石蜡包埋福尔马林固定人咽部鳞状细胞癌样本中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学检测

摘要

多参数荧光免疫组织化学可用于评估肿瘤微环境中免疫细胞群体的数量、相对分布及定位情况。本文描述了利用该技术分析口咽癌中T细胞亚群的方法。

摘要

四色荧光免疫组织化学（IHC）技术是一种在考虑目标细胞群相对分布及其在组织中定位的前提下，对其进行定量分析的方法。该技术已被广泛应用于研究多种肿瘤类型中的免疫浸润情况。肿瘤微环境会受到被吸引至肿瘤部位的免疫细胞的浸润。不同的免疫细胞亚群在肿瘤微环境中发挥着不同的作用，并对疾病的预后产生不同的影响。本文以口咽鳞状细胞癌（OPSCC）为例，描述了多参数荧光IHC技术的应用。该技术也可推广至其他组织样本及感兴趣的细胞类型。在本研究中，我们分析了一个较大的OPSCC队列（n = 162）的上皮内和间质区室。我们重点关注了总T淋巴细胞（CD3⁺）、具有免疫抑制功能的调节性T细胞（Tregs；即 FoxP3⁺）以及T辅助17（Th17）细胞（即 IL-17⁺CD3⁺），并使用核复染标记以区分肿瘤上皮与间质。研究发现，当肿瘤内IL-17⁺非T细胞数量较少时，T细胞数量较多与患者无病生存期的延长显著相关。这提示IL-17⁺非T细胞可能与OPSCC中较差的免疫应答相关，这一结果与既往报道的IL-17与癌症患者不良预后之间的关联一致。目前，新型多参数荧光IHC技术正在发展之中，可同时使用多达7种不同的荧光染料，从而实现对肿瘤微环境中免疫细胞更精确的表征与定位。

引言

口咽部鳞状细胞癌（OPSCC）是一组起源于口咽部的异质性鳞状细胞癌。OPSCC 的危险因素包括人乳头瘤病毒（HPV）感染以及酒精和烟草的使用^1,2。免疫反应的作用及其在临床环境中的应用目前尚处于初步探索阶段。肿瘤微环境会浸润大量被吸引至肿瘤部位的免疫细胞。尽管高频率的 CD8⁺ 细胞毒性 T 细胞已被证实与 OPSCC 患者生存率的提高相关³，但其他 T 细胞亚群（如 Treg 细胞和 Th17 细胞）的作用仍不明确⁴。Th1 和 Th17 细胞被认为有助于针对肿瘤细胞的免疫应答，而 Treg 细胞则以其抑制其他 T 细胞活性的能力而著称⁵。然而，在不同类型的肿瘤中，Treg 细胞的存在已被发现既与有利的预后相关，也与不良预后相关⁶。由于并非所有存在于血液中的免疫细胞都能以相同程度浸润肿瘤，因此对局部肿瘤微环境的研究能够提供针对肿瘤免疫应答最可靠的评估指标。本研究旨在确定免疫细胞的数量和类型与临床结局之间的相关性。我们采用四色荧光免疫组化成像技术，分析人类 OPSCC 中多种 T 细胞亚群的数量及其定位情况。

我们重点关注了总T淋巴细胞（CD3⁺）、Th17细胞以及具有免疫抑制功能的FoxP3⁺调节性T细胞（Tregs），后者的分化途径与Th17细胞密切相关。Th17细胞的特征是同时表达CD3和IL-17。细胞因子IL-17也可由非T细胞产生⁷。我们分析了大量口咽鳞状细胞癌（OPSCC）病例中上皮内和间质中T细胞、Tregs、Th17细胞以及IL-17⁺非T细胞的分布情况，并探讨了这些细胞分布与患者生存之间的相关性。采用多色荧光免疫组化（IHC）技术，联合DAPI复染，检测CD3、Foxp3和IL-17的表达。该检测方法可清晰、简便地区分肿瘤细胞（通过DAPI核染色）和浸润的T细胞亚群（通过多种标记物组合）。在完成样本制备和染色后，使用荧光显微镜及成像软件分离不同的荧光信号，进而确定肿瘤上皮区和肿瘤相关间质区中各类细胞的数量和类型。

另一种用于定量和表型分析免疫细胞群体的方法是对肿瘤或外周样本（例如，血液或腹水）进行流式细胞术分析，或飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）分析。使用该技术时，有关不同类型细胞的空间定位及其相对分布的所有信息均会丢失。此外，对外周样本的使用和分析也无法提供关于哪些细胞能够浸润肿瘤微环境的信息。已有研究表明，血液和腹水中的免疫细胞分析结果并不能反映肿瘤组织中免疫细胞浸润的表型特征和频率^8,9。

另一种选择是使用明场显微镜。与荧光成像相比，该技术的优势在于不存在组织自发荧光。尽管某些样本含有较强的自发荧光——尤其是红细胞，也包括中性粒细胞等其他细胞类型——但在几乎所有样本的分析过程中，这些区域均可被轻松去除。免疫荧光技术的优势在于可通过一组特异性荧光波长，在同一样本中同时分析多个标记物。由于针对特定抗原的标签种类不足，以及 commercially available 抗体同种型有限，目前明场显微镜尚无法在同等程度上实现多标记分析。

本文所述的多色荧光免疫组化技术已用于多种不同癌症类型和抗体组合，以研究不同的免疫细胞群体以及肿瘤细胞表达的分子，例如人类白细胞抗原（HLA）和PD-L1^10,11,12。该方案已采用多种不同类型的样本和抗体进行建立和验证。

方案

患者样本的处理遵循荷兰生物医学科学学会联合会（www.federa.org）发布的《人体组织适当二次使用行为准则》中所述的医学伦理指南。

1. 准备载玻片

1. 在获得医学伦理委员会批准使用切除组织的许可后，从病理科获取切除的组织材料（任何类型的组织）。
   注：本实验所用的治疗前肿瘤样本来自荷兰莱顿大学医学中心（Leiden University Medical Center, Leiden）于1970年至2011年间诊断的原发性口咽部肿瘤，样本选择方法如前所述（n = 162）¹³。组织大小仅需满足能在肿瘤内部可靠地获取4个显微图像所需的足够肿瘤组织量即可。
2. 将组织在4%中性缓冲福尔马林中固定至少12小时。使用梯度乙醇进行脱水处理。在二甲苯中清洗，然后使用自动组织处理机将组织包埋于石蜡中。
3. 使用切片机在载玻片上切取4 µm厚的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片。按照标准操作程序将组织包埋块放入切片机的组织夹持器中。
   1. 切取组织带，并将其置于盛有去离子水、温度为45 ºC的水浴表面。使用适用于免疫组织化学染色的载玻片，将玻片置于组织切片正下方的水中，轻轻以倾斜角度提起玻片，使切片脱离水面并牢固贴附于玻片上。
4. 将载玻片在37 °C下干燥过夜。
5. 通过将FFPE切片完全浸入新鲜的100%二甲苯中三次，每次5分钟，进行脱蜡处理。随后将切片依次浸入新鲜的100%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中，每种浓度各两次，每次5分钟，以完成再水化处理。

2. 进行抗原修复

1. 将载玻片在去离子水中清洗 5 分钟。
2. 使用微波炉将三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（10 mM Tris 加 1 mM EDTA，pH 9.0）加热至沸腾。将载玻片浸入预热的 EDTA 缓冲液中，并在微波炉中保持该温度 10 分钟，以进行抗原修复。
   注意：可使用任何功率为 900 W 的微波炉。
3. 让载玻片在缓冲液中冷却 2 小时。

3. 染色组织切片

1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
2. 用疏水性笔在组织周围画一个圈，以防止稀释的抗体从载玻片上溢出。再用 PBS 洗涤一次；此步骤可选。
3. 将组织与一抗（抗-CD3 1:50、抗-FoxP3 1:200 和抗-IL-17 1:50）在含1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的PBS中稀释，室温孵育过夜。
   注意：每张切片的液体体积取决于组织大小，通常为 50 - 150 µL。对于阴性对照切片，使用与 CD3、CD8 和 FoxP3 抗体相同稀释度、同一种属同型类别的特异性未知的抗体替代一抗。即， 兔Ig同型对照抗体、小鼠IgG1同型对照抗体和山羊IgG同型对照抗体
4. 用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
5. 将组织与针对一抗物种和/或亚型的荧光标记二抗混合物共同孵育（即， 1:200 的驴抗山羊IgG Alexa 488、驴抗兔IgG A546 和驴抗小鼠A647，用含1% BSA的PBS稀释，在室温下孵育1小时。
   注意：每张载玻片的液体体积取决于组织大小，通常为 50 - 150 µL。
   1. 加入二抗后，应将切片尽可能避光保存，可置于暗盒中或用铝箔包裹容器。

4. 组织切片的封片与复染

1. 将载玻片在PBS中清洗三次，每次5分钟。
2. 使用含核复染剂的水溶性抗荧光淬灭封片剂封片例如， DAPI）。尽快使用荧光显微镜分析载玻片（两周内）。分析前将载玻片置于4 °C避光保存。

5. 分析染色组织切片

1. 使用配备20-25倍物镜的荧光显微镜，对每张切片采集四幅图像。在切片所包含的整个肿瘤区域内随机选取位置拍摄图像，以获取具有代表性的肿瘤区域比例。
   注意：应使用250倍的标准放大倍数。任何荧光或激光扫描显微镜均可使用，前提是其配备有用于观察所用荧光染料所需的滤光片和激光器。
   1. 为观察Alexa 488，使用490的激发最大值和525的发射最大值；为观察Alexa 546，使用556的激发最大值和573的发射最大值；为观察Alexa 647，使用650的激发最大值和665的发射最大值；为观察DAPI，使用358的激发最大值和461的发射最大值。
   2. 将图像保存为图像文件（即， jpeg 和 tiff）格式，具体取决于用户所使用的软件。
2. 在咨询病理学家后，根据肿瘤上皮细胞与间质细胞的核形态和细胞形态，区分肿瘤上皮区域与肿瘤间质区域。
   1. 为确定间质的总面积，使用显微镜制造商提供的图像分析软件，在间质细胞（而非肿瘤细胞）所占据的所有区域周围绘制轮廓线，并记录其表面积。
      1. 点击 "覆盖" 图像下方的标签；选择 "闭合多段线" 形状并点击。通过在区域周围点击，直至回到起始点，来划定肿瘤上皮与间质区域之间的边界；此操作可获得该区域的测量值。
         注意：一旦闭合图形，图形旁边将显示一个数字，表示所选图像的表面积（A = x µm²).
   2. 从总图像表面积（在图像属性中提供）中减去该表面积，以计算上皮表面积。通过在血管、坏死和自发荧光区域周围画线，记录所选区域的大小，并从上皮表面积中减去该值，以排除这些区域。
   3. 将所有表面积数值保存在电子表格文件中，以计算每张载玻片的平均表面积和细胞数量。
   4. 使用图像分析软件，通过检测四个通道的荧光信号，判断细胞为单阳性、双阳性或三阳性。
      1. 使用 ImageJ 对每张图像中的单阳性、双阳性和三阳性细胞进行计数。
         1. 下载 ImageJ。通过点击打开图像 "文件" 和 "打开" 并选择要分析的图像。右键点击 "点工具" （四个线条中间的一个红色方块），然后选择 "多点工具" 双击 "多点工具" 通过为每种细胞类型选择不同的计数编号，在图像中统计不同细胞类型的数量。
            注意：根据每种细胞是否呈现一种、两种或三种荧光颜色来识别并计数所有不同类型的细胞。排除DAPI，因为这种细胞核复染剂存在于所有细胞中，仅用于区分肿瘤细胞与免疫细胞。每种细胞类型使用不同的计数器编号进行计数。在肿瘤上皮区和间质区中，每次选择不同的计数器编号，分别对各细胞类型的细胞数量进行单独计数。不要计数血管内或具有强烈自发荧光区域中的细胞。
         2. 在电子表格文件中记录每张图像中每个计数区域所分析的细胞数量。
         3. 将每种细胞类型的细胞总数除以所分析的肿瘤上皮和肿瘤间质的总面积。

6. 统计学分析

注意：所有统计分析均应与统计学家讨论，以确保数据质量。对于一般性统计分析，请参考任何一本医学统计学指南¹⁴。

1. 使用斯皮尔曼等级相关性 rho 检验分析细胞频率之间的相关性。
2. 使用Wilcoxon Mann-Whitney检验分析患者组间阳性细胞数量的统计学差异。
3. 检验细胞数量与无病生存期之间的相关性（即， 根据细胞数量的截断值将患者分组，采用Kaplan-Meier曲线法和对数秩检验分析从诊断至局部或远处复发、死亡或疾病进展的时间¹⁵.
4. 使用Cox比例风险回归分析进行多变量分析。

结果

1970年至2011年间，从荷兰莱顿大学医学中心诊断的原发性口咽肿瘤中获取的一系列福尔马林固定石蜡包埋预处理肿瘤样本（n = 162），按照先前描述的方法进行选择，并采用所述方案进行染色。¹³每张切片随机选取1至4个图像进行分析（图1）。图中指示了一些自发荧光细胞，其完全呈黄色，可被清晰区分。真正双阳性或三阳性的细胞仅在预期位置（此例中为细胞膜或细胞核）对特定抗体呈现阳性染色。阴性对照切片未显示任何超出背景组织自发荧光的特异性染色图2 和 图 4)，证实所有信号均特异性地来自初级抗体所识别的目标。所有肿瘤样本均发现有CD3浸润⁺ T细胞在不同程度上。FoxP3⁺ Tregs 始终表达 CD3，是浸润性 T 细胞群中的主要亚群之一。表达 IL-17 的 CD3 细胞（Th17 细胞）仅占浸润性 T 细胞中的...

讨论

对于所述实验方案，最关键的步骤之一是确定所用一抗的合适稀释比例。标记二抗的稀释比例为1:200，这是由该特定Alexa标记抗体的制造商推荐的。一抗的稀释比例应通过系列稀释法确定，最好使用两种不同的目标组织样本（本例中为口咽鳞状细胞癌，OPSCC）。最佳工作稀释度是指在该稀释度下可获得清晰信号，无背景干扰，且在相同浓度下阴性对照无信号出现。根据可用显微镜类型及研究者的偏好，可对所用二抗类型和封片介质进行调整。如果未达到预期结果，我们建议检查所用载玻片的类型，因为某些载玻片已知会对特定染色液产生背景信号问题。例如， Perma Blue）。其次，某些抗原可能会因热诱导表位修复而遭到破坏，此时研究人员可采用其他技术替代缓冲液加热步骤，例如酶诱导表位修复。第三，若使用疏水笔标记，划线位置不应过于靠近组织，以免影响染色液的正常作用。关于每个样本所需的切片数量以及每张切片需采集的图像数量，应由研究人员根据具体研究问题决定，以确保具有足够的统计学效力。在本研究中，我们每个样本使用一张切片，每张切片采集四幅图像。最后，进行免疫荧光染色时，使用指甲油封固盖玻片需格外小心，因为指甲油溶液中的酒精可能影响荧光信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Pathos Delta 超快速组织处理仪	Milestone 和 Histostar		全自动组织处理仪
Histostar	Thermo Scientific		组织包埋机
甲醛	Baker
二甲苯	Merck
乙醇	Merck
超纯水（milliQ 水）	Elaga Purelab Chorus
石蜡/Paraclean	Klinipath	5079A
切片机组织夹持器	Leica	RM225
Flex IHC 侧向切片仪	Dako		组织切片
Tris	Merk-Milipore	1,083,821,000
EDTA	Baker	1073
PBS	Bio-Rad	BUF036A
BSA	Sigma	A9647
兔抗 CD3 抗体	Abcam	ab828	需滴定确定最佳抗体稀释度
小鼠 IgG1 抗 FoxP3 抗体	Abcam	ab20034	需滴定确定最佳抗体稀释度
山羊 IgG 抗 IL-17 抗体	R&D Systems	AF-317-NA	需滴定确定最佳抗体稀释度
兔 Ig 同型对照抗体	Abcam	ab27472	使用浓度应与抗 CD3 抗体终浓度相同
小鼠 IgG1 同型对照抗体	Abcam	ab91353	使用浓度应与抗 FoxP3 抗体终浓度相同
山羊 IgG 同型对照抗体	ThermoFisher Scientific	02-6202	使用浓度应与抗 IL-17 抗体终浓度相同
驴抗兔 IgG A546	ThermoFisher Scientific	A10040	用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200
驴抗小鼠 A647	ThermoFisher Scientific	A31571	用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200
驴抗山羊 IgG A488	ThermoFisher Scientific	A11055	用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200
含 DAPI 的 VectaShield 封片剂	Vector Laboratories	H-1200
LSM700 共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss
LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 物镜	Zeiss	420852-9972-720
LSM Zen 软件	Zeiss	版本 2009
LSM 图像浏览器	Zeiss	版本 4.2.0.121	可从 www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html 下载。
SPSS	IBM Corp.	版本 20.0
ImageJ		版本 1.50i	可从 http://rsb.info.nih.gov/ij 下载。