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一种检测洗手去除新发传染病病原体效果的方法

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DOI：

10.3791/55604

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2017年6月7日

 , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, Tufts University

本文内容

摘要

洗手被广泛推荐用于预防传染病的传播。然而，目前关于哪种洗手方法在去除病原微生物方面最为有效，尚缺乏充分证据。我们建立了一种评估洗手方法去除微生物效果的技术。

摘要

洗手被广泛推荐用于预防传染病的传播。然而，目前关于各种洗手方法有效性的可比证据仍十分有限。此外，尚缺乏比较不同洗手方法以确定哪种方法在去除病原微生物方面最为有效的相关证据。在传染病暴发期间，亟需研究来为可采用的不同洗手策略提供科学依据。本文描述了一种实验室方法，用于评估洗手方法在去除手部微生物以及微生物在冲洗液中存留情况方面的效果。首先在志愿者手上接种测试微生物，然后使用感兴趣的每种洗手方法进行洗手。通常使用替代性微生物，以保护受试者免受疾病风险。洗手后残留在手上的微生物数量通过改良的“手套汁液”法进行检测：将手放入含有洗脱液的手套中并揉搓，使微生物悬浮，随后通过膜过滤法（用于细菌）或噬斑分析法（用于病毒或噬菌体）进行分析。洗手过程中产生的冲洗液被直接收集用于检测。洗手效果通过比较洗手后样本与未洗手样本的对数减少值（log reduction value）来量化。冲洗液中微生物的存留情况则通过比较不同洗手方法所得冲洗液样本与仅用水洗手后收集样本的结果进行量化。尽管该方法因需使用替代性微生物以保障人类志愿者的安全而存在局限性，但它捕捉到了一些在体外（in vitro）研究中难以模拟的洗手过程特征，填补了关于洗手效果以及病原微生物在冲洗液中存留特性方面的研究空白。

引言

洗手被广泛推荐用于预防疾病传播，尤其是通过粪口途径或空气传播的疾病，包括腹泻和呼吸道疾病1。令人意外的是，关于不同洗手方法（如使用肥皂和水洗手（HWWS）以及使用含酒精手部消毒剂（ABHS））在清除手部微生物方面的有效性的可比证据十分有限。初步研究发现，洗手过程中机械摩擦的作用可能比具体的洗手方法更能解释微生物的清除效果2,3。此外，目前尚缺乏对手部清洗方法之间相对有效性的系统比较证据。在一次非正式的文献回顾中，共识别出14项比较肥皂与手部消毒剂在清除微生物方面有效性的研究。其中五项研究发现ABHS更有效4,5,6,7,8，七项研究发现HWWS更有效9,10,11,12,13,14,15，另有两项研究未发现两种方法之间存在显著差异16,17。这些结果不一致，且未涉及洗手后冲洗水中微生物持续存在所带来的持续感染风险。总体而言，关于不同洗手方法在清除致病性病原体方面的相对有效性的证据仍然有限。

这些有限的证据导致人们对于在疫情暴发环境下哪种方法最合适存在不确定性。例如，在2013年至2016年西非埃博拉病毒病（EVD）疫情暴发期间，多个大型国际应急响应机构就手部卫生措施提出了相互矛盾的建议，涉及使用肥皂和水洗手（HWWS）、含酒精的手消毒剂（ABHS）或0.05%含氯溶液。无国界医生组织（Médecins Sans Frontières, MSF）建议使用0.05%含氯溶液进行手部清洗，而世界卫生组织（WHO）则建议使用肥皂和水洗手，或在手部无明显污物时使用含酒精的手消毒剂（ABHS）。WHO甚至指出，除非没有其他可用选项，否则不应使用含氯溶液，因为皮肤对氯存在消耗作用，导致其效果低于其他方法18,19,20,21,22。此外，含氯溶液通常由四种不同的氯化合物配制而成，包括高浓度次氯酸钙（HTH）、本地制备并稳定的次氯酸钠（NaOCl）以及二氯异氰尿酸钠（NaDCC）。世界卫生组织为应对西非埃博拉疫情而委托开展的一项系统综述最近仅发现四项研究评估了含氯溶液洗手的相对有效性23。这些研究结果也相互矛盾，且均未使用推荐的0.05%含氯浓度进行洗手，也未检测与埃博拉病毒相似的微生物10,24,25,26,27。因此，这些推荐意见缺乏证据支持，目前尚不清楚哪些建议最具有效性。

需要进一步的研究来比较不同的洗手方法，以防止传染性病原体的传播，因为洗手干预是预防疫病传播的重要工具。这些洗手建议必须以科学证据为基础。因此，已开发出一种使用替代物或非致病性病原体来测试洗手效果及冲洗水中残留情况的方法2,28,29。本文展示了使用Phi6作为埃博拉病毒的替代物，以及使用Escherichia coli作为常见指示菌的示例结果。本方案中介绍了洗手效果和冲洗水残留的测试方法。

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方案

伦理声明：本研究（以Phi6和E. coli作为埃博拉病毒的替代物）已获得塔夫茨医学中心和塔夫茨大学健康科学校区机构审查委员会批准（编号#12018）；哈佛大学已将审查权让渡给塔夫茨机构审查委员会。

注意：在开始本方案之前，必须完成两个步骤。首先，必须确定并选择一种生物安全等级1级（BSL-1）的替代物或无感染性的目标病原体版本，该版本需可用于人体受试者且使用安全30。由于本方案中需将生物体接种于人类志愿者的裸露手部，因此必须使用BSL-1级替代物或无感染性病原体。其次，在招募志愿者或启动实验之前，必须获得当地机构审查委员会（IRB）关于开展涉及人类受试者研究的批准。本方案的许多方面均可根据具体研究问题的需求进行调整。

1. 招募符合条件的人类受试者

  1. 通过在公共布告栏张贴纸质传单以及向可能对参与研究感兴趣的群体发送电子邮件来招募志愿者。这些公告应包含研究目的、联系信息和入选标准。
  2. 与志愿者会面以评估其是否符合入选条件。确认志愿者身体健康，年龄在18至65岁之间，目前未怀孕且未服用抗生素，并且无皮肤损伤/疾病、已知对手部清洁剂过敏，或与卫生相关的心理健康问题病史。
  3. 让符合条件的志愿者阅读知情同意书。回答他们提出的问题，并由志愿者和研究人员在两份同意书上签字。保留一份副本，并将另一份提供给志愿者。
  4. 进行基线调查，内容包括人口统计学信息、个人皮肤状况史以及近期手部清洁行为的信息。检查双手是否存在皮炎、皮肤损伤或其他基线皮肤异常31。
  5. 为每位志愿者安排针对每种目标微生物的两次测试会话（一次在有土壤负荷条件下测试，另一次在无土壤负荷条件下测试）。指导志愿者在测试前七天的洗脱期内避免使用抗菌产品，以避免个人使用产品带来的干扰。
    1. 向志愿者提供抗菌产品（洗发水、护发素和肥皂），以替代其日常使用的产品。提供重型乙烯基手套，并指导受试者在使用家用清洁剂等产品时佩戴。

2. 准备应急响应中常用的手部消毒溶液（肥皂、ABHS、0.05% HTH、NaDCC 和 NaOCl 溶液）

注意：氯溶液可在实验前最多 12 小时配制，但若储存时间过长会发生降解 >12 h

  1. 根据测试所针对的具体情境，选择并购买相应的肥皂。
    注意：在大多数情况下，针对发展中国家的传染病紧急情况，这将是一块肥皂。
  2. 根据测试所针对的具体情境，选择并购买相应的ABHS溶液。
    注意：所选用的酒精类手消毒剂中乙醇浓度应大于或等于70%，以确保消毒效果。
  3. 配制0.05%次氯酸钙（Ca(ClO)₂）溶液2) 溶液，通过加入颗粒状 Ca(ClO)2 将粉末加入超纯水中。根据待测受试者数量确定所需溶液的量。
    1. 使用以下公式，根据水中给定体积和有效氯的百分比，计算制备所需溶液量所需的粉末量：
      figure-protocol-1
      注意：Ca(ClO)2 粉末通常含有60-80%的有效氯。
  4. 将二氯异氰尿酸钠（NaDCC）颗粒粉末加入超纯水中，配制0.05%的二氯异氰尿酸钠（NaDCC）溶液。
    1. 使用以下公式，根据水中给定体积和有效氯的百分比，计算配制所需体积溶液所需的粉末量：
      figure-protocol-2
      注意：NaDCC 粉末通常含有约 50% 的有效氯。
  5. 将次氯酸钠储备液加入超纯水中，配制0.05%的稳定次氯酸钠溶液。
    1. 使用滴定法，按照制造商说明书确认次氯酸钠（NaOCl）储备液的浓度（通常为5-8%）例如， 碘量滴定法；建议使用的试剂盒详见材料列表。
    2. 根据测试方法的结果，使用以下公式计算需加入水中的溶液量：
      figure-protocol-3
  6. 使用电解氯发生器制备的次氯酸钠溶液、超纯水和分析纯氯化钠（NaCl），加入超纯水中配制0.05%的稳定次氯酸钠（NaOCl）溶液。
    1. 使用电氯发生器，按照制造商说明，用超纯水和 NaCl 配制 1% 的氯溶液。
    2. 采用滴定试验方法（例如， 碘量滴定法）以确认次氯酸钠（NaOCl）储备液的浓度32.
    3. 根据测试结果，使用以下公式计算需加入水中的溶液量：
      figure-protocol-4
  7. 使用滴定法确认每种氯洗手液的浓度（例如， 碘量滴定法），并通过添加水或含氯源粉末/溶液调整溶液浓度，使其与目标浓度（0.045–0.055%）的误差在10%以内。

3. 准备生物体和土壤载荷并混合以制备接种物

注意：在以下小节中，E. coli 和 Phi6 被用作描述方法的示例细菌和病毒生物体。

  1. 制备用于检测的生物体，其浓度应高于 10 x 108 细菌的CFU/mL大于10 × 107 病毒的 PFU/mL
    1. 准备 E. coli，划线接种一种非致病性菌株 E. coli 接种于Luria-Bertani（LB）琼脂平板，37℃培养 37 °C 24小时以获得单菌落。储存于 4 °C.
      注意：此步骤可在实验前数天完成。
      1. 实验开始前一天，用无菌接种环从平板上挑取单个菌落，接种于10 mL LB液体培养基中，37℃过夜培养 37 °C 振荡条件下。
      2. 实验当天早晨，取1 mL过夜培养物接种于20 mL新鲜LB液体培养基中，开始新的培养。于约2.5 h内孵育，使菌体密度达到10以上8 CFU/mL
      3. 使用分光光度计估算培养物的浓度。
        注意：使用先前通过标准曲线建立的转换因子 E. coli 所用菌株，确保浓度大于108 CFU/mL33如果细胞密度不够高，则将培养物放回培养箱继续培养，并再次检测直至达到所需状态。
    2. 使用膜过滤法确认浓度34.
      注意：用磷酸盐缓冲液（PBS）对培养物进行连续稀释，使过滤后的溶液在平板上产生的菌落数量可计数（具体数量取决于所使用的培养基）。
      1. 设置火焰，并连接带有无菌过滤漏斗和真空装置的过滤装置。用乙醇燃烧灭菌镊子。使用镊子放置一个0.45-µm 将滤膜置于过滤装置中，滤膜网格面朝上。用少量无菌 PBS 润湿滤膜。
      2. 将漏斗置于底座上，通过移液或直接倾倒的方式将待处理的样品溶液加至滤膜上。开启真空泵，直至全部样品滤过膜片。用无菌 PBS 冲洗漏斗内壁，再次开启真空泵。
        注意：样品应至少 100 µL 以及至多100 mL。如果样品体积小于10 mL，在过滤前向滤漏斗中加入约20 mL PBS，以确保样品均匀过滤。
      3. 移除漏斗，灼烧灭菌镊子，从底部取出滤膜。将滤膜轻轻放置于培养皿中的LB琼脂表面，网格面朝上，确保滤膜完全贴附于琼脂表面。倒置平板，在37°C下孵育24小时 37 °C.
      4. 24小时后，从培养箱中取出培养板并计数 E. coli 菌落。利用该数据以及已知的稀释倍数和溶液体积，计算过滤后溶液中CFU/mL的浓度。
    3. 扩增Phi6 Pseudomonas syringae 采用双层琼脂覆盖法的宿主35.
      1. 添加 100 µL Phi6 储存悬液的 100 µL 的 P. syringae 将过夜培养物直接接种至6 mL含0.3%琼脂的营养肉汤酵母（NBY）软琼脂中，倒入铺有1.5% NBY硬琼脂的平板，37℃过夜培养 26 °C准备足够的培养皿，以产生足量的接种物用于实验，每块培养皿预计可获得约 4 mL 病毒悬液。
      2. 第二天，在软琼脂层上方加入 5 mL PBS，室温静置 4 小时，用移液器收集并使用 0.45-µm 滤器。储存于 4 °C.
        注意：该溶液将用作病毒感染剂。
    4. 使用噬斑实验确认浓度大于107 PFU/mL35在PBS中对病毒悬液进行连续稀释，以便 100 µL 在平板上产生可计数的噬菌斑。
      1. 移液器 100 µL 适量稀释样品的 100 µL 将过夜培养的宿主菌液直接加入含有6 mL NBY软琼脂的试管中。将软琼脂倾注于NBY硬琼脂表面，于 26 °C 24 小时。
      2. 第二天，从培养箱中取出培养皿，计数每块培养皿中的噬斑数量。根据此数据、已知的稀释倍数以及溶液的体积，计算过滤后溶液中PFU/mL的浓度。
  2. 制备三相土壤载荷，旨在模拟人血清。
    1. 将7.80 mg/mL牛血清白蛋白、10.92 mg/mL胰蛋白胨和2.52 mg/mL牛黏蛋白混合，制备所需体积的土壤负载物。混合土壤负载物后，经0.22 μm滤膜过滤。µm 滤器除菌。于 4 °C 直至使用前。请勿进行加热灭菌，否则蛋白质会发生变性。
  3. 制备0.9% NaCl溶液，用于无土壤负载条件下接种物的混悬。
  4. 测试前立即配制接种物，其中包含68%的细菌或病毒悬液和32%的土壤负载物。例如，取步骤3.1.1.2或3.1.3.2中的1.02 mL细菌或病毒悬液，与0.48 mL土壤负载物（步骤3.2.1）或0.9% NaCl溶液（步骤3.3）混合。轻轻涡旋或摇动以混匀。
    注意：每种条件下每位志愿者将使用1.5 mL该接种物，因此需确保所制备的接种物总体积足以满足计划进行的检测次数。

4. 实验志愿者的准备工作

注意：确定当天要测试的生物体和土壤负载条件。同一名志愿者可用于测试多种条件，但每名志愿者在48小时内仅应接受一轮测试。

  1. 开始测试前，通过口头确认志愿者是否遵守了7天的抗菌药物洗脱期，并通过目视检查确认其皮肤上未出现任何破损或异常情况，以确保其仍符合入选条件。
  2. 使用随机数生成器，为每位志愿者分配在当天测试中使用右手或左手进行采样，并确定洗手条件的执行顺序。
    注意：例如，可将ABHS指定为第3项，即第三个执行。
  3. 在测试开始时仅进行一次“清洁洗”，以去除皮肤上的污垢和油脂，确保后续每次测试均在相同条件下进行。
    1. 进行清洁洗时，按照实验的每一步骤（见下文第5节），使用空白接种物（LB肉汤或PBS）进行操作，并在不洗手的情况下采集样本。

5. 实验步骤

  1. 为检测每位志愿者皮肤的pH值（以控制个体差异），将平头皮肤pH探针置于手掌面皮肤以及示指与中指之间的指蹼区域。确保电极与皮肤表面紧密贴合。记录pH读数。
  2. 对手部进行加标处理。
    1. 让志愿者将双手合拢成杯状，用移液器小心地向手部滴加1.5 mL接种液 750 µL 缓慢地涂抹到每只手掌中。
    2. 让志愿者轻轻搓揉双手，直至手部所有表面均涂满接种物，同时尽量减少对手部的摩擦。
    3. 让志愿者将双手保持静止并远离身体，持续30秒，以使接种物干燥。接种物可能无法完全干燥。
  3. 洗手。
    1. 在接下来的所有清洗步骤中，使用大号样品收集袋收集手部冲洗液。向袋中加入4.5 mL 12%硫代硫酸钠溶液，以中和接触的氯，并在2小时内完成处理。
      注意：所有样品（即使不含氯）均应添加硫代硫酸钠，以控制其对生物体可能产生的影响。
    2. 接种后（第5.2节），按指定顺序用下述方法洗手。
      1. 对照A组不进行洗手步骤，直接进入步骤5.5。
      2. 对照B组，仅使用室温（约 21 °C) 通过已知流速的漏斗。
        注意：此处使用了1.5 L/min的流速和500 mL的水。
      3. 用肥皂洗手时，先用10 mL超纯水润湿双手。让志愿者用肥皂搓出泡沫，然后双手相互揉搓20秒。通过漏斗以1.5 L/min的流速倾倒500 mL室温超纯水冲洗双手。
      4. 对于所有含氯溶液（例如， ABHS、HTH、NaDCC 和 NaOCl），以 1.5 L/m 的流速通过漏斗倒入 200 mL 含氯溶液，并让志愿者彻底揉搓双手。
  4. 采用改良的手套汁液法进行手部冲洗。
    1. 洗手后，立即将每位志愿者的手（即， 步骤4.2中选定用于检测的手（右手或左手）放入含有75 mL洗脱液的采样袋中（例如， PBS）至手腕处。将袋口在手腕处紧紧握住。
      注意：用于采样的洗脱液应含有足量的硫代硫酸钠，以中和手部清洗时可能残留的氯。磷酸盐缓冲液（PBS）是一种常用的洗脱液，适用于多种微生物。
    2. 让志愿者在溶液中轻轻揉搓双手30秒，注意清洁指缝及指甲下方。从袋外轻轻按摩手部30秒，确保整只手直至手腕均被洗脱液充分冲洗。
    3. 密封袋子，并在2小时内根据第6节所述的相应检测方法进行处理。
  5. 去污
    1. 在使用每种洗手方法重复该过程之前，让志愿者在水槽中用肥皂和温水彻底清洗双手。用70%乙醇喷洒志愿者的双手，直至手部两面均被覆盖，然后让其自然晾干。
    2. 对每种洗手条件，重复第5节中的所有步骤，仅使用在步骤4.2中随机选定的手图1).

6. 定量分析

  1. 进行适合所选生物体的实验分析例如， 膜过滤法检测细菌或噬菌斑法检测病毒，分别如上文第3.1.2节和第3.1.4节所述。
  2. 计数平板后，记录每次检测的估计CFU/mL或PFU/mL值，用于后续分析（3.1.2和3.1.4节）。

7. 分析

  1. 根据步骤6.2的结果，针对每种微生物、每种污染负荷状态、每位受试者及每种洗手方法，计算手部微生物的对数降低值。
    1. 评估洗手效果时，将每次洗手样本中的细菌/病毒浓度与对照组A（不洗手）进行比较；评估冲洗水中的残留情况时，将每次冲洗水样本与对照组B（仅用水冲洗）进行比较。使用以下标准公式：
      对数减少（洗手）) = figure-protocol-5 figure-protocol-6
      对数减少（冲洗水）) = figure-protocol-7figure-protocol-8
      注意：对数减少量也可表示为 log10（不洗手）- log10（含洗手）
  2. 采用单因素重复测量方差分析（ANOVA）评估不同洗手方法间计算所得对数降低值的显著性差异，并对具有显著性的模型进行事后Tukey's HSD检验，以两两比较各组间的显著性差异（p < 0.05）。 <0.05)36.
    1. 在进行方差分析（ANOVA）之前，需对每个数据集进行球形假设检验（sphericity）例如， 使用Bartlett检验）。应用校正（例如， 当检验结果显示球形假设被违反时，采用格林豪斯-盖塞校正）37.

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结果

此处，该方案（图1) 完成了18名志愿者的测试，每位志愿者均使用两种方法进行检测 E. coli 以及Phi6。在洗手效果方面，不同方法之间存在显著差异。 E. coli 有土载和无土载两种情况，以及带有土载的Phi6（图2 和 图3）。对于 E. coli 无土壤负载时，使用HTH、NaDCC和稳定化NaOCl洗手均比仅用水洗手产生显著更高的对数减少值（F(6,102) = 2.72，p = 0.034）。在有土壤负载的情况下，HTH产生的对数减少值显著高于其他处理组。 E. coli 优于仅用水、HWWS 和 ABHS（F(6,102) = 3.94，p <0.001）。对于未添加土壤负荷的Phi6，各方法间无显著差异（F(6,66) = 2.04，p = 0.073）。然而，对于添加土壤负荷的Phi6（F(6,...

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讨论

本文所述方法提供了一种在受控实验室条件下评估洗手效果的途径。该方法强调使用人类志愿者以及替代性的非致病性生物体。通过该方法，能够展示以下两方面的差异：1）不同洗手方法的效果；2）冲洗手部的水中生物体的存留情况。本方案的目的是提供一个通用框架，可根据需要进行调整，以适用于测试多种与传染病相关的替代生物体及洗手方法。

在使用该方法时，需注意两项关键的数据质量建议。首先，接种物的使用必须尽可能在各轮测试之间保持一致，并以尽量减少损失的方式进行操作，以确保手部接种足够量的接种物，从而获得具有统计学意义的结果。其次，务必完成“清洁洗涤”步骤，即在测试前不进行洗手的实验流程，因为先前的研究表明，首次洗手与后续洗手之间可能存在显著差异，但在完成清洁步骤后的后续洗手之间则无显著差异29。此外，该步骤可清除手部残留的污染，避免对实验结果造成干扰。

本方案的主要局限性在于可能给志愿者带来不适。在每轮持续约2小时的测试过程中，志愿者的手部会变冷。一些志愿者报告称，由于手部长时间处于潮湿状态，出现了轻微...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由美国国际开发署对外灾难援助办公室（AID-OFDA-A-15-00026）资助。Marlene Wolfe 获得美国国家科学基金会（资助号 0966093）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
香皂DoveWhite Beauty Bar 香皂
含酒精手部消毒剂Purell含 70% 乙醇的 Advanced Instant Hand Sanitizer
HTH 粉末Acros Organics300340010
NaDCC 粉末MedentechKlorsept 颗粒
NaOCl 溶液Acros Organics419550010
电解氯发生器AquaChlor
碘量滴定仪Hach1690001
牛血清白蛋白MP BiomedicalsNC0117242
胰蛋白胨FisherBP1421-100
牛黏蛋白EMD Milipore49-964-3500MG
0.22 µm 滤膜EMD MiliporeGVWP04700
NaClFisherBP358-1
皮肤 pH 探针Hanna InstrumentsH199181
大号 Whirlpak 样品袋NascoB01447WA
小号 Whirlpak 样品袋NascoB01323WA
漏斗瓶Thermo Scientific3120850001可在瓶盖上钻一个合适尺寸的孔，制成一个能以适当流速分配水的漏斗
乙醇ThermoScientific615090010与水混合配制 70% 乙醇
喷雾瓶QorpakPLC06934
E. coliATCC25922
LB 肉汤Fisher BioReagentsBP1426-2
LB 琼脂Fisher BioReagentsBP1425-500
无菌接种环Globe Scientific22-170-204
Phi6HER102
营养肉汤BD DifcoBD 247110
GeneQuant 100 分光光度计General Electric28-9182-04
硫代硫酸钠Fisher ChemicalS445-3
膜滤器（47 mm，0.45 µm）EMD MilliporeHAWP04700
m-ColiBlue24 肉汤培养基EMD MilliporeM00PMCB24
带垫片的培养皿（47 mm）Fisherbrand09-720-500
真空过滤装置Thermo Scientific/Nalgene09-752-5
过滤漏斗Thermo Scientific/Nalgene09-747
丁香假单胞菌HER1102
磷酸盐缓冲液Thermo Scientific10010031也可根据基本配方从原料化合物配制该溶液

参考文献

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