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从冻干浆果粉中提取和纯化多酚用于血管平滑肌细胞处理 体外

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DOI：

10.3791/55605

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2017年7月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dietetics and Nutrition, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Nutrition, Food and Exercise Sciences, Florida State University, 3Center for Advancing Exercise and Nutrition Research on Aging (CAENRA), Florida State University

本文内容

摘要

本研究详细阐述了一种从冷冻干燥的浆果粉末中制备富含多酚提取物的逐步方法。此外，还全面描述了如何在血管平滑肌细胞（VSMCs）培养中，于肽类激素血管紧张素II（Ang II）存在条件下使用这些富含多酚的提取物。

摘要

流行病学研究表明，在美国和欧洲，摄入较多类黄酮与心血管疾病（CVD）导致的死亡率降低相关。浆果在美国被广泛食用，且富含多酚类物质。研究表明，多酚可与多种分子靶点相互作用，并发挥多种有益的生物学功能，包括抗氧化、抗炎和心脏保护作用。从黑莓（BL）、覆盆子（RB）和黑覆盆子（BRB）中分离的多酚可减轻血管紧张素II（Ang II）诱导的氧化应激和细胞衰老。本研究详细描述了从冷冻干燥浆果中制备多酚提取物的实验方案。采用80%水-乙醇溶液并结合超声辅助提取法，从冷冻干燥的浆果粉末中提取多酚。粗提物进一步分别使用氯仿和乙酸乙酯进行纯化和分级分离。粗提物和纯化提取物对培养的血管平滑肌细胞（VSMCs）的作用均进行了检测。

引言

多酚是一类化学结构中至少含有一个酚环的化合物，在植物界中广泛存在1。人类在数千年间出于药用目的食用植物，却并未意识到这类化合物的存在2。许多水果和蔬菜含有共有的多酚类化合物，尽管其含量各不相同，包括黄酮类、芪类和酚酸类3。尽管多酚常与颜色鲜艳的水果和蔬菜相关联，但这并不完全准确。例如，叶黄素和黄嘌呤存在于颜色并不鲜艳的蔬菜中，如洋葱和大蒜，这些植物属于葱科，具有多种健康益处4。除了与多种健康益处相关5，多酚还能保护植物免受昆虫侵害和紫外线辐射2。多酚在人类饮食中普遍存在，被认为具有强效抗氧化作用，因其能够清除活性氧（ROS）6,7,8。它们还具有抗炎9、抗菌10、抗高血压11和抗癌12,13的特性。

流行病学研究表明，黄酮类化合物的摄入量与心血管疾病（CVD）发病率呈负相关16,17 死亡率14,15浆果在美国被广泛食用，富含多酚类物质，包括黄酮类化合物。例如，血脂异常患者每日饮用300 mL黑莓（BL）汁，连续八周后，其收缩压显著降低。18. Jeong 等19 有研究报道，每天摄入2.5克黑莓（BRB）提取物的前高血压男性和女性，其24小时及夜间血压低于摄入安慰剂者。树莓（RB）可降低自发性高血压大鼠的血压，同时增加超氧化物歧化酶（SOD）的表达水平20最近研究表明，BL、RB和BRB可降低血管紧张素II（Ang II）在血管平滑肌细胞（VSMCs）中诱导的活性氧（ROS）水平和细胞衰老。21此外，BL提取物中的花青素组分降低了脂多糖（LPS）刺激的J774细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，并抑制了核因子κB（NF-κB）和细胞外信号调节激酶（ERK）的活性。22. BRB提取物降低了NF-κB的活化及环氧合酶2（COX-2）的表达 体外 23改善了高脂饮食小鼠的血脂谱，并抑制了动脉粥样硬化病变的形成24花青素被认为是浆果中含量最丰富的黄酮类化合物，可通过降低脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的产生，调节炎症反应25 并减少血管平滑肌细胞的增殖和迁移26.

由于人们对多酚在人类健康与疾病中作用的研究兴趣日益增加，优化提取方法显得尤为重要。溶剂提取法因其成本低廉且易于重复，被广泛用于此目的。本研究采用乙醇进行溶剂提取，并结合超声辅助提取法，该方法改编自Kim和Lee的研究27采用氯仿和乙酸乙酯对粗提物（CE）进行纯化和分级分离，以获得经 Queires 改良方法得到的纯化提取物（PE）组分 等28此外，比较了BL粗提多酚与纯化多酚提取物在降低ERK1/2基础磷酸化水平方面的功效，并提供了纯化BL多酚提取物对Ang II诱导的VSMCs信号转导抑制作用的代表性结果。

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方案

1. 试剂的准备

  1. 通过将80 mL分子生物学级无水乙醇与20 mL细胞培养级无菌水混合，配制80%乙醇（100 mL）。
  2. 为配制多酚提取物（10 mg/mL），称取10 mg CE或PE，于细胞培养罩内加入1 mL普通杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），涡旋混匀。分装为每份200 µL，于-20 °C保存。
  3. 配制裂解缓冲液。
    1. 加入5 mL 1 M HEPES储备液（终浓度50 mM，pH 7.4）、1 mL 5 M NaCl储备液（终浓度50 mM）、1 mL 0.5 M EDTA储备液（终浓度5 mM）、2 mL 0.5 M NaF储备液（终浓度10 mM）、286 µL 700 mM Na3VO4 储备液（终浓度2 mM）、5 mL 200 mM Na4P2O7 储备液（终浓度10 mM）以及5 mL用水配制的20% Triton-X-100储备液（终浓度1%），加水至总体积为100 mL。4 °C保存。
    2. 每毫升裂解缓冲液中加入10 µL蛋白酶抑制剂混合物。在细胞准备裂解时新鲜添加。
  4. 配制Laemmli上样缓冲液（4x）。
    1. 加入31.25 mL 2 M Tris储备液（pH 6.8）、100 mL甘油、50 mL用水配制的20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液以及50 mL β-巯基乙醇，加水至总体积250 mL。4 °C保存。
  5. 为配制Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液，称取3 g Tris（终浓度25 mM）、0.18 g KCl（终浓度2.5 mM）和8.76 g NaCl（终浓度150 mM），调节pH至7.4，加水至1 L。室温保存。
  6. 为配制TBS-T，取997.5 mL TBS与2.5 mL用水配制的20% Triton-X-100溶液混合。室温保存。

2. 黑莓提取物的制备

  1. 从冷冻干燥的浆果粉末中制备粗提物。
    1. 称取10 g冷冻干燥的黑莓粉（或5 g新鲜粉末）。若使用冷冻果实，应在开始提取前将其切成非常小的碎片。
    2. 将果粉与100 mL 80%水合乙醇混合于1 L圆底锥形烧瓶中。
    3. 在25 °C条件下，使用超声波清洗仪以42 kHz、135 W功率对混合物超声处理20 min，过程中不得中断。在避光条件下持续通入氮气进行超声处理。若使用冷冻果实，则将孵育时间延长至4 h。
    4. 使用预冷的布氏漏斗在真空抽滤下通过#2滤纸过滤混合物。
      注：此步骤结束后，滤纸上会残留样品，称为滤饼。
    5. 用50 mL 100%乙醇冲洗滤饼。 保留滤液，并将滤饼加入含有100 mL 80%水合乙醇的1 L圆底烧瓶中。
    6. 对残渣重复提取过程（步骤2.1.2–2.1.4）。
    7. 将两次所得滤液合并，并加入额外50 mL 80%水合乙醇至圆底烧瓶中。
      注：最终体积约为300 mL。
    8. 在62 °C、50 rpm条件下使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。持续操作直至乙醇完全蒸发。
      注：该过程约需45 min。
    9. 将样品转移至50 mL离心管中。从管口上方通入氮气10 min以蒸发残留乙醇。
      注：此步骤用于确保乙醇完全蒸发。此时样品体积约为20 mL。
    10. 将样品在-80 °C下冷冻至少24 h。
      注：此步骤有助于提高后续冷冻干燥的效率。
    11. 在-50 °C下冷冻干燥样品约8 h。将样品在-20 °C下保存。
      注：冷冻干燥机在-50 °C下于腔室内产生强真空以干燥样品，同时可保留大多数化合物（如多酚类物质）。
  2. 从粗提物中制备纯化的多酚提取物。
    1. 称取冷冻干燥后的提取样品。
      注：此步骤中提取物体积约为10 mL。
    2. 向粗提物中加入两倍体积（约20 mL）的氯仿，并在搅拌台上搅拌5 min 。
    3. 将混合物倒入分液漏斗中，在室温下静置1 h，使粗提物分层以获得纯化组分。
      注：此步骤将形成两相体系。
    4. 弃去分液漏斗中的下层（氯仿相），收集上层水相至洁净烧杯中。
    5. 向水相中加入两倍体积的乙酸乙酯，并使用磁力搅拌子在室温下搅拌混合物5 min。
    6. 使用预冷的布氏漏斗在真空抽滤下通过#2滤纸过滤混合物。
    7. 收集滤液并转移至圆底烧瓶，用于后续旋转蒸发。
    8. 设置旋转蒸发仪为62 °C、50 rpm，蒸发乙酸乙酯约30 min。
    9. 在-50 °C下冷冻干燥样品约8 h。将样品转移至50 mL离心管中，并在-20 °C下保存。

3. 用浆果提取物处理VSMCs

  1. 血管平滑肌细胞（VSMCs）培养。
    1. 通过酶消化法从 Sprague-Dawley 大鼠胸主动脉中分离 VSMCs，方法如前所述29。VSMCs 的培养方法如文献所述29。
    2. 使用含 1 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺，配制 VSMCs 培养用完全培养基。将完全培养基储存于 4 °C。
  2. 用多酚提取物孵育 VSMCs。
    1. 传代 VSMCs 时，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。加入 4 mL PBS 和 2 mL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。将细胞置于含 CO2 的培养箱中，37 °C 孵育 5 min。
      1. 收集细胞，转移至 15 mL 离心管中，与 2 mL 完全培养基混合，1,100 × g 离心 5 min。弃去上清液，用 1 mL PBS 重悬细胞沉淀，用血细胞计数板计数细胞。
      2. 以每孔 50,000 个 VSMCs 接种于 6 孔板中，使用含 10% FBS 的完全培养基培养至细胞融合度达 90%（约 3 d）。将 VSMCs 置于 37 °C、5% CO2、湿度饱和的培养箱中维持培养。
    2. 使用含 1 g/L 葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 0.5% FBS 的 DMEM 培养基配制处理用培养基。处理用培养基储存于 4 °C。
      注：多酚提取物和 Ang II 直接加入该培养基中作用于细胞。
    3. 通过将 10 mg 提取物溶解于 1 mL 基础 DMEM 培养基中，配制 10 mg/mL 的多酚粗提物（CE）或纯化提取物（PE）储备液。将储备液分装为 200 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    4. 用含 0.5% FBS 的 2 mL 处理用培养基孵育 VSMCs，并加入 CE 或 PE 提取物，使其终浓度为 50–500 µg/mL。每隔 24 h 更换一次培养基，并补充新鲜的多酚提取物。处理持续 3 d。
    5. 若需使用 Ang II 或其他激素与生长因子进行处理，先用含 0.5% FBS 的处理用培养基对细胞进行至少 24 h 的饥饿处理，然后加入 Ang II（100 nM）。
      注：建议在加入 Ang II 前，使用含 0.5% FBS 的处理用培养基，在有或无 CE 和 PE 的条件下进行预孵育。
      1. 饥饿处理 24 h 后，加入 100 nM Ang II。每隔 24 h 更换一次处理用培养基，并补充新鲜的 CE、PE 或 Ang II，持续处理 3 d。
  3. 细胞样品制备。
    1. 用预冷的 PBS 洗涤处理后的细胞两次，然后在冰上用 200 µL 裂解缓冲液裂解细胞。
    2. 使用细胞刮刀收集细胞裂解物，转移至 1.5 mL 微量离心管中。将总细胞裂解物在冰上孵育 20 min，每 5 min 涡旋一次。
    3. 对细胞提取物进行超声处理，每次 10 s，功率 125 W，共 3 次，每次间隔 2 s。整个超声过程中保持样品处于冰上。
    4. 使用蛋白检测试剂在 595 nm 波长下测定蛋白浓度。
    5. 将样品于 -20 °C 保存，用于后续 Western blot 分析。
  4. Western blot。
    1. 取对照组（未处理）及多酚或 Ang II 处理组的蛋白样品，每组取等量蛋白（约 50 µg），用裂解缓冲液调整总体积至最多 50 µL。加入 16 µL 4× Laemmli 上样缓冲液，75 °C 加热 5 min。
    2. 将样品在 10% SDS-PAGE 凝胶中电泳分离，随后在半干转系统中以 10 V 电压转移 75 min 至 PVDF 膜，用于特异性抗体的 Western blot 分析。
    3. 用含 2% 脱脂奶粉的 TBS-T 缓冲液（TBS 含 0.05% Triton-X100）封闭膜 20 min。
    4. 用 TBS 洗涤膜至少三次（每次 5 min），去除脱脂奶粉，然后在室温孵育 1 h 或 4 °C 过夜，加入一抗。
    5. 用 TBS-T 洗涤膜三次，每次 10 min，然后加入 HRP 标记的二抗，孵育 45 min。
    6. 用 TBS-T 洗涤膜三次，每次 10 min，使用增强化学发光法（ECL）显影。

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结果

先前已证实，从 BL、RB 和 BRB 中分离得到的多酚提取物能够减轻血管平滑肌细胞（VSMCs）在血管紧张素 II（Ang II）作用下的衰老21。研究表明，这些纯化的多酚提取物通过降低 Akt、p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和 ERK1/2 的磷酸化水平来调节 Ang II 信号通路。BL 通过降低 NADPH 氧化酶（Nox）1 的表达来抑制细胞衰老，Nox1 是一种产生超氧阴离子的酶，可被 Ang II 显著上调。相比之下，RB 和 BRB 通过一种不依赖 Nox1 的机制抑制衰老，因为它们能够上调抗氧化酶 SOD1、SOD2 和谷胱甘肽过氧化物酶 1（GPx-1）的表达。BL 无法提高 SOD2 的表达水平，且这些提取物均未能缓解 Ang II 引起的过氧化氢酶（catalase）表达下调21。本研究重点关注 BL，旨在确定其对 SOD2 和过氧化氢酶表达无影响的现象是否可归因于纯化过程中多酚化合物的损失，或提取物中某种特定多酚化合物浓度不足。将 VSMCs ...

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讨论

浆果中分离出的多酚含有不同的组分。本文所述的乙醇提取方案有助于鉴定BL粗提和纯化多酚提取物中酚酸和黄酮类化合物的不同含量。表1）。CE 富含没食子酸、阿魏酸、4-O-咖啡酰奎宁酸和 5-O-咖啡酰奎宁酸。纯化过程未显著改变没食子酸和对香豆酸的含量，但提高了 3-O-咖啡酰奎宁酸的化学位移范围为170.5–235.3 ppm，槲皮素为24.5–95 ppm。相比之下，阿魏酸和芦丁在CE纯化过程中丢失。

用50 - 500 µg/mL的CE和PE处理VSMCs显示，这两种提取物均能有效降低ERK1/2的基础磷酸化水平。然而，PE在较低浓度下对该激酶活性的下调作用更强：PE的有效浓度为100 µg/mL，而CE则需要400 - 500 µg/mL。该结果可能反映了PE中3-O-咖啡酰奎宁酸或槲皮素的含量较高。需要在细胞培养体系中使用单一的酚类化合物，以鉴定出导致ERK1/2磷酸化下调的具体化合物。

由从BL、RB和BRB中分离纯化的多酚引起的Akt、ERK1/2和...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国心脏协会（14GRNT20180028）和佛罗里达州立大学研究与创造性活动委员会（COFRS）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
血管紧张素IISigma-Aldrich, Inc.A9525-10MGVSMC处理
β-肌动蛋白Sigma-Aldrich, Inc.A2228一抗（1:5000）
黑莓果实Mercer Foods冻干黑莓粉
过氧化氢酶 Calbiochem219010一抗（1:1000）
氯仿Biotech Grd, Inc.97064-678纯化多酚提取物的制备
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Mediatech, Inc.10-014-CVVSMC培养
乙醇（分子生物学级无水乙醇）Sigma-Aldrich, Inc.E7023-500ML多酚提取物的制备 
乙酸乙酯Sigma-Aldrich, Inc.439169纯化多酚提取物的制备
ERK1/2Cell Signaling Technology, Inc.9102S一抗（1:500）
EDTA，500 mM，pH 8.0Teknova, Inc.E0306裂解缓冲液
冷冻干燥机LabconcoVirTis Benchtop K多酚提取物的制备
胎牛血清（FBS）Seradigm1400-500细胞培养
HEPESSigma-Aldrich, Inc.H3375裂解缓冲液 
NaClEMD Millipore, Inc.7760裂解缓冲液
NaFJ.T.Baker, Inc.3688-01 裂解缓冲液
Na3VO4Sigma-Aldrich, Inc.450243裂解缓冲液
Na4P2O7，十水合物Sigma-Aldrich, Inc.S-9515裂解缓冲液
磷酸化ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc.9101S一抗（1:1000）
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-Aldrich, Inc.P8340-5ml裂解缓冲液
蛋白测定染料试剂Bio-Rad Laboratories, Inc.500-0006蛋白质浓度测定
PVDF转印膜Thermo Scientific, Inc.88518Western blot
旋转蒸发仪Buchi LabortechnikRotavapor
R3000		多酚提取物的制备
无菌水Mediatech, Inc.25-055-CV多酚提取物的制备
超声破碎仪QSonica, LLCQ125细胞提取物的制备
SOD2Enzo Life Sciences, Inc.ADI-SOD-110-F一抗（1:1000）
Triton-X-100Sigma-Aldrich, Inc.X100Western blot
Whatman #2 滤纸GE Healthcare, Inc.28317-241多酚提取物的制备

参考文献

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