本文介绍了一种利用全身容积描记法和通过植入式遥测装置进行的肌电图记录，在肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠模型自由活动状态下，于疾病进展过程中反复测量通气功能和呼吸肌活动的方法。
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方法文章
神经肌肉疾病小鼠模型中呼吸肌活动与通气功能的重复测量
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
当膈肌功能受损时，辅助呼吸肌有助于维持通气。以下方案描述了一种在非麻醉、自由活动的小鼠中，对辅助呼吸肌活动进行数周至数月重复测量的方法，同时监测其通气功能。该技术包括外科手术植入无线发射器，并将电极导线插入斜角肌和斜方肌，以记录这些吸气肌的肌电图活动。通气功能通过全身体积描记法进行测量，动物运动通过视频监测，并与肌电图活动同步记录。本文展示了在肌萎缩侧索硬化小鼠模型中对肌肉活动和通气功能的测量结果，以说明该工具如何用于研究呼吸肌活动随时间的变化，以及评估肌肉活动对通气功能的影响。所描述的方法可轻松调整，用于测量其他肌肉的活动，或在其他疾病或损伤的小鼠模型中评估辅助呼吸肌的活动。
引言
在高通气需求情况下（例如，运动时），辅助呼吸肌（ARMs）可增加通气量，并在因损伤或疾病导致膈肌功能受损时帮助维持通气1,2。尽管肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者及小鼠模型中膈肌功能的变化已有较充分的描述3,4,5,6，但关于ALS中ARMs的活动或功能所知甚少。然而，有研究提示，能够动员ARMs的ALS患者相较于膈肌功能障碍程度相似但无法动员ARMs的患者具有更好的预后7。此外，在膈肌麻痹的情况下，ARMs的活动足以维持呼吸8。这些研究表明，增强ARMs功能的策略可能改善患有神经肌肉疾病、脊髓损伤或其他导致膈肌功能障碍疾病的患者的呼吸功能。然而，控制ARMs在呼吸过程中被募集的机制在很大程度上仍不清楚。为了研究ARMs是如何被募集的，并评估改善ARMs募集和通气功能的治疗方法，亟需建立可在疾病或损伤动物模型中随时间测量呼吸功能及ARMs活动变化的方法。此外，在膈肌功能进行性丧失的同时，ARMs活动的增加可能成为ALS等神经肌肉疾病进展过程中一个有价值....
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方案
实验操作已获辛辛那提儿童医院医学中心机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》的规定进行。
1. 遥测设备植入手术的准备工作
- 穿戴个人防护装备（即， 刷手服、鞋套、隔离衣、发网、口罩和外科手套。
注意：该手术需要无菌环境。 - 打开培养箱（伺服控制加湿器/婴儿培养箱，设定为 29 °C）°C并用干燥的白色毛巾铺垫，以确保适当的保暖，促进恢复。
- 手术前，使用环氧乙烷对所有手术器械进行灭菌，并在使用前用酶类清洁剂和化学消毒剂（或按照制造商说明）对发射器进行灭菌。
注意：手术器械应包括#2号椎板切除钳（标准头/直头/12 cm）（x4）、窄型齿状钳（有齿/弯头/12 cm）、组织分离剪（直头/钝头-钝头/11.5 cm），以及持刀柄和刀片。建议另备一套灭菌器械（两把#2号钳和剪刀），专门用于处理发射器导线，以保持手术器械的良好状态。 - 用合适的消毒剂对手术区域内的所有表面进行消毒。在手术区域内放置体视解剖显微镜、异氟烷麻醉机、手术器械和毛发剪（参见 材料表).
- 在麻醉期间为维持小鼠体温，将加热垫或水毯放置在体视解剖显微镜前无菌毛巾下方。
- 使用前确保发射器功能完好。
注意：将一块小磁铁放置在距离发射器2英寸范围内，可打开或关闭该设备。当发射器开启并靠近调至500 Hz AM频率的收....
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结果
所描述的方案用于植入遥测设备，并记录SOD1(G93A) ALS模型小鼠的斜角肌和斜方肌肌电图、全身体积描记（WBP）以及视频。动物处于非活动状态的时段例如， 通过视频记录识别出未移动的个体（即无运动），并结合全身压电记录（WBP）轨迹中缺乏与运动相关活动予以确认（图3A）。非活动期包括处于快速眼动（REM）睡眠或非快速眼动（REM）睡眠的时间，以及清醒但静止不动的时间（图3A）。在此非活动期间，当至少连续3个经整流和积分（30 ms）的信号值振幅较基线EMG水平升高至少50%时，记为一次活动事件。图4）。通过体积描记法确定的在叹息或嗅探期间发生的活动，以及通过视频评估的自主运动，均被排除在分析之外（图3B-C). 处于早至中期症状阶段的 SOD1(G93A) 小鼠（表1）在静息状态下表现出阵发性上肢肌肉活动增强，持续时间为一至数次呼吸周期（图4). 在.......
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讨论
本文所展示的方法能够在同一动物体内，于初次手术植入发射器后，以非侵入性方式长期（数月）测量呼吸肌活动和通气功能。该技术相较于在麻醉小鼠中使用标准肌电图（EMG）技术具有多项优势：1）实验所需小鼠数量更少，并可在同一只小鼠的不同疾病阶段持续记录同一部位的数据（而非在不同疾病阶段使用多只小鼠）；2）数据分析可采用更强大的统计学方法（即采用重复测量设计，而非比较独立的实验组）；3）同步记录肌电图（EMG）和整体身体容积描记法（WBP）可直接评估呼吸辅助肌（ARM）活动对通气功能的影响；4）实验可在小鼠处于不同睡眠/觉醒状态时进行。此外，由于健康小鼠在静息状态下呼吸辅助肌（ARM）阵发性活动频率极低，该技术能够在肌萎缩侧索硬化（ALS）模型小鼠出现早期症状阶段即检测到ARM活动频率的微小变化10。然而，由于该技术测量的是自然行为过程中大量但未知数量的肌纤维活动，而非在实验可控强度下通过神经刺激来记录，因此不适用于运动单位大小或数量的估算。另一项局限性在于，目前适用于小鼠植入的遥测发射器仅支持两组生物电势引线，因此每只小鼠只能同时记录两个部位的信号。对于需要在同一小鼠中同步记录两个.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了辛辛那提儿童医院医学中心受托人奖（授予 S.A.C.）以及美国国立卫生研究院培训基金（T32NS007453，授予 V.N.J.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | 杰克逊实验室 | 4435 | |
| 体积描记室 | Buxco 呼吸产品 / 数据科学国际公司 | 601-1425-001 | |
| 遥测接收器（型号 RPC-1） | 数据科学国际公司 | 272-6001-001 | |
| 偏置流泵（型号 BFL0500） | 数据科学国际公司 | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | 数据科学国际公司 | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. 数据交换矩阵 | 数据科学国际公司 | 271-0117-001 | |
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| Ponemah 无束缚全呼吸体积描记分析模块 v5.20 | 数据科学国际公司 | PNM-URP100W | |
| 配置型 Ponemah 软件系统 | 数据科学国际公司 | PNM-P3P-CFG | |
| 分析模块（URP） | 数据科学国际公司 | PNM-URP100W | |
| 通用放大器 | 数据科学国际公司 | 13-7715-59 | |
| 同步板 | 数据科学国际公司 | 271-0401-001 | |
| 同步电缆 | 数据科学国际公司 | 274-0030-001 | |
| 压力换能器 Buxco | 数据科学国际公司 | 600-1114-001 | |
| 流量计 | 数据科学国际公司 | 600-1260-001 | |
| F20-EET 启动套件中包含的磁铁和无线电装置 | 数据科学国际公司 | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 视频摄像机 | 数据科学国际公司 | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | 菲舍尔科技公司 | 50-821-785 | 酶类清洁剂 |
| Actril | 明特科技公司 | 78337-000 | 化学消毒剂 |
| 体视解剖显微镜（型号 MEB126） | 徕卡 | 10-450-508 | |
| 伺服控制加湿器/婴儿培养箱 | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET 发射器 | 数据科学国际公司 | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 脊椎切除镊 - 标准尖端/直型/12 cm（x2） | 精细科学仪器公司 | 11223-20 | 用于处理导线 |
| Dumont #2 脊椎切除镊 - 标准尖端/直型/12 cm（x2） | 精细科学仪器公司 | 11223-20 | 用于手术 |
| 窄型图案镊 - 有齿/弯型/12 cm | 精细科学仪器公司 | 17003-12 | |
| 弹簧剪 - 耐用切割/直型/锐利/12.5 cm/6 mm 刃口 | 精细科学仪器公司 | 15124-12 | |
| 组织分离剪 - 直型/钝头-钝头/11.5 cm | 精细科学仪器公司 | 14072-10 | |
| 精细剪 - 耐用切割/弯型/锐头-锐头/9 cm | 精细科学仪器公司 | 14058-11 | 用于剪切导线和修剪指甲 |
| 手术刀柄 #3 | 世界精密仪器公司 | 500236 | |
| 手术刀片 | 精细科学仪器公司 | 10010-00 | 用于制备导线帽 |
| Polysorb 编织可吸收缝合线 | Coviden | D4G1532X | 用于缠绕发射器导线 |
| Gluture | 硕腾公司 | 6606-65-1 | 氰基丙烯酸酯粘合剂 |
| 3 mL 软质滑动接头注射器 | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G 针头（x2） | 贝克顿·迪金森公司 | 305-145 | |
| 棉签 | 亨利·谢恩动物健康公司 | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut 理发剪套装 | Andis | 049-06-0271 | Target 商店销售的电动剃须刀 |
| 异氟烷 | 亨利·谢恩动物健康公司 | 29404 | 麻醉剂 |
| 70% 异丙醇 | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% 医用擦洗液（含 2% 氯己定） | Butler Schein | 55482 | |
| 人工泪液 | 亨利·谢恩动物健康公司 | 48272 | 润滑性眼用软膏 |
| 真空润滑脂 | 道康宁公司 | 1597418 | |
| 水毯 | JorVet | JOR784BN |
参考文献
- Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
- Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation.....
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