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用于筛选蜜蜂驱避化学物质的视频追踪实验方案

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DOI：

10.3791/55603

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2017年6月12日

 , 
1Entomology, Virginia Tech, 2Entomology, University of Nebraska-Lincoln

本文内容

摘要

蜂群的丧失对作物授粉服务构成了挑战。当前的传粉昆虫保护措施需要采用一种替代方法，即利用驱避性化学物质来尽量减少蜜蜂与有害农药的接触。本文提供了用于筛选蜜蜂驱避剂的视觉追踪实验方案的详细方法。

摘要

欧洲蜜蜂Apis mellifera L.是一种具有重要经济和农业价值的传粉昆虫，每年产生数十亿美元的经济效益。自1947年以来，美国和许多欧洲国家的蜜蜂蜂群数量持续下降。多种因素导致了这一趋势，其中包括蜜蜂无意中接触农药的情况。因此，有必要开发新的方法和监管措施以减少这些传粉昆虫对农药的暴露。其中一种策略是使用驱避性化学物质，使蜜蜂远离刚施用过农药的作物。本文描述了一种用于评估蜜蜂对特定驱避性化学物质产生回避行为的实验方案。采集蜜蜂采集蜂后，在测试前15小时将其置于培养箱中禁食过夜。将单只蜜蜂分别放入培养皿中，培养皿中央放置蔗糖-琼脂糖立方体（对照处理）或含化合物的蔗糖-琼脂糖复合立方体（驱避处理）。培养皿作为行为观察 arena，置于光源箱内并用摄像机记录蜜蜂的运动行为，通过视频追踪软件进行分析。每种处理（8个对照组和8个驱避组）均持续观察10分钟，并使用新的蜜蜂重复每组实验。本文结果表明，当蔗糖-琼脂糖立方体中含有特定化合物时，蜜蜂会对其产生回避行为；而对不含添加化合物的蔗糖-琼脂糖立方体则表现出趋向性。

引言

欧洲蜜蜂， Apis mellifera L.是一种具有经济和农业重要性的昆虫，其提供的授粉服务全球估值超过2000亿美元1在美国和欧洲，蜜蜂蜂群数量一直在下降。美国已经失去了 ca1947年至2008年间，美国管理的蜜蜂种群减少了60%，而欧洲也已失去 ca1961年至2007年间下降了27%2,3可能导致蜂群损失数量增加的因素有很多，包括但不限于寄生虫侵扰、病原体感染、养蜂实践以及农药使用。2-4.

蜜蜂可能通过两种主要途径接触到农药。蜂群在蜂巢外接触农药的情况可能发生在觅食个体接触到为防治害虫而喷洒了化学药剂的作物时。蜂群在蜂巢内接触农药的情况则可能发生在养蜂人使用化学物质控制蜂巢内害虫和病原体（如螨虫、细菌和微孢子虫）时4。在美国和加拿大的24个蜂场采集的蜂蜡、花粉和蜜蜂样本中均已检测出农药残留5,6。农药对蜜蜂的影响包括急性毒性以及亚致死效应，例如麻痹、迷失方向、行为改变和健康状况下降1,7。由于现代农业需要使用农药以维持高作物产量，未来仍将继续依赖这些化学物质2。为了更好地保护蜜蜂免受农药暴露的危害，有必要开发新的规程和监管措施5。一种可能的保护方法是使用驱避剂，以减少蜜蜂在觅食过程中对农药的接触。

驱虫剂（IRs）通常被用作防止节肢动物病媒叮咬的个人防护措施8。其中使用最广泛且最成功的驱虫剂是60多年前开发的DEET8,9。DEET被认为是昆虫驱避效果测试的金标准，世界卫生组织和环境保护局均将其作为新型驱避剂筛选的阳性对照10。此外，研究发现DEET可使蜜蜂远离对其蜂群的威胁11。目前与个人用驱虫剂相关的特性包括：（1）对多种节肢动物具有持久的防护效果；（2）应用于皮肤或衣物时对使用者无刺激性；（3）无味或具有令人愉悦的气味；（4）对衣物无不良影响；（5）涂抹于皮肤时不产生油性外观，并能耐受使用者的出汗、水洗和擦拭；（6）对常用塑料无影响；（7）化学性质稳定且价格低廉，适合广泛使用12。用于蜜蜂的驱避剂仅需具备其中部分特性，例如持久效果、对施用者无刺激性、无味或气味宜人、化学性质稳定、价格低廉且适合大规模使用，以及对蜜蜂无毒。然而，在深入研究这些特性之前，首先需要建立一种高通量筛选化合物对蜜蜂驱避/威慑作用的方法。本文描述了一种实验室检测方案，用于筛选对蜜蜂具有威慑作用的化合物，这是评估驱避效果的重要步骤。本方案改编自先前一项研究中描述的视觉追踪方法，该方法用于评估杀虫剂对蜜蜂的亚致死效应13。但本方案的不同之处在于，其设计目的是测量候选驱避剂对蜜蜂远离杀虫剂处理作物行为的影响。目前尚无针对蜜蜂化学威慑剂实验室测试的推荐方案，因此本方案提供了一种简便的化合物筛选方法。

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方案

1. 准备蔗糖-琼脂糖凝胶块

  1. 称取8 g蔗糖，放入50 mL锥形瓶中。
  2. 将20 mL去离子水加入锥形瓶中，通过旋转摇动使糖溶解。
  3. 称取 170 mg 琼脂糖，加入糖溶液中。
  4. 将糖-琼脂糖溶液放入微波炉中，高火加热25秒。使琼脂糖完全溶解于糖溶液中。
  5. 让烧瓶和糖-琼脂糖溶液冷却。
    注意：烧瓶应冷却至手感不热，但切勿让溶液凝固。
    1. 为准备对照处理用的糖-琼脂糖凝胶块，将半冷却的糖-琼脂糖溶液倒入称量皿模具中。
      注意：称量舟模具的尺寸为 1.5 x 1.5 x 0.3 cm3.
    2. 为制备用于驱避处理的含糖琼脂糖复合物小块，将所需量的化合物加入半冷却的溶液中（例如，1% DEET 的蔗糖-琼脂糖溶液（v/v）。轻轻摇动烧瓶使化合物混匀，然后将溶液倒入称量皿模具中。
      注意：此时将制备八个对照模具和八个测试模具。对照模具中不含驱避剂。
  6. 将糖-琼脂糖凝胶块连同模具一起放入冰箱冷却5-10分钟。从称量舟模具中取出已凝固的糖-琼脂糖凝胶块，放入装有湿润滤纸的塑料容器中。
  7. 将容器放入冰箱中储存。蔗糖-琼脂糖凝胶块应在制备后7天内使用。

2. 编程视频追踪软件和实验设置

  1. 在屏幕左侧的实验资源管理器栏（位于跟踪软件中，参见材料表）的“实验设置”下，确保已选择正确的摄像头，并且视频录制画面以培养皿区域为中心。
    1. 如果需要调整视频录制画面的中心位置，请进入摄像头设置，在“AOI控制”下选择“中心X”和“中心Y”选项。
  2. 在“实验设置”下，将区域数量更改为16。在“跟踪特征”下选择“中心点检测”。
  3. 选择“区域设置”以配置检测所需的实验区域。
    1. 将16个培养皿以4×4阵列的形式放置在光源箱上，并置于摄像头正下方（图1）。
      注意：这些培养皿用于创建录制区域，内部为空。

在受控光照环境下用于荧光分析的培养皿光谱学装置。
图 1：培养皿在光源箱上的排列方式。 培养皿以 4 × 4 的阵列形式排列在光源箱顶部。该排列方式便于在视觉追踪实验中快速识别对照组和驱避剂处理组。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在 Arena 设置中，使用右侧工具面板上的“抓取背景”按钮，拍摄 16 个培养皿的图像。该图像将用作设置 Arena 的模板。
  2. 从 Arena 设置界面顶部的工具栏中选择“创建椭圆”，并创建一个与所抓取图像中某个培养皿直径相匹配的圆形。将 Arena 1 标记放置到该圆形内（图 2）。

使用多孔板追踪软件界面进行行为学研究的区域设置示意图。
图 2：视觉追踪软件区域设置界面截图。 圆形区域内对角条纹的显示可确认该圆形区域为检测区域。每个方格均标有区域1标记，用于定义每个培养皿的目标区域。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在右侧工具面板中选择“Arena 1”下方的“Zone Group 1”。从屏幕顶部的工具栏中选择“Create Rectangle”。使用此工具创建一个 30 × 30 像素的正方形，然后将其置于上一步所创建圆形的中心位置。从顶部工具栏中选择“Add Zone”，然后单击正方形的中心。移动 Zone 1 标记，使其位于正方形内。
    注意：所创建的正方形为取食区域，只要取食区域略大于蔗糖-琼脂糖块，其尺寸不一定必须完全与所列数值一致。

行为分析装置示意图，包含追踪区域、多个实验区域和数据采集系统。
图3：完成后的实验区域设置截图。 完成后的实验区域设置应与此示例相似。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在右侧工具面板中选择“Arena 1”，然后点击复制完整区域。在下拉菜单中选择“所有其他区域”，然后点击确定。将复制的区域设置移动到抓取图像中剩余的培养皿位置（图3）。
    1. 选择“Arena 1”，然后在顶部工具栏中选择“校准尺度”。在校准线上横跨 Arena 1 培养皿的直径绘制一条线。将直径测量值更改为 9 cm（所用培养皿的直径）。在右侧工具面板中选择“验证区域设置”。
  2. 在左侧控制栏中选择“检测设置”。
  3. 选择“Detection Settings 1”，然后在右侧工具箱的下拉菜单中选择“灰度缩放”。在检测设置中，将范围设定为 0 至 83（图4A）。
  4. 右键点击“Detection Settings”，新建一个设置并命名为“Detection Settings 2”。确保仍选择“灰度缩放”，但不要更改其他参数。
    注意：视频窗口中的各个区域上会出现较大的黄色圆圈。这有助于在录制前将培养皿调整至正确位置（图4B）。

色谱板分析、方法设置示意图，显示斑点检测和数据处理软件。
图4：检测设置1和2的截图。（A）显示在培养皿中对蜜蜂受试者进行灰度校正后，实验区域的外观。（B）显示实验区域的检测范围，以便在不同试验之间调整培养皿的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在实验资源管理器中选择“试验列表”，然后点击顶部工具栏中的“添加变量”。将用户自定义变量命名为“处理”。在用户定义的“处理”列中，选择“预定义值”下拉栏，并添加 C（对照）和 T（处理）作为预定义值。点击位于顶部工具栏的“添加试验”按钮。添加两个试验，然后为每个实验区域选择其为对照区域（C）或处理区域（T）（图5）。

实验试验列表界面；数据采集设置、受试者和实验区域设置、实验规划。
图5：试验列表截图。 正确标记实验区域非常重要，因为程序会依据此处的信息对数据进行分离，以便进行统计分析。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 在“实验资源管理器”面板中选择“数据配置文件”。在左侧栏中，选择位于“用户定义的自变量”标题下的“处理”选项。这将在流程图区域添加一个“筛选器”框。在弹出框中选择“C”，然后将新创建的筛选器放置在“开始”框与“结果1”框之间。流程图的箭头应相应调整，使其从开始框指向筛选器，再指向结果1。
    1. 重复步骤2.12，但此次选择“T”作为筛选器，然后在“公共元素”部分选择“结果”。将新创建的框移入流程图区域，并用箭头连接各框（图6）。

行为数据分析图；轨迹选择与降维；实验结果追踪。
图 6：数据配置文件截图。 此图展示了如何设置流程图，以在统计分析中实现适当的分离效果。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 保存文件。

3. 收集蜜蜂个体

  1. 穿上防护服，并选择一个蜂箱以采集蜜蜂（主要为采集蜂）。
  2. 移除蜂箱的外盖和内盖。使用蜂箱工具从顶部蜂箱中选取一个不含蜂卵和幼虫的巢框，轻轻将其从蜂箱中取出。
  3. 检查巢框上是否有蜂王。若蜂王不在其上，将工蜂轻轻扫入容器中以便运输。采集足够数量的个体，以确保每种待测化合物可进行两次完整的试验（每次试验包括对照组在内共使用16只个体）。
    注意：采集的个体应主要为采集蜂，但可能也会包含其他日龄的个体，例如哺育蜂。
  4. 记录采集蜜蜂的时间。将蜜蜂转移至一个尺寸为9 cm × 7 cm × 9 cm并带有通气孔的塑料盒中，随后放入温度为32 °C、相对湿度为70%的培养箱中。
  5. 对蜜蜂进行15小时的饥饿处理。
    注意：通常在测试前一晚采集蜜蜂，饥饿处理效果最佳。

4. 进行视觉追踪实验

  1. 启动视觉追踪程序，并打开为此实验创建的已保存实验文件。
  2. 选择“Detection Settings 2”。
  3. 将对照糖-琼脂块放入16个培养皿中8个的中央位置。对剩余8个培养皿中的糖-琼脂-化合物（驱避剂）块重复此过程。
  4. 使用镊子从塑料盒中取出一只蜜蜂，并将其放入其中一个对照培养皿中。
  5. 对剩余的15个培养皿重复步骤4.4。
  6. 将所有培养皿放置在光源箱上，并调整位置，使检测区域（在计算机屏幕上选择“Detection Settings 2”时显示）与每个培养皿的实验区域对齐。使用设定为红光光谱的LED灯阵列从下方照亮光源箱。用黑色塑料布包裹整个光源箱和相机，以消除外部光线并减少实验区域内的阴影。
  7. 设置好培养皿后，请确保选中“Detection Settings 1”。
    注意：此时视觉追踪软件应仅识别培养皿实验区域内的蜜蜂。
  8. 在实验浏览器中选择“Acquisition”，然后点击右侧“Acquisition Control”弹出框中的绿色“Start Trial”按钮，开始记录。
  9. 运行实验10分钟后，点击“Acquisition Control”弹出框中的红色“Stop Trial”按钮，停止记录。
  10. 将个体从培养皿中移出，并放入单独的容器中，以避免重复测试。
  11. 对同一化合物的第二次试验重复步骤4.4至4.10。
    注意：本方法可根据用户需要修改，以增加每种处理组中的蜜蜂数量。
  12. 在实验浏览器中选择“Statistics”，然后点击“calculate”进行计算。
  13. 将数据导出至数据管理软件，并使用单因素方差分析（Tukey's post-test）以及非配对t检验，在首选的统计分析软件中分析数据的显著性。

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结果

开发了一种视觉追踪方案，用于记录蜜蜂在目标区域停留的时间，该区域提供糖-琼脂糖立方体（对照处理）或含化合物的糖-琼脂糖立方体（驱避处理）。通过统计软件分析记录的时间，并以柱状图形式报告蜜蜂在目标区域停留的平均时间±标准误。本方案中使用DEET作为昆虫驱避剂测试的金标准阳性对照。提供糖-琼脂糖立方体（阴性对照）的蜜蜂在目标区域停留时间为343 ± 26秒，而提供糖-琼脂糖-DEET（驱避剂）的蜜蜂在目标区域停留时间为16 ± 4秒图7）。DEET 显著减少了蜜蜂在目标区域停留的时间 ca. 95%，相较于对照处理。

旨在确定对蜜蜂具有驱避作用的化合物随后通过本方案进行筛选。图8A显示了一种化合物，该化合物不会阻止蜜蜂接近目标区域的食物源。在对照组培养皿中，蜜蜂在目标区域停留的平均时间 约 352 ± 60 s，相较于 约 282 ± 43 秒，为含有化合物A浸润的蔗糖...

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讨论

本视觉追踪方案提供了一种相对快速简便的方法，用于筛选对蜜蜂具有驱避作用的化学物质。目前尚无针对蜜蜂化学驱避剂的推荐实验室测试方案。以往的半野外和全野外研究曾考察过蜜蜂驱避剂14,15；然而所述方案耗时较长、劳动强度大，且需要超出普通实验室条件的额外设施资源。本方案旨在作为对化合物进行半野外或全野外测试前，评估其对蜜蜂驱避效果的初步筛选手段。

在蜂巢外对个体蜜蜂进行化学驱避剂筛选时存在一些挑战。例如，蜜蜂是社会性昆虫，其在蜂巢内的行为依赖于信息素的作用14。本实验方案需要使用不再接收信息素信号的个体，并对其进行饥饿处理。饥饿处理旨在标准化个体蜜蜂的取食反应。饥饿时间是通过一项持续24小时的时间进程研究确定的。需要注意的是，饥饿可能对个体蜜蜂产生不利影响。例如，蜜蜂在从蜂巢采集后18小时会变得迟钝。基于这些观察结果，本实验选择在蜜蜂采集后饥饿15小时。

为避免筛选失败...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Thomas Kuhar 博士提供视觉追踪软件和设备。感谢 James Wilson 和 Scott O'Neal 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 锥形瓶Kimax26500-50用于制备糖/琼脂糖块
糖Kroger任何类似产品均可替代
去离子水实验室自备
琼脂糖Apex20-102用于制备糖/琼脂糖块
琼脂糖块模具（称量舟）任何能够制备出尺寸为 1.5 cm × 1.5 cm × 0.3 cm 的糖/琼脂糖块的模具均可替代
EthoVision XTNoldus视频追踪软件
633 nm 发光二极管（LED）CyronHTP904E将这些光源安装于自制光源箱中，从下方照射实验区域。  光源箱为一个简单的木质结构，顶部覆盖磨砂塑料或有机玻璃板，使光线向上均匀散射，避免反光。
笔记本电脑或台式电脑DellInspiron One 2305用于运行视频追踪软件。任何可运行该视觉追踪软件的计算机设备均可替代
养蜂防护服Dadant & Sons IncV0126任何具备防护头罩和外套的装备均可替代
蜂箱工具Dadant & Sons IncM00757用于开启蜜蜂蜂箱
蜜蜂容器任何适合容纳和储存蜜蜂的容器均可替代
细尖无损伤镊子Bioquip4748用于挑选单只蜜蜂
直径 9 cm 培养皿Fisher Scientific S01778作为实验区域，用于在视频追踪期间容纳单只蜜蜂
记录设备（摄像机）BasleracA-1300-60gm任何能够清晰记录实验对象并将文件传输至计算机的设备均可替代
GraphPad PrismGraphpad任何具备统计分析功能的软件均可替代

参考文献

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