一种非侵入性方法从结膜分离并进行细胞表型分析

摘要

暴露的正常眼表由角膜和结膜组成。结膜中含有上皮细胞、杯状细胞和免疫细胞。本文介绍了一种非侵入性的印迹细胞学技术，利用印迹细胞学装置和流式细胞术分析结膜中的免疫细胞。

摘要

传统上，眼表细胞学研究采用刮匙技术和刷子技术。这些技术的问题在于可能在眼部表面引起创伤性损伤，进而发展为瘢痕形成、眼睑畸形、角膜缘干细胞缺乏，某些情况下还会给受试者带来明显不适。为避免这些临床问题，人们开发了印迹细胞学（IC）技术，用于诊断干眼病，随后也应用于肿瘤性疾病、变应性疾病、春季角结膜炎以及干燥性角结膜炎的诊断。通常情况下，临床医生需手动将滤纸裁剪成所需形状，然后将其贴附于眼表。本文介绍如何使用一种 commercially available medical device（市售医疗器械）进行IC操作，随后结合流式细胞术进行免疫表型分析。该方法所需人工操作步骤更少，对眼表造成的损伤也更轻。

引言

印迹细胞学（IC）最早由 Thatcher 等人¹. 他们使用塑料印模片从患者结膜采集细胞，而非当时可用的其他技术，如刮取、拭子取样或移液。¹目前的IC技术使用一种吸水性滤纸² 用于印染球结膜和睑结膜，以采集最表层的结膜细胞。这些细胞已达到终末分化阶段，会持续脱落进入泪液³. 在IC标本中可发现三种主要的细胞群体：上皮细胞⁴杯状细胞^3,5以及黏膜相关淋巴组织 即 上皮相关效应T细胞或树突状细胞⁶IC 样本中的眼表细胞可通过显微镜检查、免疫印迹和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行分析⁷流式细胞术最近已被用于分析通过刮取IC膜收集的免疫细胞⁸有趣的是，IC^6,9 已用于评估多种眼表疾病，包括干燥性角结膜炎、维生素A缺乏、瘢痕性类天疱疮、特应性疾病、上方 limbic 角结膜炎、春季角结膜炎以及上皮鳞状化生。IC 还被用于评估佩戴隐形眼镜对眼表的影响、检测眼表微生物，以及在纵向研究中评价治疗干预措施的疗效和耐受性。^10,11,12.

该医疗器械（EyePrim）采用一种聚醚砜（PES）0.2-µm膜作为支撑，此前已验证可用于眼表印迹细胞学联合流式细胞术（OSIC-flow）技术，为利用纵向采样监测疾病进展及治疗反应提供了可能例如，结膜上皮内白细胞的详细分析被定义为黏膜类天疱疮中进行性结膜纤维化的潜在疾病标志物¹³早期的研究人员使用经高压灭菌的聚醚砜（PES）滤膜，需手动施加压力进行压印，导致产率不稳定且依赖操作者经验。该医疗器械的优势在于操作简便、压力标准化（Pa 或 N/m²）。²），并能够实现可重复性、可再现性以及稳定的细胞回收。该技术适用于门诊诊所，因其具有非手术、操作简便且快速的特点。根据指令93/42/CEE，此为I类（无菌）医疗器械，CE 0499（SNCH）。操作过程中仅需局部麻醉，可有效保持眼表结构的完整性。采集后，细胞可立即用于流式细胞术分析。此外，非眼科专业的技术人员和护士亦可经培训后完成眼表采样。

尽管印迹细胞学（IC）相较于其他技术有所改进，但仍存在若干挑战。例如，由于采样区域以及球结膜不同部位的差异，IC操作时的位置可能引起变异。另一个变异来源是在IC过程中施加的压力大小不同所致。其他方法学问题涉及细胞处理的标准化：包括固定的时间和方法，以及可能的储存条件，这些因素均可能影响所采集样本材料的稳定性。

该技术的总体目标是建立一种易于使用、非侵入性的眼部印迹样本分离方法，并可用于临床样本的免疫学表征。

方案

本研究中使用的所有眼部样本均来自新加坡国立眼科中心干眼诊所，该研究已获新加坡SingHealth中央机构审查委员会和南洋理工大学机构审查委员会批准。

注意：在进行结膜印迹细胞学检查（IC）之前，受试者接受了临床检查，以评估炎症程度和泪液功能障碍的严重性。临床检查包括使用诊断仪器评估的非侵入性泪膜破裂时间（NI-TBUT）¹⁴和结膜充血（充血）^15,16、Schirmer试验¹⁷、标准眼部干燥症状评估问卷（SPEED）¹⁸以及角膜染色¹⁹。

1. 通过IC采集眼部样本

1. 确定临床状态后，通过在上方球结膜和下穹窿处滴入1-2滴局部麻醉剂盐酸丙帕卡因，对受试者的眼睛进行麻醉。等待4-5分钟，直至麻醉剂的刺痛感消失。
2. 使用两个印迹细胞学装置分别采集鼻侧和颞侧球结膜样本。
   注意：一个装置用于采集两个印迹样本。此处使用了两个装置以采集四张印迹膜。
   1. 将印迹细胞学装置切向放置于结膜表面，轻压按钮并保持2-3秒。
      注意：该装置自带膜。按下按钮后压力会自动释放，仅需数秒即可完成压力释放并取下装置。
3. 用手术刀将膜释放至含有1 mL培养基（RPMI培养基（Roswell Park Memorial Institute medium）+ 10%胎牛血清（FBS）+ 1%青霉素-链霉素（Pen Strep））的微量离心管中。
4. 使用10 µL移液器枪头持续刮取膜表面约1分钟，以从装置膜上分离细胞。
   注意：当膜表面变得不平整时，刮取即已完成。每张膜上的细胞数量不等（100-500个细胞/膜）。样本采集后应在2-3小时内完成处理。

2. 通过流式细胞术对细胞进行免疫表型分析

1. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟，去除培养基。用 50 µL 流式细胞术染色缓冲液（磷酸盐缓冲液 (PBS) + 0.05% 牛血清白蛋白 (BSA)）重悬细胞沉淀。
2. 使用一组抗体对细胞进行染色（例如，CD3 Brilliant Violet (BV) 510（UCHT1）、CD4 Allophycocyanin-H7（APC-H7）（SK3）、CCR7 Phycoerythrin（PE）-A、CD45RO PE-Cyanin 7（PE-Cy7）-A 以及活/死细胞标记 7-ADD），室温避光孵育 20–30 分钟。根据生产商说明书，直接使用原液抗体。
   注意：抗体使用浓度为 CD3-BV510 2.5 µL、CD4-APC-H7 1.25 µL、CD45RO-PE-Cy7 1.25 µL、7-AAD 1.25 µL 以及 CCR7-PE 10 µL。使用外周血单个核细胞（PBMCs）对不同抗体浓度进行滴定。进行滴定时，参考生产商说明书推荐的抗体浓度，分别使用推荐浓度的1/2和1/4。应使用最低有效抗体浓度，以避免荧光染料信号溢至其他检测通道。使用上述抗体浓度时可观察到清晰的信号。补偿设置通过按照 Williams 所述方案对 PBMCs 进行初步检测完成。 等.²⁰ 用于检测时，将PBMCs与本研究中使用的相同抗体组合进行孵育，并通过比较单种和多种抗体染色来校正补偿。
3. 孵育结束后，向离心管中加入1 mL染色缓冲液，充分混匀，于室温下以450 × g离心5分钟。将细胞重悬于200 µL染色缓冲液中。
4. 在流式细胞仪上运行样本。
   1. 在采集数据之前，使用细胞仪设置与追踪（CS&T) 珠子，以根据制造商说明书对不同日期的数据采集进行归一化处理。
      1. 打开流式细胞术数据采集软件，点击 "设置 & 质量控制" 按钮，选择正确的 CS&T 珠子批号，加载珠子，然后单击 "开始" 按钮。
   2. 轻轻敲击试管以重悬细胞，然后将样品加入仪器。打开数据采集软件并点击 "预览"当阈值速率稳定时，单击 "获取". 监测样品液面高度并点击 "停止" 当样本耗尽时。
      注意：每个样本采集 10,000 个事件。
   3. 在获取 10,000 个事件后，在工作表中生成 SSC-A 与 FSC-A 的散点图。
      1. 点击 "多边形门" 按钮，并在所有具有 FSC-A 值的事件上绘制一个门（此为 P1） > 5 × 10⁴ 以排除碎片。点击 "创建点图" 按钮以生成新的点状图，右键点击点状图，选择 "性质" 打开 "绘图编辑器" 窗口，然后选择 "P1". 在P1点图的x轴上点击FSC-A，将其更改为CD3-BV510。绘制“多边形门”以选择CD3⁺ 群体并命名为“P2”。
      2. 点击 "创建点状图" 按钮以生成新的点状图，右键点击点状图，选择 "特性" 打开 "绘图编辑器" 窗口。点击P2点图x轴上的FSC-A，将其更改为7-AAD。为7-AAD绘制“多边形门”^- 群体并选择“P3”。此处的P3为CD3⁺ 活细胞
      3. 点击 "创建点图" 按钮以生成新的点状图，右键点击点状图，选择 "特性" 打开 "绘图编辑器" 窗口。在P3散点图中，将x轴设为CD3-BV510，y轴设为CD4-APCH7。在象限上方和下方分别绘制矩形门，选择“P4”和“P5”。P4为活细胞CD3⁺CD4⁺ 以及 P5 为活的 CD3 阳性细胞⁺CD4^- T细胞
      4. 点击 "创建点图" 按钮以生成新的点状图，右键点击点状图，选择 "性质" 打开 "绘图编辑器" 窗口。在P4和P5图中，将x轴设为CD45RO PE-Cy7，y轴设为CCR7-PE。在此散点图上绘制“四象限门”。
         注意：此处左上象限、右上象限、右下象限和左下象限分别为初始型、中央记忆型（T_CM)，效应记忆（T_{电子显微镜}），终末分化的效应记忆（T_{终末分化效应记忆T细胞（EMRA）}T细胞

结果

利用该临床设备进行印迹细胞学（IC）可在保持眼表结构完整的同时，分离获取眼表免疫细胞。 图1 描述了IC操作的具体步骤，并标注了样本采集的眼表不同部位。图2 展示了来自10名健康对照者的流式细胞术代表性结果。在设门策略中，使用SSC和7-AAD区分活细胞与死细胞，7-AAD^-细胞被定义为活细胞。这些活细胞进一步通过CD3⁺和CD4⁺标志物进行表型鉴定。此外，CD4⁺和CD4^-细胞群分别根据CCR7和CD45RO标志物进一步细分为初始型（Naïve）、效应记忆T细胞（T_EM）、中央记忆T细胞（T_CM）和终末分化效应记忆T细胞（T_EMRA）。在CD3⁺ T细胞中，效应记忆T细胞在人眼表占主导地位。在前期研究中也已证实，在健康个体的结膜上皮T细胞中，CD8⁺记忆T细胞为主要细胞群体²⁰。图3 显示，在所研究的10名健康对照者中，CD4⁺和CD8⁺效应记忆T细胞（T_EM和T_EMRA）是人眼表的主要细胞亚群。图中各细胞群均标注其标志物表型及名称（Naïve、T_CM、T_EM、T_EMRA），红色数字表示该细胞群所占百分比。本图数据以均值±标准误（SEM）表示。

图1：通过印迹细胞学装置从眼表采集IC样本。 样本按图示从颞侧球结膜区域采集。

图2：使用流式细胞术的点图分析。 选择活细胞（7-AAD^-）。首先对 CD3⁺ 细胞设门，然后将该细胞群进一步分为 CD4⁺ 和 CD4^- 亚群。通过 CCR7 和 CD45RO 标记物确定初始型（CCR7⁺CD45RO^-）、中央记忆型（CCR7⁺CD45RO⁺）和效应记忆型（CCR7^-CD45RO⁺；CCR7^-CD45RO^-）亚群的比例。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：健康人眼表CD4⁺和CD8⁺ T细胞中的免疫细胞亚型。 健康人对照组结膜中CD4⁺和CD8⁺初始型、中央记忆型（T_CM）及效应记忆型（T_EM和T_EMRA）T细胞亚群的分布情况；每个数据点代表一个独立个体的平均值±标准误。各亚群名称下方红色标注为其在总群中所占百分比。总百分比为98%，因为CD4⁺ T_EMRA亚群未包含在该散点图中（改编自Bose et al.²¹）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

这是一种简便、快速且侵入性较小的技术，可在门诊诊所中用于相对快速的免疫谱分析，与传统的刮取、拭子取样、移液或使用吸水滤纸等方法相比具有优势^1,2。该技术的一种变体目前已在科研环境中应用²²。 本方法未来的应用方向是用于患有眼部疾病患者的临床试验中的分层，特别是那些需要进行免疫表型分析的患者。

该技术的一个主要挑战是在印迹采集和刮取后获得的免疫细胞数量相对较少。从每位个体的四个印迹样本中回收的CD3⁺ T细胞总数约为500至1,000个细胞。为避免细胞进一步丢失，眼部样本在流式细胞术分析前仅进行了最少次数的洗涤。该实验方案中仍存在的关键步骤和挑战包括眼部样本的有效采集以及膜的充分刮取，以获得更高的细胞数量。尽管如此，这一局限性不太可能对任何特定的免疫表型产生偏倚。为最大限度提高细胞得率，本研究中采取的优化措施是减少抗体孵育前后洗涤步骤的次数。

使用结膜印迹细胞学（IC）还存在其他局限性。对于重症角化或纤维化的 ocular 表面患者（如 Stevens-Johnson 综合征患者），细胞收获量可能比本研究中更低。如果样本不是在采集当天立即分析，而是进行储存，则免疫细胞的比例可能会发生变化。目前难以预测某些细胞类型是否比其他细胞类型对储存更具耐受性。既往研究报道，结膜上皮细胞中 HLA-DR 表达水平升高²³，因此评估 HLA-DR 与特定免疫细胞水平之间的相关性将具有重要意义。免疫细胞也可能与趋化因子的表达水平相关。这些问题有待在未来的研究中进一步探讨。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
抗人 CD3 BV510	BD Biosciences	563109
抗人 CD4 APCH7	BD Biosciences	641398
抗人 CD45RO PECy7	BD Biosciences	337168
7-AAD 溶液	BD Biosciences	555816
抗人 CCR7 PE	BD Biosciences	552176
移液器	Eppendorf	NA
局部麻醉剂	Alcaine	NA
荧光素钠溶液	Bausch & Lomb U.K Limited	NA
名称	公司	目录编号	备注
设备
Keratograph 5M	Oculus	NA
裂隙灯生物显微镜	Haag Streit	BM900
EyePrim	Opia Technologies	NA
FACS Verse	BD BioSciences	NA
名称	公司	目录编号	备注
软件
GraphPad 6.0	Prism	NA
FACSVerse 分析软件	BD	NA