方法文章

二维和三维拟胚体中视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞神经分化的分析

DOI：

10.3791/55621

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2017年4月22日

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1Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 2Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

本文内容

摘要

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我们介绍了一种利用小鼠胚胎干细胞生成二维或三维类胚体的技术。随后，我们阐述了如何通过视黄酸诱导类胚体细胞的神经分化，以及如何利用前体细胞标志物的免疫荧光染色和免疫印迹法分析其分化状态。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从小囊胚内细胞团（通常在E3.5天）分离的小鼠胚胎干细胞（ESCs）可用于 体外 研究早期胚胎发育的模型系统。在缺乏白血病抑制因子（LIF）的情况下，胚胎干细胞（ESCs）默认分化为神经前体细胞。它们可聚集成具有三维（3D）球形结构的类胚体（embryoid body, EB），因其结构类似于早期胚胎而得名。EB可接种于纤连蛋白包被的盖玻片上，由此向外生长形成二维（2D）延伸结构；也可植入三维胶原基质中，继续以球状体形式生长，并分化为三个胚层：内胚层、中胚层和外胚层。三维胶原培养体系模拟了 体内 与二维胚状体（2D EBs）相比，三维环境更接近体内条件。二维EB培养便于通过免疫荧光和免疫印迹分析来追踪分化过程。我们建立了一种两步法神经分化方案：第一步，采用悬滴法生成EBs，同时通过添加视黄酸（RA）诱导其启动分化；第二步，在去除RA的条件下，以二维或三维形式继续进行神经分化。

引言

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胚胎干细胞（ESCs）起源于囊胚的内细胞团。这些细胞具有多能性，即能够分化为来源生物体的任何细胞类型。体外胚胎干细胞分化作为一种研究发育通路和机制的实验体系，受到广泛关注。该体系为测试纠正细胞和组织功能障碍的新治疗策略提供了强大且灵活的模型。类胚体（EBs）重现了早期胚胎发生过程中细胞分化的诸多特征。特别是当胚胎致死性使得难以确定胚胎缺陷的细胞基础时，可利用EBs进行研究1,2。EBs可通过悬滴法或液体悬浮法形成3。前一种方法的优势在于能够生成大小和密度一致的EBs，从而有利于实验的可重复性。

与细胞外基质（ECM）黏附蛋白的相互作用可能影响贴壁细胞的运动性和存活能力。在二维培养系统中，通常使用纤连蛋白以增强细胞对基质的黏附。纤连蛋白是一种基底膜成分，可被10种类型的细胞表面整合素异源二聚体识别4。

视黄酸（RA）是一种维生素A的小分子脂溶性代谢产物，可诱导神经分化5,6。在拟胚体（EB）形成过程中，高浓度的RA可促进神经基因的表达，并抑制中胚层基因的表达

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方案

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1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的培养

  1. 准备MEF培养基：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，高糖型），添加15%胎牛血清（FBS）。
  2. 在室温下用0.5%明胶溶液对100 mm细胞培养皿包被30分钟。
  3. 使用细胞计数仪对MEF细胞进行计数。弃去明胶溶液，立即加入预热至37 °C的MEF培养基。将经丝裂霉素C处理的MEF冻存管在37 °C水浴中快速解冻2分钟，然后每100 mm明胶包被培养皿接种2.8 × 106个MEF细胞。若使用其他规格培养皿，需相应调整细胞接种数量。将MEF细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养过夜。
  4. 次日更换培养基。继续培养2–3天，直至MEF细胞层达到完全汇合。

2. 小鼠 ESC 培养

  1. 准备ESC培养基，即在Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）中添加15%胎牛血清（FBS）以及103 U/mL白血病抑制因子（LIF）、0.1 mM非必需氨基酸、55 mM 2-巯基乙醇、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、庆大霉素（200 µg/mL）和0.2%支原体抗生素。
  2. 移除第1步中制备的培养皿中的MEF培养基，替换为37 °C预热的ESC培养基。
  3. 解冻一管ESC细胞，并将细胞接种至MEF细胞层上方....

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结果

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Oct4、Nanog 和 SOX2 是赋予胚胎干细胞（ESC）自我更新和多能性的核心转录因子。我们采用上述方案，比较了野生型小鼠来源的 ESC 与基因修饰小鼠（其编码 RhoA 特异性交换因子 Syx 的基因 Syx 被破坏）来源的 ESC 的神经分化过程。我们此前已发现 Syx 参与血管生成18。我们观察到由 Syx+/+ 和 Syx-/- ESC 聚集形成的拟胚体（EB）在行为上存在差异，因此进一步检测了 Syx-/- ESC 的神经分化是否比 Syx+/+ ESC 更快。

为了比较 Syx+/+ 和 Syx-/- 胚胎干细胞（ESCs）的初始状态.......

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讨论

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在本实验方案中，我们介绍了一种相对简单且易于操作的方法，用于研究小鼠胚胎干细胞（ESC）的神经分化。在以往的方案中，通常在拟胚体（EB）悬滴法培养的第2天或第4天加入视黄酸（RA）8，或采用悬浮培养法时在相应时间点加入7，亦或在EB悬滴聚集完成后立即添加21。而在我们设计的方案中，RA的添加时间更早。尽管在悬浮培养形成的EB中提前加入了RA，但该方案仍获得了更高水平的神经分化标志物表达8。

本实验中，我们优先选择在悬滴培养开始时加入视黄酸（RA）并诱导神经分化。这一改进使得胚胎干细胞（ESCs）在仍处于单细胞悬液状态、尚未形成拟胚体（EB）聚集体之前，即可均匀暴露于RA。若将RA添加至已聚集的EB中，则EB内部细胞所感知的RA浓度可能低于外层细胞。在EB聚集初期应用RA的另一个优势在于，它可抑制内胚层和中胚层的发育，从而促进外胚层向神经方向分化7.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性或经济利益冲突

致谢

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R01 HL119984，授予 A.H.。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
MEFsEMD MilliporePMEF-CFESC 饲养层
ESCEMD MilliporeCMTI-2
细胞培养皿（60 mm）Eppendorf30701119细胞培养
细胞培养皿（100 mm）Falcon353003细胞培养
培养皿（100 mm）Corning351029悬滴法
24孔板Greiner Bio-One662160二维拟胚体
6孔板Eppendorf30720113转染
避光 1.5 mL 离心管Celltreat Scientific Products229437RA 储存液
显微镜盖玻片Fisherbrand12-545-80圆形，直径 12 mm
Superfrost-plus 显微镜载玻片Fisherbrand12-550-15
三维胶原培养试剂盒EMD MilliporeECM675三维培养
Effectene 转染试剂Qiagen301427干细胞转染
Microcon 离心过滤器（10 kDa）EMD MilliporeMRCPRT010蛋白质浓缩
名称 公司货号备注
试剂
DMEMLonza12-709FMEFs 培养
IMDMGibco12440-046ESCs 培养
胎牛血清（FBS）EMD MilliporeES-009-BESCs 培养
明胶Sigma-AldrichG2625培养皿包被
LIFR&D Systems8878-LF-025维持 ESC 多能性
MEM 非必需氨基酸溶液Gibco11140050细胞培养
2-巯基乙醇Gibco21985023细胞培养
青霉素-链霉素Gibco15140122细胞培养
庆大霉素Gibco15750060细胞培养
MycoZap Plus-PRLonzaVZA-2022细胞培养
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200-072细胞培养
DMSOSigma-AldrichD2650
全反式维甲酸Sigma-AldrichR2625-50MG诱导神经分化
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7030-50G封闭和抗体稀释 
曲拉通 X-100Sigma-AldrichT8787-100ML细胞膜通透化
细胞筛Corning352360
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life Tech.P36931封片试剂
16% 多聚甲醛 Electron Microscopy Sciences15710细胞固定
纤连蛋白R&D Systems1030-FN培养皿包被
PBSGibco10010049
I 型胶原酶Worthington Biochem. CorpLS004196拟胚体解离
名称 公司货号备注
一抗
Nestin (Rat-401)Santa Cruz Biotechsc-33677检测神经分化
Oct4Santa Cruz Biotechsc-5279检测神经分化
NanogBethyl LaboratoriesA300-398A检测神经分化
Sox2Cell Signaling3579检测神经分化
微管蛋白 β3 (AA10)Santa Cruz Biotechsc-80016检测神经分化
名称 公司货号备注
二抗
驴抗小鼠-Alexa555Life Tech.A31570免疫荧光
驴抗小鼠-Alexa488 Life Tech.A21202免疫荧光
名称 公司货号备注
仪器
宽场显微镜NikonEclipse TS100细胞培养成像
共聚焦显微镜NikonC2免疫荧光成像

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromis....

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