从成年大鼠心脏中同时分离高质量心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞

摘要

已开发并描述了多种从大鼠心脏中分离不同心肌细胞类型的方案。本文介绍了一种优化的方案，可从单次制备中分离出高质量的主要心肌细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞），从而降低实验成本。

摘要

大鼠是心血管研究中重要的动物模型，大鼠心肌细胞通常用于体外分析心血管疾病进展的分子机制，例如心肌肥厚、纤维化和动脉粥样硬化。in vitro 尽管已有多种尝试以不同成功率建立心血管系统永生化细胞系来研究这些细胞机制，但原代细胞能为这类研究提供更自然且更接近体内（in vivo）的环境。因此，从事特定细胞类型研究的多个实验室已开发出分离特定类型大鼠心肌细胞的方案。然而，目前尚缺乏一种能够同时分离多种细胞类型的统一方案。本文介绍了一种优化的方案，可从单次制备中分离出高质量的主要心肌细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞），并可用于后续的细胞分析。该方法可最大限度地高效利用现有资源，节省时间并降低研究成本。

引言

长期以来，啮齿类动物模型被用作研究健康和疾病状态下心血管生理学的重要工具。¹ 尽管这些动物模型有助于我们在器官水平上理解疾病的病理生理过程，并分析用于治疗心血管疾病的各类药物的药代动力学和药效动力学，但要深入理解心血管疾病发展的分子机制以及特定细胞类型所起的作用，仍需借助体外（in vitro）细胞培养模型。为此，研究人员已开发出多种来源于心血管系统的永生化细胞系；^2,3 然而，新近分离的原代细胞在生理和功能上更接近于活体组织和生物体。

心脏是一种多功能器官，包含心血管系统的所有主要细胞类型，而大鼠心脏至今仍是研究心血管生理学的常用模型。在过去几十年中，已有多种从心肌组织中分离特定细胞类型的方法被报道^4,5,6,7；然而，这些方法仅专注于分离某一种特定细胞类型，导致其他类型的细胞丢失，无法再用于细胞分析。本文描述了一种优化的实验方案，可同时高质量地分离心肌组织中的主要细胞类型，即心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。所有这些细胞类型均可用于不同的实验设计^8,9,10，并可用于来自同一动物的细胞间相互作用研究。

方案

本研究遵循美国国立卫生研究院（NIH出版号85-23，1985年）发布的《实验动物护理与使用指南》，并经吉森大学当地伦理委员会批准。实验使用成年雄性Wistar大鼠，体重为200 - 250 g。

1. 高压灭菌

1. 在进行操作至少一天前，将所有用于分离操作的手术器械、移液器吸头和巴斯德吸管在121 °C下高压灭菌30分钟。

2. 培养基与溶液的制备

注意：步骤 2.1–2.4 中的溶液可在分离前一周内配制，并于 4 °C 保存，但步骤 2.5–2.8 中的溶液需在分离当天配制。表 1 中提供了缓冲液和培养基的完整配方。开始制备前，将所有培养基和溶液在水浴中预热至 37 °C。

1. 在室温（RT）下，将 表1 所列化学试剂溶解于 4.5 L 的 H₂O 中，配制 Powell 培养基。用 2.0 N NaOH 将 pH 值调节至 7.4，并加水至总体积为 5.0 L。经无菌过滤后，于 4 °C 保存。
2. 将 M199 粉末培养基溶解于 4.5 L 的 H₂O 中，配制肌酸、L-肉碱和牛磺酸（CCT）培养基。根据表格将 HEPES 粉末加入培养基中，搅拌 15 分钟。根据 表1 加入肌酸、肉碱、牛磺酸和 Ara-C。充分混匀，用 pH 计以 2.0 N NaOH 调节 pH 至 7.4，并加水至总体积为 5.0 L。经无菌过滤后，于 4 °C 保存。
3. 通过向 M199 培养基中添加 10% 胎牛血清（FCS）和 2% 青霉素/链霉素（Pen/Strep）来配制成纤维细胞培养基。DMEM 与 M199 同样适用，也可用于成纤维细胞培养。
4. 根据制造商说明书，将补充剂混合物的全部成分加入基础 MV2 培养基中，配制 MV2 内皮细胞培养基。取 5 mL 分装，置于水浴中预热至 37 °C。
5. 将 0.05 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 50 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中，并加入 0.5 mL 的 200 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，配制内皮细胞分离缓冲液。经无菌过滤后，于 4 °C 保存。
6. 将 0.1 mL 的 200 mM EDTA 溶液加入 9.9 mL 的 PBS 中，配制内皮细胞洗涤缓冲液，并于 4 °C 保存。
7. 将 27 mg 胶原酶溶解于 5 mL 的 Powell 培养基中，并加入 12.5 µL 的 100 mM CaCl₂ 溶液，配制胶原酶溶液。置于水浴中预热至 37 °C。
8. 分别向 6 mL、6 mL 和 12 mL 的 Powell 培养基中加入 12.5 µL、25 µL 和 120 µL 的 100 mM CaCl₂ 溶液，配制心肌细胞用的梯度 Ca²⁺ 恢复溶液 1、2 和 3。
9. 在细胞分离前一天，向每个 35 mm 细胞培养皿中加入含层粘连蛋白的 1 mL 预包被培养基，对心肌细胞用细胞培养皿进行预包被。于细胞培养箱中 37 °C 过夜孵育。

3. 磁珠的制备

1. 将0.5 mL内皮细胞分离缓冲液加入1.5 mL离心管中，置于冰上。
2. 加入5 µL（2 × 10⁶）泛小鼠IgG磁珠，充分混匀。
3. 将离心管放入磁力架中静置1分钟，磁珠会吸附在管壁靠近磁铁的一侧。用1 mL移液器小心吸去上清液。
4. 重复洗涤两次，最后将磁珠重悬于50 µL内皮细胞分离缓冲液中，4 °C保存备用。

4. 兰格多夫灌注系统的准备

1. 用 2 L 蒸馏水灌流，清洗兰格多夫系统。
2. 将 50 mL Powell 培养基在系统中循环 5 分钟，随后弃去培养基。
3. 加入 80 mL 新鲜 Powell 培养基。通过气体钢瓶连接的玻璃巴斯德吸管向培养基中持续通入"碳氧混合气"进行鼓泡，使培养基在系统中持续灌流。系统现已准备就绪，可用于心脏灌流（图 1A）。

5. 大鼠解剖

1. 将大鼠置于通风橱内的5 L干燥器中，通过通气孔加入1.5 mL 4–5%异氟烷，然后盖紧盖子。
   注意：将动物放置在干燥器内升高的带孔板上，以避免动物直接接触液态异氟烷。
2. 等待大鼠失去眼睑反射（通常约5分钟），然后将大鼠从干燥器中取出，通过颈椎脱位法实施安乐死。
3. 使用一把锋利的剪刀在腹部正中水平剪开皮肤及皮下肌肉，随后沿胸骨垂直剪开肌肉并打开胸腔。取出心脏连同肺脏，并立即将器官置于冰冻的0.9% NaCl溶液中。
4. 用剪刀分离并弃去肺脏。清除心脏上的结缔组织，在头臂干分支处向尾侧剪断主动脉。

6. 心脏灌注及胶原酶消化

1. 固定心脏 通过 使用两对细小的弯头镊子，在Langendorff灌流系统（第4节）中夹住主动脉。为确保心肌以逆向方式灌流，将灌流系统的插管末端置于第一主动脉分支与主动脉瓣之间。使用鳄嘴钳固定主动脉。
2. 用手术缝线固定心脏，并取下鳄嘴钳（图1B).
3. 打开套管阀门，使灌注液（35 mL）以滴状（60滴/分钟；5 mL/分钟）流经心脏，以冲洗残留血液。此阶段的流出液应弃去。
   注意：灌注过程的任何阶段都应避免产生气泡，否则将导致消化不完全，并使细胞分离实验失败。
4. 将悬挂的心脏置于收集漏斗（心室）中； 图1B）并启动蠕动泵，使灌注液从收集漏斗循环回储液槽（图1A).
5. 将胶原酶溶液（来自步骤 2.8）加入灌注液中。用循环的胶原酶溶液灌注心脏 30 分钟。
   注意：此步骤对优化细胞产量至关重要。灌注时间取决于胶原酶的活性，而胶原酶的活性可能因批次不同而有所差异。应测试3–4个不同批次的胶原酶，以确定活性最佳的批次；随后可大量采购该批次产品，确保至少一年内实验结果的可重复性。
6. 消化时间结束后，停止灌流，用剪刀将心脏从Langendorff系统中取出，并置于玻璃培养皿中。
7. 剪除并弃去两个心房，去除残留的脂肪组织。借助两把镊子小心剥离心包膜，以避免上皮细胞受到污染。
   注意：如有需要，可使用胶原酶进一步消化心包膜以获得纯化的心脏上皮细胞。本研究未提供详细方案，因该步骤超出本实验方案的范围。
8. 用剪刀将心脏从中间剪开，放入组织切碎机中。将心脏组织切碎2-3次，然后用12 mL Langendorff灌流所用的消化缓冲液重新悬浮切碎的组织。
   注意：不要过度切碎心脏组织，否则会导致心肌细胞死亡比例升高。
9. 将剪碎的组织转移至含有胶原酶的15 mL解离培养基中，在水浴中消化5-10分钟，期间使用5 mL一次性塑料移液管通过重悬方式偶尔混匀。
10. 消化结束后，将细胞悬液通过100 µm滤网过滤，弃去组织碎片和未消化的物质。
11. 在Langendorff灌流结束后，立即用至少1升蒸馏水冲洗灌流系统。通过循环100 mL的0.1 N NaOH溶液30分钟对系统进行灌流清洗，最后再用2–3升蒸馏水冲洗系统。用空气冲洗系统使其干燥，并用Parafilm封住开口处。

7. 大鼠心肌细胞分离

1. 心肌细胞的分离与培养
   1. 将细胞悬液在25 × g条件下离心1分钟（不使用刹车）以沉淀心肌细胞。也可在室温下静置10分钟，使心肌细胞自然沉降，无需离心。
   2. 使用一次性塑料移液管小心移除含有内皮细胞和成纤维细胞的上清液，并转移至新的50 mL离心管中。
   3. 将心肌细胞沉淀重悬于6 mL Ca²⁺ 溶液1（步骤2.9）中。让细胞在低Ca²⁺浓度环境中适应1分钟，然后再次以25 × g离心1分钟（不使用刹车）。
   4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于6 mL Ca²⁺ 溶液2（步骤2.9）中。让细胞适应中间浓度的Ca²⁺环境1分钟，最后向细胞中加入12 mL Ca²⁺ 溶液3（步骤2.9）。使用一次性塑料移液管轻轻混匀。
   5. 将细胞悬液以25 × g离心1分钟。
   6. 弃去上清液，将细胞重悬于20 mL预热的CCT培养基中。取1 mL细胞悬液加入20个预先包被层粘连蛋白的无菌35 mm细胞培养皿（步骤2.9）中，置于无CO₂的细胞培养箱中孵育2小时，使细胞贴壁。
      注：心肌细胞也可在含CO₂的环境中培养；但此时应使用含碳酸氢盐缓冲系统的培养基。
   7. 2小时后，更换为2 mL新鲜CCT培养基，以去除任何死细胞。
      注：细胞已准备好用于后续实验，可在常规细胞培养箱（无CO₂）中继续培养最多3天，活细胞数量无明显下降。典型的健康杆状心肌细胞如图2A所示。
2. 内皮细胞与成纤维细胞的分离
   1. 将含有内皮细胞和成纤维细胞的上清液（来自步骤7.1.2）以250 × g离心10分钟。
   2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL样品管中的1.5 mL内皮细胞分离缓冲液中。
   3. 向细胞悬液中加入3 µg（1:500）小鼠抗大鼠CD31抗体，在4 °C下以端对端旋转方式孵育30分钟。
      注：建议对抗体进行滴定以确定最佳稀释比例。此步骤应在4 °C下进行，因为在室温下内皮细胞会快速内化抗体，导致得率降低。
   4. 向细胞悬液中加入先前制备好的（第3节）泛抗小鼠IgG磁珠，在4 °C下以端对端旋转方式孵育20分钟。
      注：也可将小鼠抗大鼠CD31抗体预先偶联至磁珠，再加入细胞悬液。但此方法会延长磁珠与细胞悬液的孵育时间，可能导致非内皮细胞的非特异性结合增加，从而引起其他细胞类型的污染。
   5. 抗体孵育结束后，将含有细胞悬液的离心管置于磁力架上，静置2分钟，使与内皮细胞结合的磁珠吸附至管壁一侧。
   6. 使用1 mL移液器小心移除剩余的细胞悬液（主要含成纤维细胞），转移至含有10 mL成纤维细胞培养基（步骤2.3）的10 cm细胞培养皿中，放入含5% CO₂的常规细胞培养箱中孵育。后续操作见步骤7.3。
   7. 向含有磁珠和内皮细胞的离心管中加入1 mL洗涤缓冲液。
   8. 盖紧管盖，从磁力架上取下离心管，轻轻上下震荡4–5次，充分重悬磁珠。再次将离心管放回磁力架，静置1分钟使磁珠吸附至管壁，然后小心移除洗涤缓冲液。
   9. 重复步骤7–8共5–7次，以彻底去除可能污染的非内皮细胞。
   10. 将附着在磁珠上的内皮细胞重悬于1 mL MV2内皮细胞培养基中，接种至12孔板的一个孔中，并在含CO₂的细胞培养箱中孵育。
   11. 过夜孵育使细胞贴壁，次日更换培养基，之后每2–3天更换一次，直至细胞达到半融合状态（通常需5–7天）。
       注：分离后第3–4天典型的非融合内皮细胞及第7–10天融合的内皮细胞分别如图3A和图3B所示。随后可对细胞进行胰酶消化（第7.4节），并接种至T25细胞培养瓶中。
3. 成纤维细胞的洗涤与培养（接步骤7.2.6）
   1. 孵育1小时后，吸除培养基，加入适量预热的PBS洗涤贴壁的成纤维细胞。吸除PBS，重复洗涤2–3次，最后加入预热的新鲜成纤维细胞培养基。
   2. 次日再次使用预热的PBS洗涤贴壁细胞（方法同前），并加入预热的新鲜培养基。此后每2–3天更换一次培养基。分离后第2天典型的成纤维细胞表型如图4A所示。
      注：成纤维细胞通常在5–7天内达到半融合状态，此时可进行胰酶消化（第7.4节）并用于后续实验。采用本方法通常可获得95–99%纯度的成纤维细胞。分离后第7天典型的成纤维细胞表型如图4B所示。
4. 内皮细胞与成纤维细胞的胰酶消化
   1. 吸除细胞培养皿中的培养基，加入足量预热的PBS覆盖细胞。
   2. 吸除PBS，加入足量胰酶-EDTA溶液（分别为0.05%和0.02%）覆盖细胞，置于37 °C培养箱中孵育5分钟。
   3. 使用1 mL移液器反复吹打细胞使其重悬，随后加入10%胎牛血清（FCS）终止胰酶反应。
   4. 在室温下以250 × g离心10分钟，沉淀细胞。
   5. 将细胞重悬于适量预热的细胞培养基中。

8. 内皮细胞表征

注意：内皮细胞的纯度通过 Dil-Ac-LDL 摄取和血管性血友病因子（vWF）的免疫荧光染色来确定。细胞通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察（图 3C-3E）。

1. 内皮细胞对Dil-Ac-LDL的摄取
   1. 将内皮细胞进行胰蛋白酶消化（步骤7.4），并在12孔板中的玻璃盖玻片上接种，过夜培养（约10 × 10⁴ 个细胞/cm²）。
   2. 吸除培养基，用1 mL预热的HBSS冲洗细胞。
   3. 吸除HBSS，加入1 mL含10 µg/mL Dil-Ac-LDL的内皮细胞培养基，将细胞置于37 °C培养箱中孵育4小时。
   4. 吸除培养基，用预热的PBS冲洗细胞三次，每次1 mL，然后加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA；溶于PBS中）固定细胞。在37 °C条件下用PFA孵育20分钟。
      注意：PFA具有腐蚀性，操作时务必使用耐酸手套。
   5. 吸除PFA，用1 mL PBS在12孔板中冲洗盖玻片上的细胞两次，随后在室温下用核染色试剂TO-PRO（10 µM）孵育1小时。
      注意：若显微镜配备合适的滤光片，也可使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1 µg/mL）。此时孵育时间应缩短至10分钟。
   6. 用1 mL PBS冲洗盖玻片上的细胞，吸除PBS，重复该步骤三次。
   7. 将盖玻片从12孔板中取出，滴加一滴封片剂，将其封固于载玻片上。细胞即可在荧光/共聚焦显微镜下观察。Dil-Ac-LDL使用530–560 nm激发滤光片，TO-PRO使用640 nm，DAPI使用340–380 nm。
2. 血管性血友病因子（vWF）染色
   1. 按照步骤8.1.1所述方法培养内皮细胞。
   2. 吸除培养基，用1 mL预热的HBSS冲洗细胞，随后按照步骤8.1.4所述方法用4% PFA固定。
   3. 吸除PFA，用1 mL PBS在12孔板中冲洗盖玻片上的细胞两次，然后在室温下用含0.1% Triton X-100（溶于PBS）的溶液处理20分钟以通透细胞。
   4. 吸除通透液，加入封闭液（含5% BSA和5% FCS的PBS）孵育1小时。
   5. 在湿盒中，4 °C下用兔抗vWF抗体（1:100稀释）孵育细胞过夜。设置一个不加一抗的盖玻片作为阴性对照。
   6. 用1 mL PBS在12孔板中冲洗盖玻片上的细胞三次，然后在室温下加入驴抗兔Alexa Fluor-488抗体（1:500稀释）和核染色试剂TO-PRO（10 µM）共同孵育1小时。
   7. 用1 mL PBS冲洗盖玻片上的细胞，吸除PBS，重复该步骤三次。
   8. 将盖玻片从12孔板中取出，滴加一滴封片剂，将其封固于载玻片上。细胞即可在荧光/共聚焦显微镜下观察。vWF使用490 nm激发滤光片，核染色使用640 nm。

结果

分离程序可获得70 - 80%存活率的杆状、横纹清晰的心肌细胞（图2A和2C），可用于计划中的实验。在我们实验室中，心肌细胞常规用于钙离子（Ca²⁺）信号分析。图5A显示了负载Fura-AM（5 µM）的心肌细胞在缺血/再灌注条件下细胞内钙离子浓度[Ca²⁺]_i的振荡变化。图5B显示了加入ATP（100 µM）后内皮细胞和成纤维细胞中[Ca²⁺]_i的变化。不同心脏细胞类型中[Ca²⁺]_i的变化分析方法如前所述^6,11,12。

讨论

本文描述了一种可重复的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的分离与培养方案。该方案可同时高质量地分离心脏组织中的主要细胞类型， 即 心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，而非仅一种细胞类型。分离过程中的关键步骤是心脏组织的充分消化。若消化不完全，虽仍可获得大量心肌细胞，但其质量极差，多数细胞呈过度收缩和圆形状态。图2B）且对实验无价值。此外，内皮细胞和成纤维细胞的产量也会降低。此问题可通过控制消化时间来解决。在将心脏从灌流系统中取出前，可用镊子和指尖检查心脏的软化程度。若组织仍未明显变软，可再灌流5-10分钟。健康心肌细胞分离的第二个关键步骤是逐步恢复Ca²⁺ 在分离缓冲液中。快速恢复高浓度的 Ca²⁺ 培养基中的成分将导致心肌细胞呈圆形。用于配制缓冲液的水质是影响心肌细胞质量的另一个重要因素，因此建议使用高质量的水。

内皮细胞的纯度在很大程度上依赖于洗涤步骤。洗涤缓冲液中必须含有EDTA，以防止非内皮细胞非特异性结合到磁珠上。细胞悬液中若存在血细胞，将显著降低内皮细胞的得率；因此，在将心脏安装至灌...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗vWF	Santa Cruz Biotech	SC-14014
氯化钙	默克	102378
肉碱	Sigma-Aldrich	C0283
II 型胶原酶	沃辛顿	LS004176
肌酸	Sigma-Aldrich	C0780
D-葡萄糖	默克	108342
Dil-Ac-LDL	赛默飞世尔科技	L3484
EDTA 溶液 (0.2 M)	Biochrome AG	L2113
包埋剂溶液	Citiflour	AF1-25
内皮细胞培养基 MV2	PromoCell	C-22022
胎牛血清（FCS）	Biochrome AG	S0615
庆大霉素	Serva Chemicals	47991
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
异氟烷	Abbott	TU 061219
层粘连蛋白	罗氏/西格玛	11243217001
M199 培养基	赛默飞世尔科技	11150059
M199 培养基（粉末）	Biochrome AG	T061
硫酸镁	Sigma-Aldrich	63138
小鼠抗大鼠 CD31 抗体（TLD-3A12）	赛默飞世尔科技	MA1-81051
0.9% 氯化钠溶液，无菌	B. Braun	30820080
Pan小鼠IgG磁珠（Dynabeads）	赛默飞世尔科技	11041
4% 多聚甲醛（PFA）溶液	Santa Cruz Biotech	sc-281692
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15070-063
磷酸盐缓冲液 (PBS) 1×	PAN-Biotech	P04-36500
塑料耗材	Greiner Bio-One
氯化钾	默克	4933
磷酸二氢钾	默克	7873
氯化钠	默克	6404
氢氧化钠溶液（2 N）	默克	109136
无菌过滤系统	赛默飞世尔科技	5660020
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T8691
TO-PRO	赛默飞世尔科技	T3605
胰蛋白酶-EDTA溶液（10倍浓缩液）	Sigma-Aldrich	T4174
无菌水	B. Braun