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方法文章

二维和三维拟胚体中视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞神经分化的分析

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DOI：

10.3791/55621

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2017年4月22日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 2Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

本文内容

摘要

我们介绍了一种利用小鼠胚胎干细胞生成二维或三维类胚体的技术。随后，我们阐述了如何通过视黄酸诱导类胚体细胞的神经分化，以及如何利用前体细胞标志物的免疫荧光染色和免疫印迹法分析其分化状态。

摘要

从小囊胚内细胞团（通常在E3.5天）分离的小鼠胚胎干细胞（ESCs）可用于 体外 研究早期胚胎发育的模型系统。在缺乏白血病抑制因子（LIF）的情况下，胚胎干细胞（ESCs）默认分化为神经前体细胞。它们可聚集成具有三维（3D）球形结构的类胚体（embryoid body, EB），因其结构类似于早期胚胎而得名。EB可接种于纤连蛋白包被的盖玻片上，由此向外生长形成二维（2D）延伸结构；也可植入三维胶原基质中，继续以球状体形式生长，并分化为三个胚层：内胚层、中胚层和外胚层。三维胶原培养体系模拟了 体内 与二维胚状体（2D EBs）相比，三维环境更接近体内条件。二维EB培养便于通过免疫荧光和免疫印迹分析来追踪分化过程。我们建立了一种两步法神经分化方案：第一步，采用悬滴法生成EBs，同时通过添加视黄酸（RA）诱导其启动分化；第二步，在去除RA的条件下，以二维或三维形式继续进行神经分化。

引言

胚胎干细胞（ESCs）起源于囊胚的内细胞团。这些细胞具有多能性，即能够分化为来源生物体的任何细胞类型。体外胚胎干细胞分化作为一种研究发育通路和机制的实验体系，受到广泛关注。该体系为测试纠正细胞和组织功能障碍的新治疗策略提供了强大且灵活的模型。类胚体（EBs）重现了早期胚胎发生过程中细胞分化的诸多特征。特别是当胚胎致死性使得难以确定胚胎缺陷的细胞基础时，可利用EBs进行研究1,2。EBs可通过悬滴法或液体悬浮法形成3。前一种方法的优势在于能够生成大小和密度一致的EBs，从而有利于实验的可重复性。

与细胞外基质（ECM）黏附蛋白的相互作用可能影响贴壁细胞的运动性和存活能力。在二维培养系统中，通常使用纤连蛋白以增强细胞对基质的黏附。纤连蛋白是一种基底膜成分，可被10种类型的细胞表面整合素异源二聚体识别4。

视黄酸（RA）是一种维生素A的小分子脂溶性代谢产物，可诱导神经分化5,6。在拟胚体（EB）形成过程中，高浓度的RA可促进神经基因的表达，并抑制中胚层基因的表达7,8。RA由维生素A通过醇脱氢酶或视黄醇脱氢酶氧化为视黄醛，再由视黄醛脱氢酶进一步氧化为终产物RA9。神经分化过程需要细胞内视黄酸结合蛋白2（CRABP2）将RA从细胞质转运至细胞核。在细胞核内，RA与其同源受体复合物——RAR-RXR异源二聚体结合10，从而招募转录共激活因子，启动基因转录9,11。此外，RA可促进磷酸化（活性）SMAD1的降解，从而拮抗BMP和SMAD信号通路12。除上述作用外，RA还能上调Pax6的表达，而Pax6是一种支持神经分化的转录因子13。RA信号通路受到Sirtuin-1（Sirt1）的调控，Sirt1是一种细胞核内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性酶，可通过去乙酰化CRABP2干扰其向细胞核的转位，从而影响RA与RAR-RXR异源二聚体的结合14,15,16。

我们设计本实验中所述的RA处理EB方案的目标是优化神经分化，以促进 体外 分析调控胚胎干细胞分化为神经前体细胞的信号通路。该实验方案的优势之一在于便于通过免疫荧光分析细胞功能。三维胚状体（3D EBs）对抗体的渗透性较差，难以成像；而在神经分化过程中的特定时间点将EB解离为二维单层细胞，有助于实现免疫标记，并通过共聚焦显微镜对细胞进行成像分析。

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方案

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的培养

  1. 准备MEF培养基：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，高糖型），添加15%胎牛血清（FBS）。
  2. 在室温下用0.5%明胶溶液对100 mm细胞培养皿包被30分钟。
  3. 使用细胞计数仪对MEF细胞进行计数。弃去明胶溶液，立即加入预热至37 °C的MEF培养基。将经丝裂霉素C处理的MEF冻存管在37 °C水浴中快速解冻2分钟，然后每100 mm明胶包被培养皿接种2.8 × 106个MEF细胞。若使用其他规格培养皿，需相应调整细胞接种数量。将MEF细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养过夜。
  4. 次日更换培养基。继续培养2–3天，直至MEF细胞层达到完全汇合。

2. 小鼠 ESC 培养

  1. 准备ESC培养基，即在Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）中添加15%胎牛血清（FBS）以及103 U/mL白血病抑制因子（LIF）、0.1 mM非必需氨基酸、55 mM 2-巯基乙醇、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、庆大霉素（200 µg/mL）和0.2%支原体抗生素。
  2. 移除第1步中制备的培养皿中的MEF培养基，替换为37 °C预热的ESC培养基。
  3. 解冻一管ESC细胞，并将细胞接种至MEF细胞层上方。于37 °C、5% CO2条件下培养，直至ESC细胞达到汇合状态。
  4. 准备新的细胞培养皿，其中含有汇合的MEF单层细胞。传代ESC细胞时，先用PBS洗涤一次，再加入0.25%胰蛋白酶/EDTA，在37 °C、5% CO2条件下消化2–5分钟。加入含15% FBS的新鲜IMDM培养基终止消化反应，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以160 × g离心5分钟。
  5. 弃去上清液，用新鲜IMDM重悬ESC细胞，并将五分之一的细胞接种至每个新的MEF包被培养皿中；继续培养至细胞汇合（通常需4–5天）。

3. 去除MEFs并在明胶包被的培养板上培养ESCs

  1. 当ESCs达到汇合状态时，按照步骤2.4使用0.25%胰蛋白酶/EDTA将其与MEFs解离，用新鲜IMDM重悬细胞，转移至非黏附性细菌培养皿中，并在37 °C、5% CO2条件下孵育40分钟。
  2. 使用5 mL移液器小心地将含有ESCs和MEFs的培养基转移至新的明胶包被培养皿中，避免反复吹打。由于ESCs不黏附，因此残留在培养皿中的细胞为MEFs。
  3. 每3-4天传代一次ESCs。传代频率过低可能会降低ESCs的多能性。培养时汇合度不得超过60%，否则可能促进细胞分化。
  4. 根据需要重复步骤3.2-3.3三次或更多次，直至在20X物镜下通过细胞培养显微镜观察不再能检测到MEFs，以确保MEFs已被完全去除。
  5. 通过观察ESCs培养情况验证其多能性，确认细胞是否形成具有典型ESCs多边形形态的致密克隆（图1A）。通过定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）17、免疫印迹17或核心多能性转录因子的免疫荧光染色17（图2）检测细胞的干性。

4. 胚状体形成

  1. 用DMSO配制10 mM的全反式维甲酸（all-trans-RA）储备液，分装至1.5 mL避光微量离心管中。溶液在-80 °C可稳定保存最多两周。需避光保存。
  2. 按照步骤2.4的方法对ESCs进行胰酶消化，并以单细胞悬液形式重悬于不含LIF的新鲜IMDM培养基中。
  3. 使用血细胞计数板计数细胞，并用含0.5 µM RA的IMDM培养基制备成5 × 105 个细胞/mL的细胞悬液。
  4. 使用八通道移液器和200 µL吸头，每100 mm培养皿中加入100个20 µL的液滴；将培养皿倒置，并在倒置的皿盖中加入PBS以防止悬滴干燥。含RA的培养基需避光处理。
  5. 将拟胚体（EBs）在37 °C、5% CO2条件下以悬滴法培养4天。

5. 二维EB培养

  1. 在室温下用 30 µg/mL 纤连蛋白包被 12 mm 圆形玻璃盖玻片，孵育 30 分钟。将每张盖玻片放入 24 孔板的孔中，每孔加入 1 mL IMDM 培养基。
  2. 使用 200 µL 移液器吸头逐个收集培养 3 天的悬滴胚状体（EB），并将它们接种到包被有纤连蛋白的盖玻片上，每孔 20 个 EB，使用相同的移液器吸头。
    注意：与培养 4 天的 EB 相比，3 天的 EB 更优，因其更易于贴附于盖玻片。
  3. 继续使用不含 LIF 的 IMDM-15% FBS 培养基进行培养，每 3–4 天更换一次培养基。根据需要收集用过的培养基用于蛋白质分泌分析。

6. 分泌蛋白的检测

  1. 将500 µL EB培养基转移至10 kDa截留分子量的离心过滤器中，在4 °C下以20,000 × g离心60分钟。
  2. 每15–20分钟检查一次离心过滤器内剩余的培养基，以防止过度浓缩。当剩余培养基体积减少至25 µL时，停止离心。
  3. 按照制造商说明书操作，将滤膜倒置后在4 °C下以160 × g离心，收集剩余的浓缩培养基。
  4. 使用特异性抗体通过免疫印迹法检测分泌蛋白17。

7. 3D 胚状体培养

  1. 按照步骤5.2所述，收集在悬滴中培养4天的EBs，并将其放入1.5 mL离心管中（每管30个EBs）。
  2. 根据3D胶原培养试剂盒的说明（见材料/设备表）配制胶原凝胶溶液。取适量胶原溶液和5倍浓缩DMEM（试剂盒组分）进行稀释；加入中和液（试剂盒组分），立即充分混匀，并置于冰上保存。
  3. 将适量预冷的胶原溶液用移液器加入含有EBs的1.5 mL离心管中，然后用1 mL移液枪头轻轻转移至6孔板的孔中。避免产生气泡。
  4. 立即将该培养板转移至37 °C、5% CO2培养箱中孵育60分钟，以启动胶原蛋白聚合。
  5. 向含有EBs的培养板中加入IMDM培养基覆盖凝胶。
  6. 每3-4天更换一次培养基。

8. EB 解离

  1. 用200 µL枪头逐个收集第4天的EBs（来自步骤4），转移至含有IMDM培养基（添加15% FBS）的非黏附性细菌培养皿中；在37 °C、5% CO2条件下继续培养4天。每天检查EBs两次，确保其未贴壁；轻轻晃动培养皿以防止EBs贴附于底部。
  2. 在台式离心机中，以185 × g离心5分钟（室温）收集EBs。
  3. 弃去上清液。每管沉淀体积不应超过100 µL。
  4. 向沉淀的EBs中每管加入1 mL含20% FBS的PBS缓冲液配制的0.25% I型胶原酶溶液。
  5. 将EBs与胶原酶混合物在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时，每隔20分钟用1 mL枪头轻轻吹打一次。
  6. 用PBS轻柔洗涤细胞3次。若存在细胞团块，使用孔径100 µm的细胞筛过滤去除。
  7. 将细胞重铺于明胶包被的60 mm培养皿中，加入IMDM培养基，于37 °C、5% CO2条件下孵育。

9. 分离后胚状体的转染

  1. 进行qRT-PCR和免疫印迹实验时，用0.5%明胶包被6孔板。
  2. 进行免疫荧光实验时，在室温下用30 µg/mL纤连蛋白包被玻璃盖玻片30分钟。将每张盖玻片放入24孔板的一个孔中，并加入IMDM培养基。
  3. 分别在6孔板或24孔板的每个孔中接种4.75 × 105或1 × 105个解离的EB细胞（见步骤8.4–8.7）。
  4. 将细胞培养至70%融合度后进行转染。
  5. 使用非脂质体脂质干细胞优化转染试剂17（参见材料/设备表格），按照制造商说明书进行细胞转染。
    注意：我们所使用的试剂通常可达到约50%的转染效率（参见代表性结果）。
  6. 转染后2或3天，分别通过qRT-PCR或免疫印迹17分析样品。

10. 通过免疫荧光分析拟胚体分化

  1. 用 PBS 洗涤 2D 胚状体或解离的 3D 胚状体，并用含 4% 多聚甲醛的 PBS 在室温下固定 30 分钟。用 PBS 洗涤固定后的细胞 3 次，以去除漂浮的细胞碎片。
    注意：多聚甲醛对皮肤和眼睛具有刺激性，操作时需谨慎。
  2. 加入含 1% Triton X-100 的 PBS，在室温下透化细胞 20 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
  3. 移除 PBS，并用含 5% BSA 的 PBS 在室温下封闭 30 分钟。
  4. 在含 1% BSA 的 PBS 中配制一抗稀释液，并添加 0.03% Triton X-100。用一抗溶液替换封闭液，在室温下孵育 3 小时，或在 4 °C 下过夜，然后用 PBS 洗涤细胞 3 次。
  5. 根据生产商说明书，将二抗溶于 PBS 中进行孵育，在室温下孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤细胞 3 次。
  6. 使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上，用于光学显微镜观察。

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结果

Oct4、Nanog 和 SOX2 是赋予胚胎干细胞（ESC）自我更新和多能性的核心转录因子。我们采用上述方案，比较了野生型小鼠来源的 ESC 与基因修饰小鼠（其编码 RhoA 特异性交换因子 Syx 的基因 Syx 被破坏）来源的 ESC 的神经分化过程。我们此前已发现 Syx 参与血管生成18。我们观察到由 Syx+/+ 和 Syx-/- ESC 聚集形成的拟胚体（EB）在行为上存在差异，因此进一步检测了 Syx-/- ESC 的神经分化是否比 Syx+/+ ESC 更快。

为了比较Syx+/+和Syx-/- ESC的初始状态，我们对每种基因型中O...

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讨论

在本实验方案中，我们介绍了一种相对简单且易于操作的方法，用于研究小鼠胚胎干细胞（ESC）的神经分化。在以往的方案中，通常在拟胚体（EB）悬滴法培养的第2天或第4天加入视黄酸（RA）8，或采用悬浮培养法时在相应时间点加入7，亦或在EB悬滴聚集完成后立即添加21。而在我们设计的方案中，RA的添加时间更早。尽管在悬浮培养形成的EB中提前加入了RA，但该方案仍获得了更高水平的神经分化标志物表达8。

本实验中，我们优先选择在悬滴培养开始时加入视黄酸（RA）并诱导神经分化。这一改进使得胚胎干细胞（ESCs）在仍处于单细胞悬液状态、尚未形成拟胚体（EB）聚集体之前，即可均匀暴露于RA。若将RA添加至已聚集的EB中，则EB内部细胞所感知的RA浓度可能低于外层细胞。在EB聚集初期应用RA的另一个优势在于，它可抑制内胚层和中胚层的发育，从而促进外胚层向神经方向分化7...

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披露

作者声明不存在任何竞争性或经济利益冲突

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R01 HL119984，授予 A.H.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
MEFsEMD MilliporePMEF-CFESC 饲养层
ESCEMD MilliporeCMTI-2
细胞培养皿（60 mm）Eppendorf30701119细胞培养
细胞培养皿（100 mm）Falcon353003细胞培养
培养皿（100 mm）Corning351029悬滴法
24孔板Greiner Bio-One662160二维拟胚体
6孔板Eppendorf30720113转染
避光 1.5 mL 离心管Celltreat Scientific Products229437RA 储存液
显微镜盖玻片Fisherbrand12-545-80圆形，直径 12 mm
Superfrost-plus 显微镜载玻片Fisherbrand12-550-15
三维胶原培养试剂盒EMD MilliporeECM675三维培养
Effectene 转染试剂Qiagen301427干细胞转染
Microcon 离心过滤器（10 kDa）EMD MilliporeMRCPRT010蛋白质浓缩
名称 公司货号备注
试剂
DMEMLonza12-709FMEFs 培养
IMDMGibco12440-046ESCs 培养
胎牛血清（FBS）EMD MilliporeES-009-BESCs 培养
明胶Sigma-AldrichG2625培养皿包被
LIFR&D Systems8878-LF-025维持 ESC 多能性
MEM 非必需氨基酸溶液Gibco11140050细胞培养
2-巯基乙醇Gibco21985023细胞培养
青霉素-链霉素Gibco15140122细胞培养
庆大霉素Gibco15750060细胞培养
MycoZap Plus-PRLonzaVZA-2022细胞培养
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200-072细胞培养
DMSOSigma-AldrichD2650
全反式维甲酸Sigma-AldrichR2625-50MG诱导神经分化
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7030-50G封闭和抗体稀释 
曲拉通 X-100Sigma-AldrichT8787-100ML细胞膜通透化
细胞筛Corning352360
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life Tech.P36931封片试剂
16% 多聚甲醛 Electron Microscopy Sciences15710细胞固定
纤连蛋白R&D Systems1030-FN培养皿包被
PBSGibco10010049
I 型胶原酶Worthington Biochem. CorpLS004196拟胚体解离
名称 公司货号备注
一抗
Nestin (Rat-401)Santa Cruz Biotechsc-33677检测神经分化
Oct4Santa Cruz Biotechsc-5279检测神经分化
NanogBethyl LaboratoriesA300-398A检测神经分化
Sox2Cell Signaling3579检测神经分化
微管蛋白 β3 (AA10)Santa Cruz Biotechsc-80016检测神经分化
名称 公司货号备注
二抗
驴抗小鼠-Alexa555Life Tech.A31570免疫荧光
驴抗小鼠-Alexa488 Life Tech.A21202免疫荧光
名称 公司货号备注
仪器
宽场显微镜NikonEclipse TS100细胞培养成像
共聚焦显微镜NikonC2免疫荧光成像

参考文献

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