评估原发性冲击效应 体外

摘要

了解细胞在受到冲击波暴露后的调控机制，有助于揭示爆炸事件引发损伤的潜在机理。本方案采用自行设计的冲击管装置，对细胞单层施加不同压力的冲击波，并检测其对细胞活力的后续影响。

摘要

爆炸暴露可对肺、耳和脑等重要器官造成严重损伤。考虑到现代战争和恐怖主义事件中爆炸物使用的近期趋势，了解此类爆炸所致损伤的机制具有重要意义。为了充分理解爆炸引起的损伤，我们首先必须能够在受控环境中使用可重复的方法模拟此类爆炸事件。本技术利用激波管设备，可在二维培养的活细胞上施加不同压力的激波，并立即通过氧化还原指示剂检测法以及活细胞与死细胞的荧光成像分析细胞活力标志物。该方法表明，与未处理的对照组相比，将峰值超压增加至127 kPa可显著降低细胞活力。测试样本不仅限于贴壁细胞，还可通过激波管装置的微小调整，扩展至细胞悬液、 全身体组织及组织样本。要完全复制组织和细胞在真实爆炸事件中所经历的精确条件十分困难。本文介绍的技术有助于界定损伤阈值，并识别因激波暴露而引发的细胞内转录和表观遗传变化。

引言

随着现代战争和针对平民的恐怖袭击中简易爆炸装置的使用日益增多，了解爆炸事件对人体的影响变得极为重要。因爆炸事件暴露所致的伤害可能致命，其致伤的物理过程可分为四类。初级伤害由爆炸冲击波直接作用引起，冲击波以先压缩后扩张的方式与人体局部相互作用，导致膜结构和软组织的破坏¹。次级伤害包括由冲击波推动的低质量物体以高速撞击人体所造成的钝性创伤或穿透性损伤。三级伤害发生在冲击波能量足以将大质量物体或人体抛掷撞击其他物体时。最后，四级爆炸伤害定义为不符合上述分类的其他各类损伤，例如闪光烧伤²。在经历此类爆炸事件暴露后，初级伤害包括创伤性脑损伤^3,4,5、异位骨化^6,7、爆震性肺损伤⁸、听力丧失⁹以及其他类型¹⁰。

爆炸事件中常见的一种波形是Friedlander波，代表自由场环境下的爆炸，而非封闭空间内的爆炸。该波形包含一个冲击波前，可定义为正压的急剧且快速上升。紧随其后的是高速气流形成的冲击风，以及使压力降至大气水平以下的释放波。在爆炸初始区域会形成部分真空，导致空气缓慢回流。波形的正相和负相（图1A）共同导致了冲击波的推-拉运动¹。为了阐明原发性爆炸损伤背后的机制，研究人员已建立实验模型，用以产生类似Friedlander波的波形，模拟细胞和组织在真实爆炸事件中所面临的环境。文献中报道的现有系统包括激波管^{11,12,13,14,15,16,17}、压力舱^18,19、Kolsky杆²⁰、先进爆炸模拟器²¹、分离式霍普金森压杆²²，以及在受控环境中使用季戊四醇四硝酸酯重现其他类型爆炸事件的方法²³。尽管已有多种模型可用，但许多变量会影响爆炸波所致的损伤，包括施加于待评估的特定细胞类型或组织的预应力及其自身的力学特性²⁴。虽然对组织或器官的研究有助于揭示爆炸事件引起的组织变形和宏观形态学变化，但在细胞水平上的分析则可揭示冲击波所引发的转录和表观遗传学改变。

本文方法描述了一种在单层培养的活细胞上施加不同压力冲击波的技术。该技术可用于立即表征细胞活力，阐明冲击波导致损伤的潜在阈值。此外，存活的细胞可恢复至标准培养条件，从而进一步评估爆炸事件引起的长期生物学效应。下述方案介绍了两种可用于培养细胞的细胞活力检测技术。

图1： Friedlander波的近似图示。 （A）在激波管传感器3处观测到的Friedlander波的近似图。（B）代表性数据，显示在激波管传感器1、2和3处观测到的不同压力曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 细胞培养与样品制备

1. 获取合适的细胞系 （例如，毛乳头细胞）。
   注意：本实验方案专为贴壁细胞设计，以从大鼠胡须中分离的毛乳头成纤维细胞作为模型。
2. 将细胞培养于含α最小必需培养基（MEM α）的T-75培养瓶中，培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。在37 °C、5% CO₂的湿润环境中标准培养，直至细胞融合度达到80%。
3. 吸除培养基，用Dulbecco's磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。加入2 mL胰蛋白酶/EDTA，在标准培养条件下孵育5分钟，使细胞从培养瓶表面解离。使用带10X物镜的明场/相差显微镜短暂观察，确认细胞已成功脱离培养瓶表面。
4. 加入4 mL培养基以中和胰蛋白酶消化反应。将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
5. 在200 × g条件下离心4分钟，使细胞沉淀。缓慢吸除上清液，注意勿扰动细胞沉淀。用5 mL培养基重悬细胞沉淀。
6. 取20 µL细胞悬液加入洁净的血细胞计数板，使用配备10X物镜的显微镜进行细胞计数。
7. 为冲击波处理准备细胞：将三个35 mm培养皿放入一个90 mm培养皿内，做好相应标记。每个35 mm培养皿中加入2 mL培养基，并接种总共5 × 10⁴个细胞，均匀分布于培养皿内。将实验样本在标准培养条件下孵育过夜，以确保细胞充分贴壁后再进行冲击波处理。
   注意：如需进行荧光成像，细胞必须接种于无菌玻璃盖玻片上。

2. 冲击管组装

图2：EVOC装置与激波管组件。（A）EVOC装置的照片。（B）激波管装置的示意图。激波管的尺寸包括59 mm的内径，以及包含EVOC装置在内的总长度4.13 m。驱动管与EVOC装置的总长度为2.71 m。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 组装过程中需穿戴钢头工作靴和实验服。
2. 将两根对准杆插入出口法兰水平面上的两个螺栓孔中。在对准杆的末端覆盖一张丁腈橡胶垫片，使其位于出口法兰与 离体 器官培养（EVOC）装置
   注意：EVOC装置是一种定制设计的固定装置，旨在与35 mm培养皿配合使用（图2A).
3. 将EVOC装置通过定位杆滑动至激波管出口法兰处并固定，确保其方向正确，使承载培养皿的部分位于装置底部。
4. 将四根M24螺栓和垫圈插入剩余的孔中。将螺母放置到位，使其与法兰接触。
5. 以对角对称的方式依次拧紧螺母和螺栓，同时目视检查EVOC装置与激波管是否已成功对齐。
6. 将压力传感器连接至EVOC装置，并使用传感器电缆将其连接到电流源。然后，使用BNC电缆将电流源连接至示波器。
7. 确保冲击管上的所有泄压阀和流量控制阀均处于关闭状态。打开内置的外部压缩空气管路，手动顺时针旋转压力调节器，将电磁阀充气至2.5 bar。
8. 逆时针旋转180°打开压缩气体瓶的安全阀。
9. 缓慢顺时针旋转位于气瓶顶部的压力调节器，将压力增至约15 bar。
   注意：该调节器的设定点应略高于实验中所用最厚隔膜的最高爆破压力。
10. 通过将0.125 mm厚的塑料片切割成10 cm × 10 cm的正方形来制备隔膜。
    注意：膈膜的厚度将与爆破压力相关，从而改变冲击波的峰值压力。即， 较厚的隔膜会产生峰值压力更大的冲击波； 表1).

聚酯薄膜隔膜尺寸（cm）	爆破压力（bar）	传感器3压力范围（kPa）
10 x 10 x 0.023	2 ± 0.2	47 ± 7.5
10 x 10 x 0.050	4 ± 0.2	72 ± 7.5
10 x 10 x 0.125	9.5 ± 0.5	127 ± 12.5

表1：对应于隔膜厚度和峰值压力的爆破压力。

11. 用胶带制作手柄，将其固定在隔膜的顶部和底部，并利用手柄小心地将隔膜放置到枪膛前端小法兰旁边。在关闭枪膛之前，确保隔膜处于笔直且正确的位置。
12. 使用四个 M24 螺栓和螺母进行固定，以对角对称的顺序依次拧紧螺母和螺栓。

3. 冲击波暴露前细胞的准备

1. 使用紫外灭菌对组织超净工作台进行准备。用消毒液和70%乙醇清洁工作台。在冲击波暴露前/后处理细胞所需的所有物品准备好，并放置于无菌工作台内。
   注意：包括新鲜培养基、粘性透气膜、无菌剪刀、移液器和移液器吸头。
2. 将一个含有三个实验样本的90 mm培养皿从培养箱转移至无菌工作台。
3. 将一张粘性透气膜（见材料表）裁剪成六个正方形，每个正方形的尺寸需足以覆盖一个35 mm培养皿的顶部。
4. 吸除35 mm培养皿中的培养基，将皿盖移至一旁，用两片粘性透气膜覆盖培养皿，确保膜与培养皿边缘之间形成紧密密封。
5. 将样本转移至EVOC装置，并固定在夹具底座上，使培养皿顶部与激波管内底座对齐。

4. 冲击管操作

1. 加压激波管系统时，需佩戴耳罩、护目镜、安全靴和实验服。
2. 顺时针旋转调压阀上的流量控制旋钮，使气体流入连接压缩空气钢瓶与激波管的柔性软管。
3. 在控制面板底部，选择“双膛室”进气口以产生短持续时间的激波，或选择“驱动管”进气口以延长激波持续时间。
4. 打开直流电源和示波器以采集波形数据。将示波器采样率设置为 50.0 MS/s，记录长度设为 1 M 点。在 2 bar 下触发时设范围为 50 mV，在高于 4 bar 时设为 100 mV。
5. 使用控制面板对面墙上的开关打开安全警示灯。
   注意：此灯提示其他研究人员在激波管充电期间不得进入房间。
6. 打开电磁阀控制箱上的开关以关闭电磁阀。
   注意：此安全功能会关闭位于双膛室腔体上的阀门，从而允许系统进行充压。
7. 在控制面板上，缓慢逆时针旋转旋钮以打开流量控制，逐步增加压缩腔内的压力。通过控制面板显示屏监测压力变化。
8. 当达到膜片破裂压力时，膜片将破裂并发出“砰”的声响。此时应迅速关闭流量控制旋钮。
   注意：激波将沿管道传播，经过细胞样品后从管端传出。
9. 通过关闭电磁阀控制箱上的开关来打开电磁阀，并关闭安全灯（使用控制面板对面墙上的开关）。
10. 将细胞样品转移至无菌操作台，移除粘性透气膜，并向培养皿中加入 2 mL 新鲜培养基。细胞可立即用于后续检测（如步骤 5 所述），或放回培养箱进行长期研究。

5. 细胞活力

1. 通过氧化还原指示剂检测法结合活/死细胞荧光成像，评估冲击波暴露后的细胞活力。
   注意：进行荧光成像时，细胞必须在第1节“细胞培养与样品制备”期间接种于无菌玻璃盖玻片上，并可将其置于35 mm培养皿中。
2. 冲击波处理后，立即向每个实验组培养皿中补充2 mL培养基，并直接加入200 µL氧化还原指示剂试剂（参见材料表），在标准培养条件下孵育4小时。
3. 在避光的无菌操作台中，将每皿样品分别转移2份100 µL等分试样至黑色或透明的96孔板中，具体选择取决于后续采用荧光法还是吸光度法检测细胞活力。
4. 将96孔板置于配备合适滤光片的多功能酶标仪中，使用530ex/590em激发/发射波长检测荧光信号，或使用570 nm检测波长结合600 nm参比波长检测吸光度，读取数据并导出保存。
5. 分析数据，比较冲击波处理组与未处理对照组之间的差异，以判断是否存在细胞活力下降。
   注意：实验设计中应包含阴性对照。此外，可通过标准曲线插值法计算细胞数量。
6. 吸除含氧化还原指示剂的培养基，更换为2 mL新鲜培养基，在标准培养条件下继续孵育24小时。
7. 根据需要重复上述步骤，以获得第二个细胞活力时间点的数据。
8. 进行活/死细胞荧光成像时，吸除培养基，用1 mL PBS洗涤细胞两次。向每个样品中加入100 µL成像试剂盒中的完整试剂（参见材料表），避光室温孵育15分钟。
9. 吸除试剂，用1 mL PBS洗涤一次。使用精细镊子小心将盖玻片从35 mm培养皿中取出，正面朝下置于载玻片上。
10. 使用配备合适激发与发射滤光片（激发/发射波长：488 nm/515 nm 和 570 nm/602 nm）的荧光显微镜（10X物镜，数值孔径0.50）采集各样品图像。
    注意：活细胞呈现强烈且均匀的绿色荧光；而细胞膜受损的死细胞或濒死细胞会摄取死细胞染料组分，在细胞核区域主要发出红色荧光。
11. 使用图像分析软件，对手动或自动识别的每张图像中的活细胞与死细胞数量进行计数。

结果

采用上述方法，将单层培养的细胞在冲击管产生的冲击波下进行三重暴露处理（图2B），并评估细胞活力标志物。通过氧化还原指示剂检测发现，与对照组相比，127 kPa冲击波处理24小时后，毛乳头细胞的活力显著降低（图3）。而≤72 kPa的冲击波处理则未引起细胞活力下降。为支持上述观察结果，采用一种荧光成像检测方法，该方法可分别利用绿色和红色荧光染料对活细胞和死细胞进行荧光标记。通过对每个生物学重复样本的13张荧光图像中活细胞与死细胞进行定量分析，结果显示，与对照组相比，暴露于127 kPa冲击波的细胞活力下降（图4）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验，以p <0.05定义为具有统计学显著性。氧化还原指示剂检测每组样本量为9，定量荧光成像分析每组样本量为39。

图3：氧化还原指示剂检测数据，显示冲击波暴露后细胞活力的时间进程。与未处理对照组相比，127 kPa冲击波暴露组在24小时后观察到的细胞数量显著减少。阴性对照组采用2%消毒剂处理30秒（见材料表），在T0和24小时两个时间点的细胞数量均显著少于其他所有组。每根柱子代表均值 ± 1个标准差（SD）；生物学重复次数 N = 3；技术重复次数 n = 3。**** = p <0.0001。* = p <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：荧光成像。（A）通过荧光显微镜在冲击波暴露后24小时拍摄的活细胞与死细胞荧光图像所获得的定量数据。与47 kPa（均值 = 98.18）、72 kPa（均值 = 98.87）及对照组（均值 = 99.10）相比，127 kPa（均值 = 93.42）冲击波暴露组中观察到的可存活细胞显著减少。在24小时后，阴性对照组中未观察到任何可存活细胞（均值 = 0）。（B）代表性荧光图像。绿色表示活细胞，红色表示死细胞。每个箱线图显示上下四分位数及Tukey须线；生物学重复次数 N = 3；技术重复次数 n = 13。**** = p <0.0001。比例尺 = 300 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

由爆炸事件暴露所导致的原发性损伤尚未被完全理解。识别并理解引发爆炸相关损伤（如创伤性脑损伤^3,4和异位骨化^6,7）的机制，是开发有效预防方法的重要第一步。为实现这一目标，已开发出多种实验系统，用于模拟爆炸事件的暴露情况^{11,12,13,14,18,19}。本文所述技术采用激波管设备（图2），可在全身体（即啮齿类动物）、组织或细胞样本上施加不同压力的激波。相较于使用完整组织，加载单一细胞类型的能力有助于解析出不同的细胞特异性反应，因为损伤可能通过多种机制同时发生^1,2。例如，在模拟创伤性脑损伤时，对神经元和星形胶质细胞等单一细胞类型的评估，有助于识别细胞特异性的损伤。同时，也可利用脑组织评估整个器官的反应。单一细胞类型与组织样本均具有研究价值，并可提供不同的信息。此外，还可通过选择双膛室或驱动管进气口来调节被压缩空气的量，从而控制激波的持续时间。另一种可能性是改变隔膜材料及其厚度，以调节激波的峰值压力²⁵。

另一个需要考虑的因素是干扰端部效应，当样品承载装置位于激波管出口附近时可能出现这种效应，例如本系统中所述 EVOC 装置的情况。Chandra et al. 研究了在压缩驱动激波管不同位置测得的爆轰波波形，发现 Friedlander 波形在激波管内部较深位置表现最佳¹⁵。Kuriakose et al. 也研究了样品的二次加载问题，发现若在激波管末端安装端板，可消除不需要的反射波¹⁶。结合这些文献中报道的数据^15,16，未来对本文所述激波管系统的改进可包括将 EVOC 装置移至驱动段激波管更深处，或在激波管末端加装端板。该方法的局限性可能包括样品通量相对较低。单个操作人员可安全地以每小时约 6–8 个样品的速度运行该系统。目前，系统设计基于使用单个 35-mm 培养皿，因此开展包含多个组别和生物学重复的大规模实验可能存在困难。

本方法学文章展示了单次冲击波暴露对贴壁真皮乳头细胞活力的影响。与对照组相比，持续时间较短（<10 ms）且压力≤72 kPa的冲击波并未影响细胞活力（图3 和 图4）。相反，在爆炸后24小时，127 kPa的冲击波导致细胞活力显著下降，这一点通过氧化还原指示剂检测法（图3）和荧光图像分析（图4）均得到了证实。Miller et al. 报道，在使用开放式氦气驱动冲击管对大鼠器官型海马切片培养物施加147 kPa或278 kPa冲击波后，细胞活力出现了类似的降低¹⁴。相比之下，VandeVord et al. 报道，尽管使用的是压力舱而非冲击管，当大鼠星形胶质细胞暴露于持续时间较短、超压>200 kPa的环境中时，其细胞活力未受影响¹⁸。需要注意的是，外部压力依赖于冲击波，但其在体内会引发复杂的应力波，因此加载性质高度依赖于组织或细胞的力学特性。尚需开展更多关于细胞对爆炸事件反应的表征研究。此外，通过在细胞水平上评估冲击波暴露（如本技术所示），可识别并进一步探究由损伤引发的生物学反应，例如信号通路的扰动或表观遗传学改变。

综上所述，本研究描述了一种使用不锈钢激波管和改进的EVOC装置整合原代细胞培养的方法。可在一系列压力条件下产生激波，并使其穿过活细胞，以模拟爆炸波暴露所引发的效应。本方案展示了如何评估细胞活力，同时也可研究不同类型细胞的长期变化。未来，我们计划评估复杂激波对不同细胞类型所产生的差异性效应，旨在进一步加深对爆炸所致原发性损伤的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MEM α，核苷	赛默飞世尔科技	22571020
胎牛血清，经认证，美国来源	赛默飞世尔科技	16000044	补充物，用于配制完全生长培养基。
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	D8537
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15070-063	补充物，用于配制完全生长培养基。
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红	赛默飞世尔科技	15400-054	使用前按1:10稀释。
CytoOne T-75 培养瓶，经组织培养处理，带透气盖	Starlab	CC7682-4875
TC培养皿（聚苯乙烯）35 mm，8.5 cm2	三重红色	TCD010035
培养皿（聚苯乙烯）90 × 14.2 mm，无通风孔	VWR 英国	391-0453
透气性粘性板封膜	赛默飞世尔科技	AB-0718
LIVE/DEAD细胞成像试剂盒（488/570）	ThermoFisher	R37601
AlamarBlue细胞活力检测试剂	Fisher Scientific	13494309
Virkon 片剂	VWR 英国	115-0020	用于配制2%溶液，作为活力对照试剂。
杜蒙特镊子	手术工具	11295-10	用于从培养皿中移除盖玻片。
盖玻片，方形	VWR 英国	631-0125
显微镜载玻片	VWR 英国	631-1553
96孔板，实心黑色	AppletonWoods	CC760	用于荧光测量的培养皿。
96孔板，透明，（聚苯乙烯）	VWR 英国	734-1799	用于吸光度测量的培养皿。
Leica DMi1 显微镜相机支架套装	徕卡显微系统		用于细胞培养的光学显微镜
蔡司PALM显微切割激光显微捕获系统	蔡司		用于活/死细胞成像的荧光显微镜
EnVision 多功能酶标仪	PerkinElmer	2104-0010A	用于荧光/吸光度检测的酶标仪
聚酯薄膜电气材料 &化学绝缘膜，304 毫米 × 200 毫米 × 0.023 毫米	RS Components	785-0782	用于制作激波管隔膜。
Mylar 电气 &化学绝缘膜，304 mm × 200 mm × 0.05 mm	RS Components	785-0786	用于制作激波管隔膜。
Mylar 电气性能 &化学绝缘膜，304 mm × 200 mm × 0.125 mm	RS Components	785-0798	用于制作激波管隔膜。
当前电源功率单元	Dytran Instruments Inc.	4103C	2300V1 传感器的电源
IEPE 压力传感器	Dytran Instruments Inc.	2300V1	位于激波管上的压力传感器
数字磷光示波器	Tektronix	DPO 4104B	用于收集并保存传感器2300V1的数据。