一种多孔冻存管可消除肌肉组织直接浸入液氮时产生的冷冻伪影

摘要

本方案描述了一种将肌肉组织直接浸入液氮中进行冷冻的方法。本方案还介绍了一种新型冻存管，可在液氮接触样品组织表面时避免氮气的"隔热效应"。

摘要

骨骼肌生理学研究面临的技术挑战之一是如何恰当地处理样本，以获得细胞质区室清晰可见的切片。另一个难题是肌纤维与周围组织紧密结合。由于组织固定和石蜡包埋过程会导致肌纤维收缩，因此冷冻是用于切片前硬化肌肉组织的理想方法。然而，在制备冰冻切片时，由于肌肉组织含水量高，常会出现冰晶形成的问题。本文所述方案首先介绍了一种简单且高效的方法，通过将肌肉组织浸入液氮中实现适当冷冻。单独使用液氮存在的问题是，会在组织附近形成一层氮气屏障，起到隔热作用，从而抑制组织的冷却。为避免这种“气化层”效应，设计了一种新型冷冻管，通过在管壁上总共打14个进液孔，以加快液体在组织表面的流动速度。根据气泡动力学原理，液体流速越高，产生的气泡越小，形成气体屏障的可能性也越低。当液氮通过进液孔流入冷冻管时，组织周围的流速足以消除气体屏障。与使用预冷异戊烷冷冻肌肉组织的方法相比，本方案更简便、高效，可用于高通量地冷冻肌肉组织。此外，对于无法获取异戊烷（室温下极易燃）的机构而言，该方法尤为适用。

引言

从营养和加工角度来看，骨骼肌是产肉动物最有价值的组成部分。在肉类工业中，有两个尤为关键的方面：肌肉生长效率和最终肉品的质量。作为肌肉的主要组成部分，肌纤维与动物的生长性能和鲜肉品质直接相关¹。例如，肌纤维总数（TNF）和肌纤维横截面积（CSAF）主要决定了肌肉质量与肉品品质；此外，肌纤维类型组成（FTC）对鲜肉品质具有显著影响²。因此，调控动物肌纤维特性是提高养殖场核心盈利能力和竞争力的有效手段¹。

迄今为止，已发现多种内在和外在因素可调控肌纤维特性¹。这种调控可通过选择具有特定基因的动物来实现，例如牛的Myostatin基因³、羊的Callipyge基因⁴以及猪的RYR1和IGF2基因⁵。此外，饮食调控及特定激素处理在肌纤维特性形成中也发挥重要作用⁶。因此，结合遗传与营养因素的方法可能有助于提高瘦肉含量和肉类品质。然而，由于肌纤维结构的解析仍具挑战性，肉类工业中关于肌纤维的研究仍较为有限。

肌纤维特性可通过组织化学方法鉴定，例如肌球蛋白三磷酸腺苷酶（ATPase）检测法。该方法基于以下原理：位于肌纤维薄切片（6–8 µm）中的酶可与特定化学试剂发生反应。然而，无论部位如何（即背部、腹部或后肢），猪、兔、小鼠和人类肌肉的含水量均超过75%⁷。肌肉中如此高的水分含量在冰冻切片制备过程中常导致一个普遍问题——冷冻假象，如先前所述^8,9。根据我们的经验，在屠宰场生产线上几乎不可能适当地冷冻肌肉组织。

本文介绍了一种在本实验室用于高通量冷冻肌肉组织以进行冰冻切片的简单且高效的方法。该方法的亮点在于使用一种专为在液氮中快速冷冻肌肉组织而设计的新型冻存管。当前的工作流程可同时实现组织的冷冻与处理，从而获得高质量的肌肉冰冻切片，其细胞质区室清晰可见，肌纤维与周围组织紧密贴合。此外，由于液氮不与组织发生混合，该方案可广泛适用于多种组织学分析方法。

方案

本方法已在本实验室建立并验证，可用于收获和保存超过1,000份肌肉样本以进行组织学染色。所有涉及动物护理和使用的操作均遵循中国农业部制定的指导方针。

1. 样本采集设备

1. 在每个冻存管上标记样品编号。
   注意：冻存管专为冷冻新鲜组织样本以进行冷冻切片而设计（图1A）。这些冻存管由聚丙烯材料在模具工厂中制成（图1C）。
2. 准备以下设备：液氮（置于合适的液氮罐中）、护目镜或面罩、冷冻手套、10 cm 镊子、25 cm 镊钳、泡沫塑料保温箱（内径：20 cm 长 × 12 cm 宽 × 13.5 cm 高；外径：24 cm 长 × 16 cm 宽 × 15 cm 高）、塑料薄膜（2.5 cm 长 × 0.8 cm 宽 × 0.1 mm 厚）、手术刀片和 A4 PVC 装订封皮（21 cm × 29.5 cm）（图1B）。

2. 肌肉样品的制备

1. 在取样前5分钟，将液氮注入聚苯乙烯泡沫箱中。
   注意：液氮柱必须足够高，因为当新鲜样品接触液氮时，部分液氮会迅速汽化。为了减少因液氮挥发而需频繁补充的次数，应根据样品数量提前准备合适尺寸的聚苯乙烯泡沫箱。
2. 获取组织样本后，将其轻轻放置在一张A4尺寸的PVC装订封面上，观察肌纤维走向。
   注意：本实验中采用猪第一至最后腰椎段的背最长肌横截面样本，样本尺寸约为长12 cm、宽8 cm、高5 cm。
3. 使用解剖刀沿肌纤维方向在样本上做两条平行切口，切口长约3 cm，间距约0.6 cm。将切取的肌肉修整成约0.6 cm宽 × 0.6 cm高 × 1.5 cm长的矩形块。
   注意：肌纤维横截面积测量的可靠性主要取决于切取肌肉中肌纤维的方向是否正确。
4. 用10 cm镊子将样本轻轻放置于塑料薄膜上，使切取肌肉的长轴与薄膜的长边平行（图2A）。
   注意：塑料薄膜具有两个功能：一是固定作用，有助于保持肌纤维的方向；二是粘附作用，可防止样本因快速冷冻而产生裂纹。
5. 用镊子将肌肉组织放入已标记的冻存管底部中央位置，正好位于进气孔之间，然后拧紧管盖（图2B）。

3. 冻存与储存肌肉样本

1. 使用25 cm的镊子，迅速将整个冷冻管浸入预冷的泡沫箱中的液氮中，等待液氮停止沸腾（约10-20秒）。
   注意：当液氮沸腾时，冷冻管会漂浮，因此需小心地将冷冻管浸入沸腾的液氮中10-20秒。
2. 将肌肉样本转移至液氮储存罐或-80 °C超低温冰箱中进行长期保存。

4. 载玻片制备

1. 将冷冻切片机预冷至 -20 °C 至 -22 °C 之间。
2. 取下并丢弃旧的切片刀片，清洁冷冻切片机内的刀架和防卷板，安装新的切片刀片，并将切片厚度设置为 8 µm。
3. 将装有肌肉样本的冻存管从液氮罐或 -80 °C 冰箱中取出，通过液氮或干冰运输至冷冻切片机。
4. 等待 30 分钟，使样本温度与冷冻切片机达到平衡。
   注意：所有可能接触样本的器械均需预先冷却，因为高温可能导致样本中形成冰晶。
5. 在水溶性乙二醇和树脂混合物（OCT）包埋剂中将样本固定于样本夹上，进行切片，切片厚度为 8 µm。
   注意：应调整切片角度，使其垂直于肌纤维走向，因为肌纤维横截面积（CSAF）是指肌纤维的横截面面积。
6. 将切片转移至室温载玻片中央位置，立即将载玻片放入 -80 °C 冰箱中的玻片盒内。切勿让载玻片在室温下干燥。

结果

制备冷冻切片过程中用于冷冻肌肉组织的冻存管示意图及常用实验设备如图1所示。这些冻存管由聚丙烯材料在模具工厂中制成。每支冻存管共有14个进液孔：一个位于管盖上，一个位于管底，其余12个孔以四排平行排列，每排四个孔，彼此成90°角分布。这些进液孔可加快液氮在组织周围的流动速度，避免液氮接触组织时产生“汽膜”效应，从而显著减少冷冻样品中冰晶的形成。重要的是，本方法无需使用沸点为28 °C、极易挥发且易燃的异戊烷。

为了进一步突出该方法的优势，我们采用五种不同的冷冻方法对猪的背最长肌（longissimus dorsi）进行冷冻，随后使用苏木精/伊红（HE）染色观察其染色特性及组织学细节（图3）。在肌肉冷冻切片制备过程中，一个常见问题是冰晶的形成。当样本直接放入-80 °C冰箱中冷冻时（图3A），会形成较大的冰晶，从而在肌肉冷冻切片中产生众所周知的“...

讨论

本文介绍了一种用于冷冻和储存肌肉组织以进行肌肉功能组织学评估的新型多孔冻存管。本方案中的关键改进步骤是将多孔冻存管中的样品直接浸入液氮中。据我们所知，与其他现有冷冻方法相比，这是获得优质肌肉冷冻切片样品最简单且最快的方法（参见代表性结果）。

肌肉研究人员面临的技术难题在于，使用冷冻方法使肌肉组织硬化以进行切片时，最容易形成冰晶。如代表性结果所示，有三个因素在决定肌肉组织适合病理学研究的冷冻效果方面起着重要作用，包括选择合适的冷源、尽量减少样本的水分以及增加与冷源接触的总表面积比例。首先，冷冻速率至关重要，以避免在制备冷冻组织切片过程中造成损伤。当冷冻速度较慢时，肌肉组织会表现出众所周知的 "瑞士奶酪" 因为细胞外会形成大的冰晶。当冷冻速度较快但不够迅速时，单个肌细胞内会形成大量细小的针状冰晶。这些针状冰晶不会造成明显的结构损伤，但会引起以下效应：线粒体受损¹⁰，肌纤维的尺寸被人为增大¹¹，且纤维结构的完整性遭到破坏¹¹因此，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冷冻切片机	Leica	Leica CM1950
数码显微镜	Nikon	Nikon DS-U3
冷冻管   塑料薄膜			自行设计
液氮			常用
手术刀			常用
10 cm 镊子			常用
25 cm 镊子			常用
防护眼镜			常用
冷冻手套			常用