03-337-7X
Falcon 15 mL 圆锥形离心管ThermoFisher Scientific14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab ThermoFisher ScientificNC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA 裂解缓冲液ThermoFisher Scientific50-195-822
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液ThermoFisher ScientificPI78443
Eppendorf 5424R 微型离心机ThermoFisher Scientific05-401-203
Pellet Morter 无线匀浆器ThermoFisher Scientific12-141-3
无 RNA 酶 Pellet PestleThermoFisher Scientific121-141-364
Forma SteriCycle CO2 培养箱ThermoFisher Scientific13-998-089
HyClone 胎牛血清ThermoFisher ScientificSH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12 培养基ThermoFisher Scientific12-634-028
Gibco 青霉素-链霉素溶液ThermoFisher Scientific15140148
Gibco 1 M Hepes 缓冲液ThermoFisher Scientific15-630-130
Nunc 细胞培养皿（35 mm，带透气盖）ThermoFisher Scientific1256591
抗 CFH 单克隆抗体，克隆 OX-24AbnovaMAB12583
抗 p40（p63 delta）抗体AbnovaABX-144A
抗 MUC-1 抗体Santa Cruz Biotechsc-7313
抗 Snail + Slug（磷酸化 S246）抗体AbcamAb63568
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488 标记InvitrogenA-11034
Alexa Fluor 568 鬼笔环肽Molecular Probes A12380
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Molecular Probes P36941
配备 Axiocam 相机的 Zeiss Axio Imager Z1 显微镜Zeiss4300009901
配备 DP72 相机的 Olympus IX51 相差显微镜OlympusIX511F3

参考文献

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