使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

摘要

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。

摘要

可编程基因组编辑工具的发展促进了反向遗传学的应用，有助于理解特定基因组序列在细胞及完整生物体功能中所起的作用。近年来CRISPR/Cas9系统的引入极大地推动了这一研究进程——该系统是一种多功能工具，使研究人员能够以靶向方式操控基因组和转录组，实现基因的敲除、敲低或敲入等操作。在基因敲除方面，CRISPR/Cas9介导的双链断裂会招募非同源末端连接DNA修复通路，从而在断裂位点插入或缺失核苷酸，导致移码突变。然而，单个向导RNA可能引发非预期的脱靶效应，为排除此类效应，必须使用多个向导RNA。这种多靶点策略也意味着需要对大量克隆进行高通量筛选，因此迫切需要一种高效的高通量技术对敲除克隆进行基因分型。现有的基因分型技术要么存在固有局限性，要么成本较高，因而难以适用于高通量需求。本文详细描述了一种荧光PCR方法，该方法以粗提细胞裂解液中的基因组DNA为模板，通过毛细管凝胶电泳分离PCR扩增片段。该技术的分辨率足以区分片段间单个碱基对的差异，因此能够准确判断目标基因编码序列中是否存在移码突变。这种精确的检测结果有效避免了后续验证性测序步骤的必要性，帮助用户节省时间和成本。此外，如本文及其他研究所示，该方法在对多种组织来源的哺乳动物细胞进行基因分型方面表现出良好的通用性，适用于针对多个基因设计的向导RNA所介导的基因编辑分析。

引言

反向遗传学方法使科学家能够阐明基因组中特定改变对细胞或完整生物体的影响。例如，可以通过基因敲低^1,2（部分减少）或基因敲除^3,4（完全消除）某一特定基因的表达，以确定这种改变对细胞功能或生物体发育所产生的影响。

自从序列特异性的可编程核酸酶（如锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs））问世以来，基因敲除实验已变得更加简便。然而，近年来对成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统的深入表征，使得全球任何实验室都能极为便捷地开展基因敲除实验。本质上，CRISPR/Cas9系统包含两个关键组分：一种单链向导RNA（sgRNA），可通过碱基互补配对识别并结合基因组中的特定序列；以及一种名为Cas9的内切核酸酶。sgRNA-Cas9复合物在基因组DNA上特异性结合并发挥作用后，会导致DNA发生双链断裂。这继而会激活细胞内的DNA损伤应答机制，并通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）途径进行修复。由于NHEJ修复机制（而非HR机制）常在修复位点随机插入或删除核苷酸，从而产生插入/缺失（indel）突变，可能导致外显子的阅读框发生移位。这可能进一步导致翻译提前终止以及无义介导的mRNA降解

方案

1. 获得CRISPR/Cas9靶向的单细胞克隆

1. 在6孔板中接种HEPG2细胞，每孔500,000个细胞，加入2 mL不含抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），并添加10%胎牛血清（FBS）。于37 °C、5% CO₂条件下培养24小时。₂.
2. 使用适当的转染试剂，按照制造商说明书将共表达Cas9和针对目的基因的特异性sgRNA的质粒转染至细胞中。
   注意：例如，sgRNA 可按照先前所述方法克隆至 pSpCas9(BB)-2A-GFP 载体中⁴.
3. 转染后4至16小时，用2 mL新鲜的无抗生素培养基更换培养液。
4. 转染约48小时后，用胰蛋白酶消化细胞，收集单细胞悬液。
   1. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液0.2 mL消化细胞，37 °C孵育5 min。加入1 mL培养基，充分重悬。
5. 根据之前所述方法对细胞进行分选，以获得GFP阳性克隆¹²，收集约 3,500 个细胞。
6. 将GFP阳性分选细胞以每皿500、1,000和2,000个细胞的密度接种于10 cm培养皿中，每皿加入8 mL含青霉素/链霉素的培养基。于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂.
7. 将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养....

结果

本文所述的荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术预计可适用于几乎所有可通过外源DNA递送进行基因操作的细胞系中基因组的任何可靶向区域。我们此前已通过靶向结直肠癌细胞系中的三个基因验证了该技术的应用¹²。本文中，我们展示了该技术在对肝细胞癌细胞系HEPG2进行基因分型中的有效性，该细胞系经CRISPR/Cas9载体靶向Nucleosome Assembly Protein 1 Like 1（NAP1L1）基因。事实上，我们已成功将荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术应用于多种其他细胞的基因分型，包括非人哺乳动物细胞系，并靶向多个其他基因^12,13。

从实验角度来看，荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术操作简便且快速。在将Cas9和sgRNA表达载体导入细胞并筛选出阳性克隆后，可直接使用我们自制的裂解缓冲液（Di.......

讨论

在特定的模式细胞系中敲除某个特定基因，已成为阐明该基因在特定细胞环境中所起作用的常规手段。事实上，目前已有多种全基因组范围的筛选方法，利用CRISPR/Cas9系统靶向基因组中几乎所有已知的人类基因^14,15,16。在进行这些大规模筛选（或甚至针对个别感兴趣基因的小规模靶向实验）时，设计并使用靶向同一基因不同位点的单导向RNA（sgRNA）至关重要。若不同sgRNA所获得的结果一致，则可明确揭示该基因缺失的真实效应。因此，针对单个基因的靶向研究需要进行高通量的基因分型步骤，以准确鉴定每种sgRNA所获得的大量克隆。本文所述的荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术可精确完成此项任务。

尽管现有的大多数基因分型方法适用于高通量应用，但每种方法都存在某些固有的局限性，使其难以达到理想效果。SURVEYOR 或 T7E1 检测法通过识别 DNA 双链中的错配位点¹⁰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPG2 细胞	ATCC	HB-8065
HyClone 改良杜尔贝科必需培养基（DMEM）	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone 胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP 质粒	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Thermo Fisher Scientific	25200056
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红	Thermo Fisher Scientific	15400054
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone 分子生物学级水	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA 插入寡核苷酸（正义链）	AITbiotech	None	序列：5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA 插入寡核苷酸（反义链）	AITbiotech	None	序列：5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
未标记的 PCR 扩增正向引物	AITbiotech	None	序列：5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'；该引物也用于测序 PCR 扩增的等位基因
6-FAM 标记的荧光 PCR 正向引物	AITbiotech	None	序列：5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX 标记的荧光 PCR 正向引物	AITbiotech	None	序列：5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
未标记的 PCR 反向引物	AITbiotech	None	序列：5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR 核心试剂盒	QIAGEN	201223
Hi-Di 甲酰胺	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ 染料大小标准品	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp 光学 96 孔反应板	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL 遗传分析仪	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 系列 2 程序	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 程序	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene 细胞试剂盒	QIAGEN	1045696
Wizard SV 凝胶和 PCR 纯化系统	Promega	A9282
NAP1L1 抗体（N 端）	Abgent	AP1920b
核基质蛋白 p84 抗体 [5E10]	GeneTex	GTX70220
辣根过氧化物酶标记的 AffiniPure 山羊抗兔 IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
辣根过氧化物酶标记的 AffiniPure 羊抗小鼠 IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003