本研究详细阐述了一种从冷冻干燥的浆果粉末中制备富含多酚提取物的逐步方法。此外，还全面描述了如何在血管平滑肌细胞（VSMCs）培养中，于肽类激素血管紧张素II（Ang II）存在条件下使用这些富含多酚的提取物。
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本文内容
摘要
摘要
流行病学研究表明，在美国和欧洲，摄入较多类黄酮与心血管疾病（CVD）导致的死亡率降低相关。浆果在美国被广泛食用，且富含多酚类物质。研究表明，多酚可与多种分子靶点相互作用，并发挥多种有益的生物学功能，包括抗氧化、抗炎和心脏保护作用。从黑莓（BL）、覆盆子（RB）和黑覆盆子（BRB）中分离的多酚可减轻血管紧张素II（Ang II）诱导的氧化应激和细胞衰老。本研究详细描述了从冷冻干燥浆果中制备多酚提取物的实验方案。采用80%水-乙醇溶液并结合超声辅助提取法，从冷冻干燥的浆果粉末中提取多酚。粗提物进一步分别使用氯仿和乙酸乙酯进行纯化和分级分离。粗提物和纯化提取物对培养的血管平滑肌细胞（VSMCs）的作用均进行了检测。
引言
多酚是一类化学结构中至少含有一个酚环的化合物，在植物界中广泛存在1。人类在数千年间出于药用目的食用植物，却并未意识到这类化合物的存在2。许多水果和蔬菜含有共有的多酚类化合物，尽管其含量各不相同，包括黄酮类、芪类和酚酸类3。尽管多酚常与颜色鲜艳的水果和蔬菜相关联，但这并不完全准确。例如，叶黄素和黄嘌呤存在于颜色并不鲜艳的蔬菜中，如洋葱和大蒜，这些植物属于葱科，具有多种健康益处4。除了与多种健康益处相关5，多酚还能保护植物免受昆虫侵害和紫外线辐射2。多酚在人类饮食中普遍存在，被认为具有强效抗氧化作用，因其能够清除活性氧（ROS）6,7,8。它们还具有抗炎9、抗菌10、抗高血压11和抗癌12,13的特性。
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方案
1. 试剂的准备
- 通过将80 mL分子生物学级无水乙醇与20 mL细胞培养级无菌水混合，配制80%乙醇（100 mL）。
- 为配制多酚提取物（10 mg/mL），称取10 mg CE或PE，于细胞培养罩内加入1 mL普通杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），涡旋混匀。分装为每份200 µL，于-20 °C保存。
- 配制裂解缓冲液。
- 加入5 mL 1 M HEPES储备液（终浓度50 mM，pH 7.4）、1 mL 5 M NaCl储备液（终浓度50 mM）、1 mL 0.5 M EDTA储备液（终浓度5 mM）、2 mL 0.5 M NaF储备液（终浓度10 mM）、286 µL 700 mM Na3VO4 储备液（终浓度2 mM）、5 mL 200 mM Na4P2O7 储备液（终浓度10 mM）以及5 mL用水配制的20% Triton-X-100储备液（终浓度1%），加水至总体积为100 mL。4 °C保存。
- 每毫升裂解缓冲液中加入10 µL蛋白酶抑制剂混合物。在细胞准备裂解时新鲜添加。
- 配制Laemmli上样缓冲液（4x）。
- 加入31.25 mL 2 M Tris储备液（pH 6.8）、100 mL甘油、50 mL用水配制的20%十二烷基硫酸钠....
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结果
先前已证实，从 BL、RB 和 BRB 中分离得到的多酚提取物能够减轻血管平滑肌细胞（VSMCs）在血管紧张素 II（Ang II）作用下的衰老21。研究表明，这些纯化的多酚提取物通过降低 Akt、p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和 ERK1/2 的磷酸化水平来调节 Ang II 信号通路。BL 通过降低 NADPH 氧化酶（Nox）1 的表达来抑制细胞衰老，Nox1 是一种产生超氧阴离子的酶，可被 Ang II 显著上调。相比之下，RB 和 BRB 通过一种不依赖 Nox1 的机制抑制衰老，因为它们能够上调抗氧化酶 SOD1、SOD2 和谷胱甘肽过氧化物酶 1（GPx-1）的表达。BL 无法提高 SOD2 的表达水平，且这些提取物均未能缓解 Ang II 引起的过氧化氢酶（catalase）表达下调21。本研究重点关注 BL，旨在确定其对 SOD2 和过氧化氢酶表达无影响的现象是否可归因于纯化过程中多酚化合物的损失，或提取物中某种特定多酚化合物浓度不足。将 VSMCs .......
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讨论
浆果中分离出的多酚含有不同的组分。本文所述的乙醇提取方案有助于鉴定BL粗提和纯化多酚提取物中酚酸和黄酮类化合物的不同含量。表1）。CE 富含没食子酸、阿魏酸、4-O-咖啡酰奎宁酸和 5-O-咖啡酰奎宁酸。纯化过程未显著改变没食子酸和对香豆酸的含量，但提高了 3-O-咖啡酰奎宁酸的化学位移范围为170.5–235.3 ppm，槲皮素为24.5–95 ppm。相比之下，阿魏酸和芦丁在CE纯化过程中丢失。
用50 - 500 µg/mL的CE和PE处理VSMCs显示，这两种提取物均能有效降低ERK1/2的基础磷酸化水平。然而，PE在较低浓度下对该激酶活性的下调作用更强：PE的有效浓度为100 µg/mL，而CE则需要400 - 500 µg/mL。该结果可能反映了PE中3-O-咖啡酰奎宁酸或槲皮素的含量较高。需要在细胞培养体系中使用单一的酚类化合物，以鉴定出导致ERK1/2磷酸化下调的具体化合物。
由从BL、RB和BRB中分离纯化的多酚引起的Akt、ERK1/2和.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国心脏协会（14GRNT20180028）和佛罗里达州立大学研究与创造性活动委员会（COFRS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 血管紧张素II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | VSMC处理 |
| β-肌动蛋白 | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | 一抗（1:5000） |
| 黑莓果实 | Mercer Foods | 冻干黑莓粉 | |
| 过氧化氢酶 | Calbiochem | 219010 | 一抗（1:1000） |
| 氯仿 | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | 纯化多酚提取物的制备 |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | VSMC培养 |
| 乙醇（分子生物学级无水乙醇） | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | 多酚提取物的制备 |
| 乙酸乙酯 | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | 纯化多酚提取物的制备 |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | 一抗（1:500） |
| EDTA，500 mM，pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | 裂解缓冲液 |
| 冷冻干燥机 | Labconco | VirTis Benchtop K | 多酚提取物的制备 |
| 胎牛血清（FBS） | Seradigm | 1400-500 | 细胞培养 |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | 裂解缓冲液 |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | 裂解缓冲液 |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | 裂解缓冲液 |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | 裂解缓冲液 |
| Na4P2O7，十水合物 | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | 裂解缓冲液 |
| 磷酸化ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | 一抗（1:1000） |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | 裂解缓冲液 |
| 蛋白测定染料试剂 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | 蛋白质浓度测定 |
| PVDF转印膜 | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blot |
| 旋转蒸发仪 | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 | 多酚提取物的制备 |
| 无菌水 | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | 多酚提取物的制备 |
| 超声破碎仪 | QSonica, LLC | Q125 | 细胞提取物的制备 |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | 一抗（1:1000） |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blot |
| Whatman #2 滤纸 | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | 多酚提取物的制备 |
参考文献
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev.
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