一种眼组织中效应记忆T细胞增加的慢性自身免疫性干眼大鼠模型

摘要

本报告描述了一种通过免疫诱导Lewis大鼠产生慢性实验性自身免疫性干眼症的方法：首先使用大鼠泪腺提取物、卵清蛋白和完全弗氏佐剂的乳剂进行免疫，六周后再次向结膜穹隆下和泪腺内注射泪腺提取物和卵清蛋白。

摘要

干眼病是一种非常常见的疾病，可导致病患率和医疗负担增加，并降低生活质量。目前需要一种合适的干眼动物模型，以测试治疗自身免疫性干眼病的新疗法。本方案描述了一种慢性自身免疫性干眼大鼠模型。将Lewis大鼠用含有泪腺提取物、卵清蛋白和完全弗氏佐剂的乳剂进行免疫。两周后，使用相同抗原但含不完全弗氏佐剂的乳剂进行第二次免疫。上述免疫均在尾根部皮下注射进行。为了增强眼表和泪腺的免疫反应，在首次免疫6周后，将泪腺提取物和卵清蛋白分别注射至结膜穹窿下和泪腺组织内。大鼠表现出干眼病的特征，包括泪液分泌减少、泪膜稳定性下降以及角膜损伤加重。通过流式细胞术进行免疫表型分析显示，眼球中CD3⁺效应记忆T细胞占主导地位。

引言

干眼症（DED）是一种涉及泪液和眼表的多因素疾病，可导致眼部不适、视觉干扰和泪膜不稳定等症状，并可能造成眼表损伤。该病常伴有泪膜渗透压升高以及眼表炎症¹。与 DED 相关的症状包括烧灼感、刺痛感、异物感、砂砾感、流泪、眼疲劳和干涩感^2,3。DED 的两个主要病因是泪腺分泌泪液减少以及泪膜过度蒸发⁴。在患有自身免疫性疾病的患者中，例如干燥综合征、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎，免疫系统对睑板腺的损害会减少维持泪膜稳定性所必需的脂质表达；同时，免疫损伤累及眼表还会降低对眼表润湿性至关重要的黏蛋白的产生。上述过程共同作用，最终导致慢性干眼^5,6,7。

泪液替代和抗炎治疗是干眼症治疗的主要手段。然而，目前用于治疗干眼症（i.e.，DED）的抗炎疗法（如皮质类固醇和环孢素）具有广泛的免疫抑制作用，可能导致严重的不良反应^8,9,10。因此，亟需建立合适的动物模型，用于测试治疗自身免疫性干眼症的新型免疫调节剂。

具有特定基因缺陷^11,12,13、缺失特定基因^14,15的小鼠，以及过表达免疫调节基因的转基因小鼠，已被用作自身免疫性干眼病的动物模型^16,17。抗原诱导的自身免疫动物模型也已在小鼠¹⁸、兔¹⁹和大鼠^20,21中报道。本文中，我们描述一种抗原诱导的慢性自身免疫性干眼病模型。该模型是在此前两种模型基础上的改进：一种使用泪腺提取物，另一种使用泪腺中的自身抗原（即 klk1b22）^20,21。

通过皮下免疫6至8周龄雌性Lewis大鼠卵清蛋白、完全弗氏佐剂以及含有Sprague-Dawley大鼠泪腺提取物的乳剂来诱导疾病（图1）。两周后，使用相同抗原但含不完全弗氏佐剂进行第二次免疫。为了将抗原特异性免疫细胞募集至泪腺和眼表，在第6^第-7^第周时将泪腺提取物与卵清蛋白（1 mg/mL）的混合物注射至结膜穹窿下和泪腺内（图1）。首次免疫后70天，超过85%的大鼠出现干眼病的典型特征，包括泪液分泌减少（图2）、角膜荧光素染色增加（图3）以及泪膜稳定性下降（图4）。通过流式细胞术对正常大鼠眼球中的T细胞进行免疫表型分析，结果显示以CD3⁺效应记忆T细胞为主（图5和图6）。自身免疫性干眼病大鼠则表现为CD3⁺效应记忆T细胞增加，同时初始T细胞和中央记忆T细胞相应减少（图6）。

方案

动物饲养和操作遵循机构指南以及眼科和视觉研究中动物使用ARVO声明。研究方案经新加坡保健机构动物护理和使用委员会批准。

1. 泪腺提取物的制备

注意：大鼠通过腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过夹捏足趾和尾部确认麻醉效果。每次操作后，向大鼠眼部涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥。麻醉后的大鼠置于远红外灯下保温，直至完全恢复意识。在实验操作及恢复期间，研究人员对动物进行密切监测。所有材料和手术器械在使用前均保持无菌状态。实验结束后，通过腹腔注射戊巴比妥（80 mg/kg）处死大鼠。通过无心搏动及触碰眼球无眨眼反射确认完全死亡 。大鼠饲养于标准环境中：室温21–23 °C，相对湿度30–70%，光照-黑暗循环为12小时交替（上午7点至晚上7点）。

1. 将安乐死后的雌性Sprague-Dawley大鼠（年龄范围为8至16周）平放，一侧耳朵紧贴桌面，另一侧朝上。用弹簧剪刀在暴露的耳朵下方沿头尾方向做一条10 mm的切口。从周围结缔组织及排液管中分离，取出泪腺。
   1. 将腺体储存于-80 °C，直至使用。在冰上解冻腺体，并在冰上用剪刀尽可能剪碎。每份泪腺加入150 µL含1×蛋白酶抑制剂的PBS。
2. 将样品置于冰上进行超声处理，超声条件为20 kHz，输出幅度30%，工作10秒，间歇10秒，总时长5分钟。超声处理后的样品在4 °C下以13,000 × g离心20分钟。
3. 用移液器吸取上清液并转移至新管中。将上清液分装至1.5 mL离心管，于-80 °C保存。按照制造商说明书，采用二辛可宁酸法测定蛋白浓度²²。

2. 乳剂和百日咳毒素的制备

1. 乳化液
   1. 将40 mg热灭活的Mycobacterium tuberculosis H37Ra加入到10 mL含有1 mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra的完全弗氏佐剂中，并充分混匀。
      注意：最终完全弗氏佐剂中含5 mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra。
   2. 称取卵清蛋白，用PBS溶解，配制含2 mg/mL卵清蛋白和10 mg/mL泪腺提取物的抗原混合液。根据动物数量，按每只动物注射200 µL的剂量配制总混合液。
   3. 将不完全弗氏佐剂或完全弗氏佐剂转移至50 mL离心管中，确保佐剂与抗原混合液的体积比为1:1。在高速涡旋（以不溅出为限）的同时，逐滴加入抗原混合液。加完全部抗原后继续涡旋5分钟。
   4. 将乳化液转移至5 mL注射器中，并通过注射器连接器与另一个5 mL注射器连接。将乳化液在两个注射器之间反复推注以充分混合。
      注意：若将一滴乳化液滴入水中后仍保持球形不扩散，则表明乳化完成。仅可使用新鲜配制或4 °C过夜保存的乳化液。
2. 百日咳毒素
   1. 将50 µg百日咳毒素溶于500 µL水中，配制成终浓度为100 ng/µL的溶液。涡旋振荡容器30秒，确保毒素完全溶解。
      注意：不可通过过滤除菌，否则会导致物质损失；不可冷冻。该溶液在4 °C下至少可保持活性6个月。
   2. 用PBS将100 ng/µL的百日咳毒素稀释至3 ng/µL。取100 µL稀释后的百日咳毒素，加入带有27 G针头的1 mL鲁尔锁型注射器中。

3. Lewis 大鼠的免疫

1. 第0天，将乳剂混匀数次。取200 µL乳剂（含1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于完全弗氏佐剂中），分装至带27G针头的1 mL鲁尔锁型注射器中。无需麻醉，直接将乳剂皮下注射于大鼠尾根部。
   注意：注射前无需预热尾部。每只大鼠接种剂量为1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于含500 µg Mycobacterium tuberculosis H37Ra的完全弗氏佐剂中。
2. 第14天，以与第0天相同的方式注射200 µL乳剂（含1 mg泪腺提取物和200 µg卵清蛋白，溶于不完全弗氏佐剂中）。同日，每只大鼠腹腔注射含300 ng百日咳毒素的100 µL PBS溶液。

4. 将抗原混合物注射至穹隆部结膜下及泪腺以募集抗原特异性免疫细胞并引发局部炎症

1. 根据实验所用大鼠数量计算卵清蛋白和泪腺提取物的用量。称取所需量的卵清蛋白，与步骤1中制备的解冻泪腺提取物混合，配制成含1 mg/mL卵清蛋白和1 mg/mL泪腺提取物的抗原溶液。
2. 用氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）通过腹腔注射麻醉大鼠。夹捏大鼠脚趾以确认已达到适当的麻醉状态（即， 捏压后无反应性运动）。向眼部穹隆部结膜下注射5 µL抗原。向泪腺注射20 µL抗原。

5. 干眼症特征的评估

注意：执行步骤 5.1-5.3 时，应将已麻醉的大鼠置于平坦表面上，用戴手套的手轻轻握住，保持直立姿势，以避免其移动。

1. 使用酚红棉线测量泪液体积。
   1. 使用一对镊子夹住棉线，另一对镊子拉开大鼠的下眼睑。将棉线置于下穹窿近端角落处1分钟，然后取出棉线。
      注意：泪液会使棉线湿润部分变为红色。
   2. 在带有毫米刻度的尺子旁拍摄棉线湿润部分长度的照片。使用图像软件（例如，ImageJ）测量湿润长度至十分之一毫米。
2. 测量角膜/泪膜光滑度。
   1. 将大鼠置于配备环形照明器和相机的体视显微镜下。在大鼠角膜上滴加5 µL生理盐水。用戴手套的手指被动开闭上下眼睑约5次，使生理盐水均匀分布。
   2. 在1.6倍放大倍率下，将环形照明器聚焦于角膜表面中央。10秒后采集图像。
      注意：环形照明器会在动物角膜上投射出两圈圆形光点。光点间距规则且无畸变，提示角膜/泪膜层光滑。
3. 使用荧光素染色法评估角膜损伤。
   1. 在大鼠角膜上滴加2 µL 0.2%荧光素钠溶液。用戴手套的手指被动开闭大鼠眼睑3次，使荧光素染料均匀分布在眼球表面。
   2. 1分钟后，用一支3 mL注射器（不带针头）吸取1 mL生理盐水，将注射器置于角膜前方约2–3 mm处，轻轻将生理盐水喷射至眼球表面。
   3. 在关闭背景光的情况下，使用眼科成像显微镜的钴蓝滤光片（即，~400 nm）采集图像。
      注意：图像随后采用根据先前文献修改的评分系统进行分析²³。通过主观评估绿色斑点的数量、面积和强度，将其分为0至2级：0级表示无染色，1级表示少于50个点状染色，2级表示多于50个点状染色。
4. 通过腹腔注射戊巴比妥（80 mg/kg）处死大鼠。使用剪刀切除上下眼睑。用镊子按压眼周组织，固定并使眼球突出。切断眼外肌、视神经和穹窿部结膜，游离眼球。
5. 用镊子固定大鼠眼球位置，沿赤道部做环形切口打开眼球。取出晶状体和玻璃体。将解剖后的眼球组织放入盛有冰的1.5 mL离心管中。
6. 按照步骤1.1所述方法采集泪腺。立即将解剖后的眼球组织和泪腺转移至实验室，准备进行流式细胞术分析。
7. 采用胶原酶和dispase II消化法分离免疫细胞^24,25。随后使用流式细胞术分析眼球组织中的T细胞亚群²⁶。
   注意：所用抗体组合为：抗-CD45APC-Cyanine7（OX-1）、抗-CD3 BV421（1F4）、抗-CD4 PE-Cyanine7（OX-35）、抗-CD45RC Alexa647（OX-22）、抗-CD62L PE（HRL1）、抗-CD44 FITC（OX-50）以及活率染料7-AAD。在CD45⁺CD3⁺7AAD^-细胞群体中，进一步设门分析初始T细胞（CD3⁺CD45RC⁺）、效应记忆T细胞（T_EM, CD3⁺CD45RC^-CD44⁺CD62L^-）和中央记忆T细胞（T_CM, CD3⁺CD45RC^-CD44⁺CD62L⁺）。

结果

图1展示了实验设计。在第48天和第70天，对免疫大鼠进行干眼临床特征评估。泪液量通过酚红棉线湿润部分的长度来表示。图2显示了对照组和干眼病（DED）大鼠酚红棉线的代表性图像。DED组酚红棉线的长度短于对照组，表明泪液量减少。

荧光素可结合受损的角膜上皮。因此，通过角膜荧光素染色来评估角膜损伤程度。干眼症（DED）大鼠角膜表面的荧光素染色斑点按0至2级进行评分，并与对照组大鼠进行比较。与对照组大鼠相比，DED大鼠的荧光素染色更明显（图3），提示存在角膜损伤。

通过环形照明器评估干眼病（DED）组和对照组大鼠角膜表面的光滑度。若角膜表面光滑且泪膜稳定性高，则眼表上的照明器环形图像呈完整圆形。图像出现畸变则提示角膜光滑度下降及泪膜不稳定。环形图像的畸变程度评分范围为0至2分。DED组大鼠的环形畸变程度更高（图4），表明其泪膜稳定性较差。

当大鼠至少出现两种干眼的临床特征异常时，即被定义为患有干眼症。在24只免疫大鼠中，有21只在第48天发展为干眼症（DED）。在第70天进行评估时，结果保持一致。

流式细胞术分析显示，正常大鼠眼球组织中主要的T细胞亚群为效应记忆T细胞（图5）。在干眼病（DED）大鼠的眼球中，约70%的CD3+ T细胞为效应记忆T细胞，而在对照组大鼠中，该比例约为50%。干眼病大鼠眼球中的效应记忆T细胞数量显著高于对照组大鼠（图6）。

图1：实验设计示意图。 LG：泪腺；DED：干眼病；CFA：完全弗氏佐剂；IFA：不完全弗氏佐剂。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：酚红棉线法测量泪液体积。 将酚红棉线置于大鼠双眼的近端眼角处 1 分钟，随后取出。图中显示了对照组和干眼病（DED）组具有代表性的酚红棉线图像，并附有标尺。使用 ImageJ 软件测量酚红棉线湿润部分的长度。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：通过荧光素染色检测的角膜上皮损伤代表性图像。 每只大鼠的角膜用0.2%荧光素染色1分钟，并用至少1 mL生理盐水冲洗。图像在眼科成像显微镜下使用钴蓝光拍摄。第一列为对照组角膜的代表性图像。第二列为具有干眼症（DED）特征的大鼠角膜染色的代表性图像。绿色荧光斑点表示角膜上皮损伤。所有图像均采用相同的颜色标尺。荧光素染色的定量分析依据绿色斑点的面积和密度进行。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：显示环形照明器反射的代表性角膜图像。 大鼠角膜/泪膜的光滑度通过环形照明器进行测量。所捕获图像中环形结构的扭曲程度反映了泪膜相对稳定性。左列为对照组动物的代表性图像，右列为干眼症诱导后的代表性图像。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：流式细胞术分析所得的散点图。 从眼球组织中分离的T细胞使用一组抗体进行染色。在CD45⁺CD3⁺7AAD^-细胞群中，对CD3⁺7-AAD^- T细胞进行门控。在CD3⁺7-AAD^- T细胞中，确定了初始T细胞、中央记忆T细胞和效应记忆T细胞群体。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：眼球中 T 细胞亚群分布特征。 初始型 T 细胞（CD3⁺CD45RC⁺）、效应记忆性 T 细胞（T_EM，CD3⁺CD45RC^-CD44⁺CD62L^-）和中央记忆性 T 细胞（T_CM，CD3⁺CD45RC^-CD44⁺CD62L⁺）均以占 CD3⁺ T 细胞的百分比表示。结果来自 3 只对照组大鼠和 6 只干眼症（DED）大鼠。对分离的泪腺中 T 细胞的分析也获得了类似结果（数据未显示）。统计学比较采用非配对 Student t 检验。误差线表示标准差（SD）。* p <0.05，** p <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该方案的关键步骤之一是确保乳剂的均一性。在制备良好的乳剂中，抗原完全被油相包被，从而确保注射后的抗原缓慢释放，并实现持续的免疫刺激。该方案的另一个关键特征是使用Lewis大鼠。与其他品系相比，Lewis大鼠更易发生自身免疫性疾病²⁷。

本方案修改自两种先前发表的方案，先前方案仅使用泪腺提取物或重组Klk1b22^20,21。在当前方案中，采用卵清蛋白联合泪腺提取物作为抗原，可吸引抗原特异性免疫细胞至眼表和泪腺，从而诱导局部组织损伤。干眼症发展缓慢，在初次免疫后第48天达到约85%的发生率。在第48天对眼部和泪腺进行抗原攻击会加重干眼症状，并使其慢性持续至第70天。

与Klk诱导的干眼症（DED）模型中使用的重组Klk1b22相比，本模型所用的泪腺提取物和卵清蛋白更便宜且更容易获得。此外，泪腺提取物除含有Klk外，还包含其他可能诱导自身免疫反应的蛋白质，因此理论上该提取物在诱导DED方面比单纯使用Klk的方法更具效力。我们还尝试仅用泪腺提取物免疫大鼠；尽管这些免疫大鼠确实发展出了DED，但与对照组相比，其眼球组织中效应记忆T细胞并未出现显著增加。

该技术的局限性在于建立模型需要70天。效应记忆T细胞是正常大鼠眼部主要的T细胞亚群。在此模型中，自身免疫性干眼病（DED）导致眼球内CD3⁺效应记忆T细胞数量增加。因此，优先抑制效应记忆T细胞的药物（如Kv1.3钾离子通道的选择性抑制剂）可能对自身免疫性DED具有治疗作用²⁸。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒	Thermal Scientific	23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton, Dickinson and company	231141
完全弗氏佐剂	Becton, Dickinson and company	231131
卵清蛋白	Sigma-Aldrich	A5503-10G
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506-6X10ML
百日咳毒素	Sigma-Aldrich	P7208-50UG
荧光素钠溶液	Bausch & Lomb U.K Limited	NA
名称	公司	目录编号	备注
设备
超声破碎仪	Sonics	Vibra-Cell
酚红棉线	天津精明新技术开发有限公司	NA
带环形光源和相机的体视显微镜	卡尔·蔡司	NA
Micro IV 显微镜	Phoenix Research Labs	NA