从成年大鼠心脏中同时分离高质量心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞

摘要

已开发并描述了多种从大鼠心脏中分离不同心肌细胞类型的方案。本文介绍了一种优化的方案，可从单次制备中分离出高质量的主要心肌细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞），从而降低实验成本。

摘要

大鼠是心血管研究中重要的动物模型，大鼠心肌细胞通常用于体外分析心血管疾病进展的分子机制，例如心肌肥厚、纤维化和动脉粥样硬化。in vitro 尽管已有多种尝试以不同成功率建立心血管系统永生化细胞系来研究这些细胞机制，但原代细胞能为这类研究提供更自然且更接近体内（in vivo）的环境。因此，从事特定细胞类型研究的多个实验室已开发出分离特定类型大鼠心肌细胞的方案。然而，目前尚缺乏一种能够同时分离多种细胞类型的统一方案。本文介绍了一种优化的方案，可从单次制备中分离出高质量的主要心肌细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞），并可用于后续的细胞分析。该方法可最大限度地高效利用现有资源，节省时间并降低研究成本。

引言

长期以来，啮齿类动物模型被用作研究健康和疾病状态下心血管生理学的重要工具。¹ 尽管这些动物模型有助于我们在器官水平上理解疾病的病理生理过程，并分析用于治疗心血管疾病的各类药物的药代动力学和药效动力学，但要深入理解心血管疾病发展的分子机制以及特定细胞类型所起的作用，仍需借助体外（in vitro）细胞培养模型。为此，研究人员已开发出多种来源于心血管系统的永生化细胞系；^2,3 然而，新近分离的原代细胞在生理和功能上更接近于活体组织和生物体。

心脏是一种多功能器官，包含心血管系统的所有主要细胞类型，而大鼠心脏至今仍是研究心血管生理学的常用模型。在过去几十年中，已有多种从心肌组织中分离特定细胞类型的方法被报道^4,5,6,7；然而，这些方法仅专注于分离某一种特定细胞类型，导致其他类型的细胞丢失，无法再用于细胞分析。本文描述了一种优化的实验方案，可同时高质量地分离心肌组织中的主要细胞类型，即心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。所有这些细胞类型均可用于不同的实....

方案

本研究遵循美国国立卫生研究院（NIH出版号85-23，1985年）发布的《实验动物护理与使用指南》，并经吉森大学当地伦理委员会批准。实验使用成年雄性Wistar大鼠，体重为200 - 250 g。

1. 高压灭菌

1. 在进行操作至少一天前，将所有用于分离操作的手术器械、移液器吸头和巴斯德吸管在121 °C下高压灭菌30分钟。

2. 培养基与溶液的制备

注意：步骤 2.1–2.4 中的溶液可在分离前一周内配制，并于 4 °C 保存，但步骤 2.5–2.8 中的溶液需在分离当天配制。表 1 中提供了缓冲液和培养基的完整配方。开始制备前，将所有培养基和溶液在水浴中预热至 37 °C。

1. 在室温（RT）下，将 表1 所列化学试剂溶解于 4.5 L 的 H₂O 中，配制 Powell 培养基。用 2.0 N NaOH 将 pH 值调节至 7.4，并加水至总体积为 5.0 L。经无菌过滤后，于 4 °C 保存。
2. 将 M199 粉末培养基溶解于 4.5 L 的 H₂O 中，配制肌酸、L-肉碱和牛磺酸（CCT）培养基。根据表格将 HEPES 粉末加入培养基中，搅拌 15 分钟。根据

结果

分离程序可获得70 - 80%存活率的杆状、横纹状心肌细胞（图2A和2C），可用于计划中的实验。在我们实验室中，心肌细胞常规用于钙离子（Ca²⁺）信号分析。图5A显示了负载Fura-AM（5 µM）的心肌细胞在缺血/再灌注条件下细胞内钙离子浓度[Ca²⁺]_i的振荡变化。图5B显示了加入ATP（100 µM）后内皮细胞和成纤维细胞中[Ca²⁺]_i的变化。不同心脏细胞类型中[Ca²⁺]_i的变化分析方法如前所述^6,11,12。

讨论

本文描述了一种可重复的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的分离与培养方案。该方案可同时高质量地分离心脏组织中的主要细胞类型， 即 心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，而非仅一种细胞类型。分离过程中的关键步骤是心脏组织的充分消化。若消化不完全，虽仍可获得大量心肌细胞，但其质量极差，多数细胞呈过度收缩和圆形状态。图2B）且对实验无价值。此外，内皮细胞和成纤维细胞的产量也会降低。此问题可通过控制消化时间来解决。在将心脏从灌流系统中取出前，可用镊子和指尖检查心脏的软化程度。若组织仍未明显变软，可再灌流5-10分钟。健康心肌细胞分离的第二个关键步骤是逐步恢复Ca²⁺ 在分离缓冲液中。快速恢复高浓度的 Ca²⁺ 培养基中的成分将导致心肌细胞呈圆形。用于配制缓冲液的水质是影响心肌细胞质量的另一个重要因素，因此建议使用高质量的水。

内皮细胞的纯度在很大程度上依赖于洗涤步骤。洗涤缓冲液中必须含有EDTA，以防止非内皮细胞非特异性结合到磁珠上。细胞悬液中若存在血细胞，将显著降低内皮细胞的得率；因此，在将心脏安装至灌.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗vWF	Santa Cruz Biotech	SC-14014
氯化钙	默克	102378
肉碱	Sigma-Aldrich	C0283
II 型胶原酶	沃辛顿	LS004176
肌酸	Sigma-Aldrich	C0780
D-葡萄糖	默克	108342
Dil-Ac-LDL	赛默飞世尔科技	L3484
EDTA 溶液 (0.2 M)	Biochrome AG	L2113
包埋剂溶液	Citiflour	AF1-25
内皮细胞培养基 MV2	PromoCell	C-22022
胎牛血清（FCS）	Biochrome AG	S0615
庆大霉素	Serva Chemicals	47991
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
异氟烷	Abbott	TU 061219
层粘连蛋白	罗氏/西格玛	11243217001
M199 培养基	赛默飞世尔科技	11150059
M199 培养基（粉末）	Biochrome AG	T061
硫酸镁	Sigma-Aldrich	63138
小鼠抗大鼠 CD31 抗体（TLD-3A12）	赛默飞世尔科技	MA1-81051
0.9% 氯化钠溶液，无菌	B. Braun	30820080
Pan小鼠IgG磁珠（Dynabeads）	赛默飞世尔科技	11041
4% 多聚甲醛（PFA）溶液	Santa Cruz Biotech	sc-281692
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15070-063
磷酸盐缓冲液 (PBS) 1×	PAN-Biotech	P04-36500
塑料耗材	Greiner Bio-One
氯化钾	默克	4933
磷酸二氢钾	默克	7873
氯化钠	默克	6404
氢氧化钠溶液（2 N）	默克	109136
无菌过滤系统	赛默飞世尔科技	5660020
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T8691
TO-PRO	赛默飞世尔科技	T3605
胰蛋白酶-EDTA溶液（10倍浓缩液）	Sigma-Aldrich	T4174
无菌水	B. Braun