受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

摘要

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。

摘要

由于中枢神经系统（CNS）内存在抑制性环境以及神经发生能力有限，损伤或疾病导致的神经退行性病变后极少出现功能恢复 。我们正在开发 一种可同时应对 受损中枢神经系统中神经元和轴突通路丧失的策略 。本文介绍了微组织工程神经网络（micro-TENNs）的制备方案，该结构为可植入式构建体，由神经元及沿预成型水凝胶圆柱体腔内细胞外基质（ECM）排列延伸的轴突束组成，其直径为数百微米，长度可达厘米级。神经元聚集体被限定在三维包封结构的两端，并由轴突投射连接。micro-TENNs作为一种中枢神经系统重建策略具有独特优势，可模拟脑连接组的部分细胞架构特征，并有望实现神经网络的替代。神经元聚集体可与宿主组织形成突触连接，建立新的功能性中继通路，以恢复和/或调节缺失或受损的神经回路。这些构建体还可作为促再生的“活体支架"，利用发育过程中的细胞迁移和轴突导向机制，根据再生状态提供协同性的结构和可溶性信号线索。micro-TENNs的制备方法是将液态水凝胶倒入含有纵向居中针头的圆柱形模具中。待水凝胶凝固后，移除针头，形成中空的微柱结构。向腔内加入ECM溶液，以提供适合神经元黏附和轴突延伸的环境。将解离的神经元进行机械聚合并精确接种至微柱的一端或两端。该方法可稳定地生成具有长距离轴突投射的自包含微型构建体，可重现脑神经解剖学的某些特征。突触免疫标记和基因编码的钙指示剂结果显示，micro-TENNs具有广泛的突触分布和内在电活动。因此，micro-TENNs为靶向性神经外科脑通路重建提供了一种有前景的策略，也可作为高保真生物模型用于体外研究神经生物学现象in vitro。

引言

中枢神经系统（CNS）疾病和障碍（如创伤性脑损伤（TBI）、脊髓损伤（SCI）、脑卒中、阿尔茨海默病和帕金森病）的一个共同特征是轴突通路的中断以及神经元细胞的丢失^1,2,3,4,5,6。例如，当缺血性脑卒中未得到及时治疗时，据估计每分钟会损失长达7英里的轴突⁵。以TBI为例，仅在美国每年就有约170万人经历此类损伤，而轴突的退行性变化可能在创伤发生数年后仍持续进行，因为初始损伤会引发长期的神经退行性状态⁴。更为严重的是，中枢神经系统自我再生的能力极为有限^1,7,8,9。损伤后，会形成一种抑制性微环境，其特征包括缺乏对远端靶标的定向引导、存在阻碍神经突生长的髓鞘相关抑制因子，以及反应性星形胶质细....

方案

所有涉及动物的实验程序均经宾夕法尼亚大学和迈克尔·J·克雷斯琴兹退伍军人事务医疗中心的机构动物护理与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物人道护理与使用公共卫生服务政策》（2015年）中规定的要求。

1. 琼脂糖水凝胶（micro-TENNs的无细胞组分）的制备

1. 琼脂糖溶液的制备
   1. 在生物安全柜内，将20 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）转移至两个10 cm培养皿中，以制备微柱的储液槽。使用热珠灭菌器对精细镊子和微型手术刀进行灭菌。
   2. 称取3 g琼脂糖，转移至生物安全柜内的无菌烧杯中。加入100 mL DPBS，得到终浓度为3%（重量/体积，w/v）的溶液。放入一根洁净的磁力搅拌子，并用铝箔覆盖烧杯。
   3. 使用加热板/搅拌器将烧杯加热至100 °C，并以120–200 rpm的速度搅拌，直至琼脂糖完全溶解（溶液将由浑浊变为透明）。之后继续加热和搅拌，以防止凝胶化，并根据需要调节加热温度，避免琼脂糖烧焦。
      注意：激光切割装置和毛细管的制备方法分别在下文的1.2和1.3小节中介绍。完成任一方法的步骤后，请继续进行1.4小节。两种微柱制备方法均需迅速加入液态琼脂糖，因为琼脂糖在冷却时会快速凝固。在后续任何步骤中若需使用高压灭菌器进行灭菌，请采用适用于玻璃器皿的标准条件。

结果

微型组织工程神经网络（Micro-TENNs）采用相差显微镜进行监测，以评估其细胞架构及轴突生长情况（图4）。在单向延伸的2 mm长微神经组织（micro-TENNs）中，神经元聚集体被限制于微柱的一端，并通过内部核心向外延伸出一束轴突。在5天内，轴突贯穿了整个微柱长度 体外 （体外培养天数）（图4A）。在双向性2 mm长的微-TENNs中，轴突初始生长速度更快，轴突在3 DIV时已跨越整个微柱图4B）。到第5天体外培养时，双向微神经组织工程神经元网络呈现出致密的轴突束，连接位于微柱两端的神经元聚集体。在5毫米长的微神经组织工程神经元网络中也观察到类似的细胞架构，轴突在第5天体外培养时已跨越整个微柱。图4C如在所有情况下所观察到的，管腔中的细胞外基质以及琼脂糖提供的几何限制共同提供了形成轴突束所需的方向性，这些轴突束在结构上模拟了天然神经解剖学的特征。

讨论

中枢神经系统（CNS）损伤和疾病通常导致构成脑连接组的长距离轴突通路丧失或功能障碍，无论是否伴随神经元退变。由于中枢神经系统促进神经发生和再生的能力有限，这一问题进一步加剧。尽管已有多种修复策略被探索，例如单独或联合应用生长因子、细胞移植和生物材料递送，但这些技术均未能同时解决神经元细胞退化和轴突连接丢失的问题^14,22。现有技术的这些不足限制了对神经网络进行可控且持久的修复、调控和探测能力。因此，微组织工程神经网络（micro-TENN）技术应运而生，旨在提供一种不同于现有方法的神经修复策略，能够同时实现神经元替代和长距离轴突连接的重建。micro-TENNs 是可植入的活体支架，具有预先形成的细胞架构，接近脑连接组在系统层面的基本结构单元，专门设计 用于靶向重建、替换和调控宿主神经环路。这些支架由微型圆柱形琼脂糖水凝胶的腔体构成，腔内含有细胞外基质（ECM），其内部包含一个或多个神经元群体，并通过长轴突束相互连接。这类结构可能具备作为突触中继的功能，以替代丢失的神经通路，并动态调节内源性神经回路。此外，在局.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
激光切割机	Universal Laser Systems	PLS4.75	用于制作激光切割微通道模具。
激光切割微柱制备装置	定制	--------------	如有兴趣，请联系我们的研究团队。尺寸和蓝图已在论文中提供。
螺丝	--------------	--------------	#4-40，螺纹直径为3.05 mm
螺母	--------------	--------------	#4-40，螺纹直径为3.05 mm
针灸针（180 µm 直径）	Lhasa Medical	sj.16X40	可根据所需微柱管腔尺寸调整直径。
培养皿	Fisher	08772B
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Invitrogen	14200075
一次性聚苯乙烯血清移液管	Fisher	13-678-11D
琼脂糖	Sigma	A9539-50G
毛细管（398 µm 直径）	Fisher	21170D	可根据所需微柱外壳尺寸调整直径。
加热板	Fisher	SP88857200
磁力搅拌子	Fisher	1451352
微量移液器	Sigma	Z683884-1EA
25 mm 规格针头	Fisher	14-826-49
显微手术刀	Roboz Surgical	RS-6270
剪刀	Fine Science Tools	14081-09
镊子	World Precision Instruments	501985
热珠灭菌器	Sigma	Z378550-1EA
体视显微镜	Nikon	SMZ800N	用于所有解剖步骤及微-TENN 的制备。
大鼠尾部 I 型胶原蛋白	Corning	354236	保存于 4 ºC，仅在需要时取出。  使用时用冰保持其温度。
微量离心管	Fisher	02-681-256
小鼠层粘连蛋白	Corning	354232	保存于 4 ºC，仅在需要时取出。  使用时用冰保持其温度。
神经基础培养基	Invitrogen	21103049	用于胎前和胚胎神经元细胞培养的基础培养基。储存于 4ºC，使用前在 37 ºC 预热。
氢氧化钠（NaOH）	Fisher	SS2661
盐酸（HCl）	Fisher	SA48-1
石蕊试纸	Fisher	09-876-18
汉克平衡盐溶液（HBSS）	Invitrogen	14170112	储存于 4 ºC。
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）I	Sigma	10104159001	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
B-27 补充剂	Invitrogen	12587010	添加至神经基础培养基中，用于海马和皮层神经元的培养。储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
L-谷氨酰胺	Invitrogen	35050061	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
Sprague Dawley 胚胎第18天大鼠	Charles River	Strain 001
巴斯德移液管	Fisher	22-042816
15 mL 离心管	EMESCO	1194-352099
涡旋振荡器	Fisher	02-215-414
离心机	Fisher	05-413-115
血细胞计数板	Fisher	02-671-6
Objet30 3D 打印机	Stratasys	--------------	用于制作锥形微孔模具。
3D 打印锥形孔模具	定制	--------------	如有兴趣，请联系我们的研究团队。尺寸和蓝图已在论文中提供。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）及固化剂	Fisher	NC9285739	以试剂盒形式提供，包含弹性体和固化剂。需在化学通风橱中使用。
漏斗	Fisher	10-348C
1 ml 移液球	Sigma	Z509035
微型刮勺	Fisher	S50821
12 孔培养板	EMESCO	1194-353043
烘箱	Fisher	11-475-154
培养箱	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	储存于 -80ºC。为商业可得的携带 GCaMP6f 钙指示剂的腺相关病毒（AAV）。
40% 甲醛	Fisher	F77P-4	甲醛是一种已知的致癌性有毒化合物，必须单独容器收集处理。
吐温 X-100	Sigma	T8787	用于细胞膜通透的非离子型表面活性剂。
马血清	Gibco	16050-122
小鼠抗 Tuj-1/β-III 微管蛋白一抗	Sigma	T8578-200UL	储存于 -20ºC。
兔抗突触素 1 一抗	Synaptic Systems	106-001	储存于 -20ºC。
驴抗小鼠 568 二抗	Invitrogen	A10037	储存于 4ºC。
驴抗兔 488 二抗	Invitrogen	A21206	储存于 4ºC。
Hoechst 33342 三盐酸盐	Invitrogen	H3570	储存于 4ºC。  Hoechst 是一种已知的致突变剂，应视为致癌物处理。  因此，必须单独容器收集处理。
A1RSI 激光扫描共聚焦显微镜	Nikon	--------------	用于获取免疫标记结构的共聚焦重建图像。
Eclipse Ti-S 显微镜	Nikon	--------------	用于获取相差图像。  配备 QiClick 相机，并通过 Nikon Elements Basic Research 软件（4.10.01）进行数字图像采集。
高速荧光显微镜	Nikon	--------------	配备 ANDOR Neo/Zyla 相机的 Nikon Eclipse Ti 显微镜，用于钙成像。
NIS Elements AR 4.50.00 软件	Nikon Instruments	--------------	用于从高速荧光显微镜记录的数据中识别钙瞬变。