评估在小鼠模型中进行清醒状态下膀胱测压的操作流程

摘要

本研究描述了在自由活动的小鼠中进行清醒状态下膀胱测压的手术操作及实验技术，并提供了支持其优化与标准化的实验依据。

摘要

清醒状态下充盈性膀胱测压长期以来被用于评估自由活动小鼠的膀胱功能，然而不同实验室所采用的具体方法存在差异。本研究旨在描述用于植入膀胱内导管的显微外科手术操作步骤，以及在清醒、自由活动小鼠中记录膀胱压力的实验技术。此外，本文还提供了实验数据，以展示手术操作以及导管类型和尺寸对下尿路功能和记录灵敏度的影响。通过不同内径的聚乙烯和聚氨酯导管，评估了导管直径对压力记录的影响。随后，从两种材料中选择性能最佳的导管，外科植入雄性C57BL/6小鼠膀胱顶部。在健康完整动物以及术后第2、3、5和7天的动物中，记录了12小时夜间排尿频率。处死动物后，通过肉眼观察评估膀胱是否存在肿胀，并进一步进行病理学分析。膀胱肿胀最明显的时期为术后第2天和第3天，这与行为学排尿数据一致，显示膀胱功能显著受损。至术后第5天，膀胱组织学表现和排尿频率均已恢复正常。结合文献资料及本研究提供的证据，我们提出在清醒小鼠中进行膀胱内压和排尿量体内记录的以下建议步骤：1）使用手术显微镜和显微外科器械进行手术；2）采用聚乙烯-10导管以最小化运动伪影；3）在术后第5天进行膀胱测压，此时膀胱肿胀已消退。

引言

充盈性膀胱测压（FC）是一种诊断方法，通过将导管置入膀胱，在缓慢充盈膀胱的过程中记录压力变化。该方法最早于1927年作为临床诊断手段被提出，用于评估下尿路功能，至今仍被广泛应用。¹ 在科研领域，FC可用于检测健康和疾病动物模型的膀胱功能，并研究药理学制剂的作用效果。啮齿类动物模型常被用于探究下尿路功能。² 在这类哺乳动物中，FC技术最初在大鼠中建立。³ 目前，向膀胱植入导管并进行FC的操作方法已有详尽描述，并被众多研究者采用，具有可接受的可重复性。⁴ 由于转基因和基因敲除小鼠品系的可获得性，小鼠已成为包括下尿路功能障碍在内的多个研究领域的重要物种。然而，不同实验室在小鼠膀胱测压操作方法上存在显著差异，导致实验结果难以比较。⁵

与离体（ex vivo）模型相比，清醒自由活动状态下的膀胱功能检测（FC）可保留下尿路的解剖结构，从而能够评估储尿和排尿阶段膀胱与其出口之间的协调功能。既往研究表明，多种常用麻醉剂会抑制排尿收缩。尽管某些药物（如乌拉坦、α-氯醛糖、氯胺酮和赛拉嗪）可在一定程度上保留膀胱平滑肌的收缩功能，使动物能够排尿，但仍会显著降低膀胱的功能容量并抑制神经传递。⁶

方案

动物饲养于佛蒙特大学动物护理设施，遵循机构制定的指导原则。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。

1. 膀胱内导管植入

1. 手术器械和导管管路的准备
   1. 截取一段7厘米长的PE10管，用于制作植入用导管。
   2. 将PE10管的一端缓慢靠近明火，形成喇叭口。
      注意：一旦喇叭口形成，应立即撤回导管。
   3. 使用低温设置的热熔胶枪，在PE10管外侧距离喇叭口端4.5、5和5.5 cm处各施加一滴通用热熔胶。这些胶点有助于将导管固定在动物背部。（图1）
   4. 通过将导管浸泡于70%乙醇中进行灭菌，使用前再用无菌0.9% NaCl冲洗。保持导管内充满液体，以避免系统中引入气泡。
   5. 通过手动左右摆动30号针头的近端，将其从针座上分离，制成一个30号塞子，用于密封PE10导管的末端。在末端滴加一滴热熔胶，确保密封完全防水。（图2）
   6. 使用以下显微外科器械：两对Dumont #7弯显微镊、两对Dumont #5弯显微镊、一支21 G针头、超细直止血钳、显微剪刀、小型解剖剪刀和显微持针器。
   7. 在开始手术前对所有器械进行灭菌处理。
2. 动物准备<....

结果

在导管阻塞期间，系统内压力升降的稳定性方面，不同导管材料和直径之间无显著差异。膀胱内导管植入术后，聚乙烯（PE）和聚氨酯（PU）材料均引起明显的膀胱壁肿胀。术后第2天，出现严重的黏膜下层肿胀，占据膀胱横截面的一半，导致管腔阻塞。术后第5天，水肿完全消退，黏膜下层区域可见炎性细胞浸润，并部分侵入肌层。术后第7天，炎性浸润显著减轻，膀胱壁组织学恢复至正常状态（图8）。组织肿胀最显著的时期为术后第2天和第3天，这与行为排尿数据中观察到的膀胱功能显著受损相一致（图9）。术后第5天，排尿频率恢复正常。

清醒、自由活动的小鼠（运动伪影极小）的膀胱内压表现为10–15 cm H₂O的基线压力，在充盈周期中该压力可能保持不变或逐渐升高不超过10 cm H₂O，随后在排尿时出现突然的脉冲式压力上升，紧接着压力下降（图10和

讨论

膀胱内导管的最佳材料与尺寸

为了确定导管直径对压力记录的影响，我们测试了不同的微流控导管：PE50（内径0.58 mm）、聚氨酯PU027（内径0.4 mm）、PE25（内径0.46 mm）和PE10（内径0.28 mm）。对于每种导管，在输液泵以1 mL/h运行的同时，将导管在垂直方向上从0快速移动至30 cm，并记录压力变化。最初的在体实验尝试使用PE50导管，但由于导管尺寸相对于小鼠膀胱过大而未成功（图4A）。这一结果支持Smith和Kuchel的研究发现，即在清醒小鼠膀胱测压中使用PE50导管会产生伪影，从而难以解读数据¹²；但需要注意的是，其他研究者已在清醒无束缚、清醒束缚以及麻醉状态下的小鼠膀胱测压中成功使用PE50导管^9,13,14。与PE50相比，PE10更具柔韧性，当小鼠活动时可减少导管对膀胱施加的张力，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯（PE）10 管	Instech	BTPE-10	适用于 30G 连接器/堵头
聚乙烯（PE）50 管	Instech	BTPE-50	适用于 22G 连接器/堵头
22 G 单通道不锈钢旋转接头	Instech	375/22
高碳钢通用延伸弹簧（9/64" 外径）	Grainger	1NAH1	用于保护 PE50 管——按需剪裁长度
22 G 连接器	Instech	SP22/12
Yutaoz 专业热熔胶枪	Yutaoz		使用低温设置（100 °C）——任何具有可调温度范围的热熔胶枪均可使用
Surebonder DT-2010 通用胶棒	Surebonder		任何通用热熔胶均可使用
Dumont #5 弯头显微镊	World Precision Instruments	500232
Dumont #7 弯头显微镊	World Precision Instruments	14188
微型解剖剪刀——直头	World Precision Instruments	503240
微型蚊式钳（12.5 cm）	World Precision Instruments	500451
解剖剪刀——直头	World Precision Instruments	14393
Castroviejo 持针器	World Precision Instruments	503258
异氟烷，USP	Phoenix		2%，1 L/min 流速
丁丙诺啡			0.05 mg/kg
0.9% 氯化钠冲洗液，USP	Baxter
6-0 Ethilon 黑色单丝不可吸收缝线	Ethicon		膀胱结扎
6-0 Vicryl 紫色编织可吸收缝线	Ethicon		肌肉缝合，连续缝合
6-0 Prolene 蓝色单丝不可吸收缝线	Ethicon		皮肤缝合，垂直褥式，埋藏间断缝合
KD Legato 210 注射/抽取泵	KD Scientific		1.5 mL/hr
一次性压力传感器	Digitimer	NL108T2
压力放大器	Digitimer	NL108A
Power1401-3 数据采集接口	Digitimer
Spike2	Cambridge Electronic Design Limited		PC 压力记录软件
Leica MZ6 外科手术显微镜（3.2 - 20X）	Leica Microsystems		放大倍数