解剖学启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建，调制和建模

Summary

该手稿详细描述了微组织工程神经网络的制造:三维微米大小的构建体，包括跨越聚集的神经元群体的长比例的轴突区域，其包裹在管状水凝胶中。这些生活支架可以作为功能性继电器来重建或调节神经回路，或者作为模拟灰白色神经解剖学的生物学检验床。

Abstract

由于抑制环境和神经发生能力有限，功能恢复很少发生在中枢神经系统（CNS）中的损伤或疾病诱导的变性之后。我们正在开发一种同时解决损伤的CNS内的神经元和轴突途径损失的策略。该手稿提出了微组织工程神经网络（微型TENN）的制造方案，由神经元组成的可植入构造物和跨越细胞外基质（ECM）腔的对准轴突束，其预先形成的直径为数百微米的水凝胶圆柱体可以延伸厘米长度。神经元聚集体被划分为三维包围的极端，并被轴突突起所跨越。微型TENN作为CNS重建的策略是独一无二的，模拟了脑连接体细胞结构的方面，并为潜在的网络替代提供了手段。神奈轮状聚集体可能与宿主组织突触形成新的功能性继电器，以恢复和/或调节丢失或损坏的电路。这些构建体也可以作为能够利用细胞迁移和轴索寻路的发育机制的再生"活支架"，基于再生状态提供协同的结构和可溶性线索。将微型TENN通过将液体水凝胶倒入含有纵向中心针的圆柱形模具中来制造。一旦水凝胶凝胶化，就去除针头，留下中空微柱。将ECM溶液加入腔内以提供适合于神经元粘附和轴突生长的环境。机械地聚集离解的神经元用于在微柱的一端或两端精确播种。该方法可靠地产生具有长突出的轴突束的自足的微型构造，其可以重现脑神经解剖学的特征。突触动物非标记和遗传编码的钙指标表明微TENN具有广泛的突触分布和内在的电活动。因此，微型TENN代表脑途径靶向神经外科重建的有希望的策略，也可作为生物学模型应用于体外研究神经生物学现象 。

Introduction

中枢神经系统疾病和疾病（CNS）的常见特征，如创伤性脑损伤（TBI），脊髓损伤（SCI），中风，阿尔茨海默病和帕金森病，是轴突途径和神经元细胞的断开损失^{1，2，3，4，5，6} 。例如，当缺血性中风未经治疗时，估计轴突以每分钟轴突7英里的速度丢失⁵ 。在TBI的情况下，每年约有170万人在美国经历，轴突变性可能在创伤后几年可能继续发生，因为初始损伤导致长期的神经变性状态⁴ 。加剧这些有害影响，中枢神经系统受到严重限制城市再生1，7，8，9。受伤后，出现抑制环境，其特征在于缺乏远距离靶点的指导性指导，阻止神经突生长的髓磷脂相关抑制剂的存在，以及由反应性星形胶质细胞形成胶质瘢痕8,10,11,12。胶质瘢痕可作为再生的生化和物理障碍，硫酸软骨素蛋白多糖等分子阻碍轴突长出8,11。此外，即使在成人CNS中发现了神经干细胞，新神经元的产生也是有限的，因为在嗅球中仅发现了神经发生的一致证据，海马脊髓区域，脑室周围区域和脊髓中央管道^13,14 。这些障碍阻碍了损伤或疾病后遗失的神经元和白质结构的功能恢复，导致这些病症经常改变生命和延长的效果。

尽管成人中枢神经系统缺乏再生能力，但是已经证明，如果向宿主神经元15,16,17,18提供足够的环境线索，则轴突再生是可能的。研究人员尝试提供和操纵生长因子（ ....

Protocol

涉及动物的所有手续均由宾夕法尼亚大学的机构动物保护和使用委员会和Michael J. Crescenz退伍军人事务医疗中心批准，并遵守NIH公共卫生服务政策中关于人道关怀和使用实验室的指导原则动物（2015）。

1.开发琼脂糖水凝胶（微TENNs的无细胞成分）

1. 琼脂糖溶液制备
   1. 在生物安全柜内，通过将20 mL Dulbecco磷酸缓冲盐水（DPBS）转移到两个10 cm培养皿中的每一个上，为微柱制备储存器。用热珠灭菌器灭菌精镊子和微型柱。
   2. 称量3 g琼脂糖，并将其转移到生物安全柜内的无菌烧杯中。加入100mL DPBS，终浓度为3％重量/体积（w / v）。包括一个干净的磁棒，并用铝制盖住烧杯数字箔。
   3. 用热板/搅拌器，在100℃下加热烧杯，以120-200rpm搅拌，使琼脂糖完全溶解（溶液将从浑浊转为澄清）。保持加热和搅拌，以防止凝胶化，并根据需要改变加热温度，以避免燃烧琼脂糖。
      注意:激光切割装置和毛细管的制造分别如下面的1.2和1.3小节。在完成两个小节中描述的步骤之后，继续到1.4节。对于两种微柱制造方法，快速加入液体琼脂糖，琼脂糖在冷却时迅速固化。当使用高压灭菌器在以下任一步骤中进行灭菌时，请使用标准条件应用于玻璃器皿。
2. 使用激光切割装置的微柱制备
   注意:激光切割....

Results

使用相差显微镜监测微TENNs，以评估其细胞结构和轴突生长（ 图4 ）。在单向，2mm长的微TENNs中，神经元聚集体被限制在微柱的一端并且通过内核投射一束轴突。轴突将体外的整个长度跨越5天（DIV）（ 图4A ）。双向2 mm长的微型TENN中的初始轴突生长率较高，因为轴突通过3 DIV跨越整个微柱（ 图4B ）。通过5 DIV，双向微TENNs特征是密集的轴突区域，连接保持在微柱极端的聚集体。在5-mm微TENNs中也观察到这种细胞结构，轴突通过5 DIV跨越微柱（ 图4C ）。如在所有情况下观察到的，腔内的ECM和几何恢复琼脂糖提供的表达提供了形成轴突区域所需的方向性，其结构模拟天然神经解剖学的特征。

在该方案中应用免疫细胞化学技术，并采用共焦图像来验证微TENN结构的组分。用Hoechst（蓝.......

Discussion

CNS损伤和疾病通常导致构成脑连接的长途轴突途径的丧失或功能障碍，伴有或不伴有神经元变性。由于中枢神经系统有限的能力来促进神经发生和再生，所以复合化。尽管追求修复策略，如生长因子，细胞和生物材料传递作为个体或组合方法，这些技术不能同时解释神经元细胞的退化和轴突连接的损失14,22。技术上的这些差距限制了以受控和持续的方式修复，改变和探测神经网络的能力。因此，微型TENN技术被开发以解决对神经修复策略的需要，与现有方法相比，促进神经元替换和长轴突连接的重建。话筒ro-TENNs是可植入的生物支架，具有预先形成的细胞结构，其接近专门设计用于宿主神经回路的靶向重建，替换和修饰的大脑连接体的系统级构建块。这些支架由微小圆柱形琼脂糖水凝胶的含ECM腔内的长轴突束连接的离散群体组成。这些构建体可能能够用作突触中继来代替丢失的途径并动态调节本机电路。另外，在孤立的轴索变性（源神经元保持完整）的情况下，微TENN可能作为轴突再生的指导，基于轴突促进轴突再生的机制。该手稿提出了制造协议，以可靠地创建具有受控几何，表型和功能特征的微型TENN。相差显微镜，免疫细胞化学Stry和共聚焦显微镜证实，用方案产生的微TENNs显示所需的细胞结构并表达突触前蛋白突.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
激光切割机	Universal Laser Systems	PLS4.75	用于制造激光切割微通道模具。
激光切割微柱制造装置	定制	--------------	有兴趣请联系我们的研究小组。手稿中提供的尺寸和蓝图。
螺纹	直径为 3.05 毫米的螺钉----------------------------#4-40 螺纹直径为 3.05 毫米
的螺母	--------------	--------------	#4-40
灸针（180 µm 直径）	Lhasa Medical	sj.16X40	直径可根据微柱管腔所需的尺寸而变化。
培养皿	Fisher	08772B
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Invitrogen	14200075
聚苯乙烯一次性血清移液管	Fisher	13-678-11D
琼脂糖	Sigma	A9539-50G
毛细管（398 µm 直径）	Fisher	21170D	直径可根据微柱壳所需的尺寸而变化。
热板	Fisher	SP88857200
磁棒	Fisher	1451352
微量移液器	Sigma	Z683884-1EA
25 毫米规格针	Fisher	14-826-49
微手术刀	Roboz 手术	RS-6270
剪刀	精细科学工具	14081-09
镊子	World Precision Instruments	501985
热珠消毒器	Sigma	Z378550-1EA
立体镜	Nikon	SMZ800N	用于所有解剖步骤和微 TENN 制造。
大鼠尾巴 I 型胶原蛋白	康宁	354236	维持在 4 ºC 并仅在需要时删除。 使用时用冰块保持其温度。
微量离心管	Fisher	02-681-256
小鼠层粘连蛋白	Corning	354232	维持在 4 ºC 并仅在需要时删除。 使用时用冰块保持其温度。
Neurobasal 培养基	Invitrogen	21103049	用于培养产前和胚胎神经元细胞的基础培养基。存储在 4ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
氢氧化钠 （NaOH）	Fisher	SS2661
盐酸 （HCl）	Fisher	SA48-1
石蕊试纸	Fisher	09-876-18
汉克平衡盐溶液 （HBSS）	Invitrogen	14170112	储存在 4 ºC。
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056	储存在 -20 ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
牛胰腺脱氧核糖核酸酶 （DNase） I	Sigma	10104159001	Store 在 -20 ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
B-27 添加剂	Invitrogen	12587010	添加剂添加到 Neurobasal 培养基中，用于海马和皮质神经元的培养。在 -20 º 存储C 和 37 的暖色 ºC 使用前。
L-谷氨酰胺	Invitrogen	35050061	Store 在 -20 ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
Sprague Dawley 胚胎第 18 天大鼠	Charles River	菌株 001
巴斯德移液器	Fisher	22-042816
15 mL 离心管	EMESCO	1194-352099
涡旋	Fisher	02-215-414
离心机	Fisher	05-413-115
血细胞计数器	Fisher	02-671-6
Objet30 3D 打印机	Stratasys	--------------	用于制造金字塔形微孔模具。
3D 打印金字塔形井模	定制	--------------	有兴趣请联系我们的研究小组。手稿中提供的尺寸和蓝图。
聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 和固化剂	Fisher	NC9285739	弹性体和固化剂成套提供。在化学通风橱内使用。
漏斗	Fisher	10-348C
1 ml 移液器灯泡	Sigma	Z509035
微型刮刀	Fisher	S50821
12 孔培养板	EMESCO	1194-353043
烘箱	Fisher	11-475-154
培养箱	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn 载体核心	36373	储存在 -80ºC。市售的腺相关病毒 （AAV），带有 GCaMP6f 钙指示剂。
甲醛 40%	Fisher	F77P-4	甲醛是一种已知具有致癌性的有毒化合物，必须丢弃在单独的容器中。
Triton X-100	Sigma	T8787	用于透化细胞膜的非离子表面活性剂。
马血清	Gibco	16050-122
小鼠抗 Tuj-1/β-III 微管蛋白一抗	Sigma	T8578-200UL	储存在 -20ºC。
兔抗突触蛋白 1 一抗	触系统	106-001	储存在 -20ºC。
驴抗小鼠 568 二抗	Invitrogen	A10037	储存在 4ºC。
驴抗兔 488 二抗	Invitrogen	A21206	储存在 4ºC。
Hoechst 33342， 三盐酸盐	Invitrogen	H3570	储存在 4>C。Hoechst 是一种已知的诱变剂，应作为致癌物处理。因此，它必须丢弃在单独的容器中。
A1RSI 激光扫描共聚焦显微镜	尼康	--------------	用于免疫标记构建体的共聚焦重建。
Eclipse Ti-S 显微镜	尼康	--------------	用于拍摄相差图像。 使用与 Nikon Elements Basic Research 软件 （4.10.01） 接口的 QiClick 相机进行数字图像采集。
高速荧光显微镜	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti 显微镜与 ANDOR Neo/Zyla 相机配对，用于钙成像。
NIS Elements AR 4.50.00 软件	尼康仪器	--------------	用于从高速荧光显微镜拍摄的记录中识别钙瞬变。