石蜡包埋福尔马林固定人咽部鳞状细胞癌样本中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学检测

摘要

多参数荧光免疫组织化学可用于评估肿瘤微环境中免疫细胞群体的数量、相对分布及定位情况。本文描述了利用该技术分析口咽癌中T细胞亚群的方法。

摘要

四色荧光免疫组织化学（IHC）技术是一种在考虑目标细胞群相对分布及其在组织中定位的前提下，对其进行定量分析的方法。该技术已被广泛应用于研究多种肿瘤类型中的免疫浸润情况。肿瘤微环境会受到被吸引至肿瘤部位的免疫细胞的浸润。不同的免疫细胞亚群在肿瘤微环境中发挥着不同的作用，并对疾病的预后产生不同的影响。本文以口咽鳞状细胞癌（OPSCC）为例，描述了多参数荧光IHC技术的应用。该技术也可推广至其他组织样本及感兴趣的细胞类型。在本研究中，我们分析了一个较大的OPSCC队列（n = 162）的上皮内和间质区室。我们重点关注了总T淋巴细胞（CD3⁺）、具有免疫抑制功能的调节性T细胞（Tregs；即 FoxP3⁺）以及T辅助17（Th17）细胞（即 IL-17⁺CD3⁺），并使用核复染标记以区分肿瘤上皮与间质。研究发现，当肿瘤内IL-17⁺非T细胞数量较少时，T细胞数量较多与患者无病生存期的延长显著相关。这提示IL-17⁺非T细胞可能与OPSCC中较差的免疫应答相关，这一结果与既往报道的IL-17与癌症患者不良预后之间的关联一致。目前，新型多参数荧光IHC技术正在发展之中，可同时使用多达7种不同的荧光染料，从而实现对肿瘤微环境中免疫细胞更精确的表征与定位。

引言

口咽部鳞状细胞癌（OPSCC）是一组起源于口咽部的异质性鳞状细胞癌。OPSCC 的危险因素包括人乳头瘤病毒（HPV）感染以及酒精和烟草的使用^1,2。免疫反应的作用及其在临床环境中的应用目前尚处于初步探索阶段。肿瘤微环境会浸润大量被吸引至肿瘤部位的免疫细胞。尽管高频率的 CD8⁺ 细胞毒性 T 细胞已被证实与 OPSCC 患者生存率的提高相关³，但其他 T 细胞亚群（如 Treg 细胞和 Th17 细胞）的作用仍不明确⁴。Th1 和 Th17 细胞被认为有助于针对肿瘤细胞的免疫应答，而 Treg 细胞则以其抑制其他 T 细胞活性的能力而著称⁵。然而，在不同类型的肿瘤中，Treg 细胞的存在已被发现既与有利的预后相关，也与不良预后相关⁶。由于并非所有存在于血液中的免疫细胞都能以相同程度浸润肿瘤，因此对局部肿瘤微环境的研究能够提供针对肿瘤免疫应答最可靠的评估指标。本研究旨在确定免疫细胞的数量和类型与临床结局之间的相关性。我们采用四色荧光免疫组化成像技术，分析人类 OPSCC 中多种 T 细胞亚群的数量及其定位情况。

我们重点关注了总T淋巴细胞（CD3

方案

患者样本的处理遵循荷兰生物医学科学学会联合会（www.federa.org）发布的《人体组织适当二次使用行为准则》中所述的医学伦理指南。

1. 准备载玻片

1. 在获得医学伦理委员会批准使用切除组织的许可后，从病理科获取切除的组织材料（任何类型的组织）。
   注：本实验所用的治疗前肿瘤样本来自荷兰莱顿大学医学中心（Leiden University Medical Center, Leiden）于1970年至2011年间诊断的原发性口咽部肿瘤，样本选择方法如前所述（n = 162）¹³。组织大小仅需满足能在肿瘤内部可靠地获取4个显微图像所需的足够肿瘤组织量即可。
2. 将组织在4%中性缓冲福尔马林中固定至少12小时。使用梯度乙醇进行脱水处理。在二甲苯中清洗，然后使用自动组织处理机将组织包埋于石蜡中。
3. 使用切片机在载玻片上切取4 µm厚的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片。按照标准操作程序将组织包埋块放入切片机的组织夹持器中。
   1. 切取组织带，并将其置于盛有去离子水、温度为45 ºC的水浴表面。使用适用于免疫组织化学染色的载玻片，将玻片置于组织切片正下方的水中，轻轻以倾斜角度提起玻片，使切片脱离水面并牢固贴附于玻片上。
4. 将载玻片在37 °C下干燥过夜。
....

结果

1970年至2011年间，从荷兰莱顿大学医学中心诊断的原发性口咽肿瘤中获取的一系列FFPE预处理肿瘤样本（按先前描述的方法选取，n = 162），采用所述方案进行了染色。¹³每张切片随机选取1至4个图像进行分析（图1）。图中指示了一些自发荧光细胞，其完全呈黄色，可被清晰区分。真正双阳性和三阳性细胞仅在预期位置（此例中为细胞膜或细胞核）对特定抗体呈现阳性染色。阴性对照切片未显示任何超出背景组织自发荧光的特异性染色图2 和 图4)，证实所有信号均特异性地来自初级抗体所识别的目标。所有肿瘤样本均发现有CD3浸润⁺ T细胞在不同程度上。FoxP3⁺ Tregs 始终表达 CD3，是浸润性 T 细胞群中的主要亚群之一。表达 IL-17 的 CD3 细胞（Th17 细胞）为浸润性 T 细胞中的少数群体。CD3 细胞表.......

讨论

对于所述实验方案，最关键的步骤之一是确定所用一抗的合适稀释比例。标记二抗的稀释比例为1:200，这是由该特定Alexa标记抗体的制造商推荐的。一抗的稀释比例应通过系列稀释法确定，最好使用两种不同的目标组织样本（本例中为口咽鳞状细胞癌，OPSCC）。最佳工作稀释度是指在该稀释度下可获得清晰信号，无背景干扰，且在相同浓度下阴性对照无信号出现。根据可用显微镜类型及研究者的偏好，可对所用二抗类型和封片介质进行调整。如果未达到预期结果，我们建议检查所用载玻片的类型，因为某些载玻片已知会对特定染色液产生背景信号问题。例如， Perma Blue）。其次，某些抗原可能会因热诱导表位修复而遭到破坏，此时研究人员可采用其他技术替代缓冲液加热步骤，例如酶诱导表位修复。第三，若使用疏水笔标记，划线位置不应过于靠近组织，以免影响染色液的正常作用。关于每个样本所需的切片数量以及每张切片需采集的图像数量，应由研究人员根据具体研究问题决定，以确保具有足够的统计学效力。在本研究中，我们每个样本使用一张切片，每张切片采集四幅图像。最后，进行免疫荧光染色时，使用指甲油封固盖玻片需格外小心，因为指甲油溶液中的酒精可能影响荧光信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Pathos Delta 超快速组织处理仪	Milestone 和 Histostar		全自动组织处理仪
Histostar	Thermo Scientific		组织包埋机
甲醛	Baker
二甲苯	Merck
乙醇	Merck
超纯水（milliQ 水）	Elaga Purelab Chorus
石蜡/Paraclean	Klinipath	5079A
切片机组织夹持器	Leica	RM225
Flex IHC 侧向切片仪	Dako		组织切片
Tris	Merk-Milipore	1,083,821,000
EDTA	Baker	1073
PBS	Bio-Rad	BUF036A
BSA	Sigma	A9647
兔抗 CD3 抗体	Abcam	ab828	需滴定确定最佳抗体稀释度
小鼠 IgG1 抗 FoxP3 抗体	Abcam	ab20034	需滴定确定最佳抗体稀释度
山羊 IgG 抗 IL-17 抗体	R&D Systems	AF-317-NA	需滴定确定最佳抗体稀释度
兔 Ig 同型对照抗体	Abcam	ab27472	使用浓度应与抗 CD3 抗体终浓度相同
小鼠 IgG1 同型对照抗体	Abcam	ab91353	使用浓度应与抗 FoxP3 抗体终浓度相同
山羊 IgG 同型对照抗体	ThermoFisher Scientific	02-6202	使用浓度应与抗 IL-17 抗体终浓度相同
驴抗兔 IgG A546	ThermoFisher Scientific	A10040	用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200
驴抗小鼠 A647	ThermoFisher Scientific	A31571	用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200
驴抗山羊 IgG A488	ThermoFisher Scientific	A11055	用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200
含 DAPI 的 VectaShield 封片剂	Vector Laboratories	H-1200
LSM700 共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss
LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 物镜	Zeiss	420852-9972-720
LSM Zen 软件	Zeiss	版本 2009
LSM 图像浏览器	Zeiss	版本 4.2.0.121	可从 www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html 下载。
SPSS	IBM Corp.	版本 20.0
ImageJ		版本 1.50i	可从 http://rsb.info.nih.gov/ij 下载。