Method Article

LERLIC-MS / MS进行深入表征和谷氨酰胺的定量和天冬酰胺脱酰胺在鸟枪蛋白质组学

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

 ,  , 
1Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里，我们提出的长条静电排斥亲水相互作用色谱 - 串联质谱（LERLIC-MS / MS）的方法的一个步骤一步协议。这是一种新的方法，使通过鸟枪蛋白质组学的谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺亚型的第一次定量和定性。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质脱酰胺化的表征是势在必行破译在人体病理学和其他生化上下文该蛋白的翻译后修饰（PTM）的作用（S）和潜力。为了进行蛋白质脱酰胺的表征，我们最近开发了一种新型长条静电排斥亲水性相互作用色谱 - 串联质谱（LERLIC-MS / MS）方法，其可以分离谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（ASN）同种型脱酰胺的产物从模型化合物到高度复杂的生物样品。 LERLIC-MS / MS，因此，第一鸟枪蛋白质组学策略的Gln脱酰胺同种型的分离和定量。我们还证明，作为新颖性，在这里列出的样品处理方案稳定琥珀酰亚胺中间体允许由LERLIC-MS / MS表征。如图所示这个视频文章中LERLIC-MS / MS的应用可以帮助阐明目前不明蛋白质脱酰胺的n个分子阵列。此外，LERLIC-MS / MS提供了涵盖不同的生物学背景脱酰胺酶反应的进一步理解。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脱酰胺是一种蛋白质翻译后修饰（PTM），通过天冬酰胺（ASN）和/或谷氨酰胺（Gln）残基1的变形例引入了一个负电荷的蛋白质骨架。 1比2:此修改而影响的Asn残基处的共同3生成异构产物异天冬氨酸（异Asp）和正 -天冬氨酸（ASP）。尽管如此，该比率可以通过修复酶L-isoaspartyl甲基（PIMT）3，4的干预而改变。类似地，谷氨酰胺残基的脱酰胺化，生成以预期1异构γ-谷氨酸（γ-Glu），并且的α-谷氨酸亚型（α-GLU）:7的比例3,5，但此比例可通过的作用而移普遍存在的酶的转谷氨酰胺酶2和其它转谷氨酰胺酶，转谷氨酰胺酶包括1，一个电子nzyme最近被确定为与大脑中的6外囊泡。

脱酰胺的起源可以是自发的或酶促的，前者是特别常见的谷氨酰胺残基，其中的转谷氨酰胺酶和其它酶通过转酰氨调解帧间/分子内交联（参见第3对谷氨酰胺酰氨进一步细节及其含义在几种慢性和致命人类疾病）。因此，脱酰胺是具有在所述结构上的一个关键反响和功能的影响分子4，7，8，并且需要进行了深入的化学表征3中的其不同的生物化学后果的光包括其服务老化9的作为分子时钟PTM 。

虽然天冬酰胺残留的脱酰胺已相对充分表征通过自下而上鸟枪蛋白质组学1,10，谷氨酰胺残基的脱酰胺化仍然没有超出由基于电子的自由基碎片11模型化合物的具有挑战性的分析的合适表征方法。我们最近开发了一种新型一维鸟枪蛋白质组学策略（LERLIC-MS / MS）3，使在一次分析中从复杂生物样品和模型化合物谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺同种型的分离。 LERLIC-MS / MS是基于使用的长长度（50厘米）离子交换柱（LAX）上静电排斥亲水性相互作用色谱（ERLIC）模式下工作的胰蛋白酶消化的肽的分离和耦合到串联质谱（LC- MS / MS）。这个新的分析策略已被用于表征和比较定量每个脱酰胺化残基在人脑组织中的程度F"> 3。然而，这里概述的协议将提供旨在研究蛋白质脱酰胺的特殊性在感兴趣的生化上下文LERLIC-MS / MS的视频成像。

道德守则

本协议的所有程序已通过在新加坡南洋理工大学的机构审查委员会，并根据该机构准则已执行。

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Protocol

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1.包装长的长度阴离子交换（LAX）毛细管柱

（注意:虽然LAX列可以在家里装，因为我们在这个协议描述，LAX列也可购得，见材料与试剂的表的其他细节）。

  1. 暂停50毫克弱阴离子交换包装材料的在3.5mL的包装缓冲器 （ 表1）以制备淤浆。
  2. 组装该毛细管柱（50厘米长 - 200微米内径（ID）管）的端部使用一个母对阴配合，一个套圈和阴螺母。放置屏幕1/16" 1微米OD的孔尺寸的女性与阴配件内（注意:此处所用的屏幕必须具有更小的孔尺寸比包装材料的颗粒尺寸，以防止来自所述材料的泄漏柱）。
  3. 包用在4500 PSI操作压力泵浆毛细管。 （注:打包coluMN，直到包装材料是在列的条目）可见。
  4. 如在点1.2描述组装该毛细管柱的另一端。

2.样品制备

该协议概述LERLIC-MS / MS的应用程序来分析人类脑组织作为模型蛋白质组。 （注意:如果使用其它组织或蛋白质组样品中，样品制备程序应适应。）

  1. 组织均匀化退火:
    一个。洗涤脑组织（50〜100毫克）与五分钟三次1×磷酸盐缓冲溶液。
    湾均质化的组织在1:1:2.5的组织/金属珠/ SDC匀浆缓冲液 （ 表2）比（W / W / V），在4℃下，在安全锁定管以最大强度使用组织匀浆5分钟。 （注:如前面在3所示SDC匀浆缓冲液可以包括蛋白酶抑制剂）中
    C。离心组织匀浆，获得来回M中的前一步骤，以10,000×克，4℃10分钟，并收集上清液到新的1.5mL管中。
    天。重复BC对于剩余的粒料的步骤和直到没有沉淀观察到结合上清液作为根据需要多次。 （注:如果您有重复步骤BC两倍以上，样品和珠子移动到新的安全锁管以防止在离心步骤样品的损失）。
    即量化通过二喹啉甲酸测定（BCA）12所得到的匀浆的蛋白质浓度。
  2. 脱氧胆酸钠（SDC）辅助脑匀浆的溶液内胰蛋白酶消化13。
    一个。添加10mM的二硫苏糖醇（DTT）（使用表3中的解决方案5所示的原液）到所获得的匀浆以发起的蛋白质二硫键键的还原的最终浓度。
    湾在浴中30分钟期间孵育匀浆预先设定为60℃。
    C。添加到匀浆使用表4的解决方案7所示的储备溶液的20mM碘乙酰胺（IAA）使终浓度。
    天。孵育45分钟期间含有IAA在黑暗中在室温下将组织匀浆。
    即稀释脑匀浆用稀释缓冲液的两倍（ 表3的解决方案6）。
    F。在37℃下30分钟期间孵育的第二还原步骤的样品。
    G。添加溶解在表2中的解决方案2的测序级修饰胰蛋白酶在蛋白质与酶比率1:50（重量/重量）。
    H。通过温育过夜，在30℃消化用胰蛋白酶匀浆。
    一世。通过添加甲酸（FA）的0.5％最终浓度淬灭第二天酶消化。 （注:FA的加入将导致在酸性条件下SDC盐沉淀）。
    学家轻轻涡旋含有SDC precipi样品大老。
    ķ。通过在12,000×g下，在10分钟期间4℃离心该样品沉淀下来SDC盐。
    湖收集上清液和液体转移到一个干净新管中。 （注:从SDC颗粒这一步骤的移液时小心不要再中止和/或收集盐。）
    米重新溶解在SDC再溶解缓冲液 （ 表5）的SDC粒料下剧烈涡旋1分钟。
    ñ。重复步骤JL两次以恢复沉淀的肽，并结合上清。 （注:参见Serra 等 2016 13上的进一步细节的SDC-协助溶液胰蛋白酶消化协议这里适配。）
  3. 胰蛋白酶的消化脱盐样品。
    一个。执行使用1克C-18盒式磁带消化的样品的脱盐。 （注意:使用一个大体积盒（5毫升）的独立地蛋白得到保证的样品中剩余的SDC的盐的适当的清洁的量之前到LC-MS / MS注射）。
    湾用5mL的乙腈（ACN）执行1克C-18盒式磁带的调理。
    C。由空调1克C-18盒式磁带通过5mL的清理缓冲液 （ 表6），以除去任何残留的有机溶剂。
    天。加载样品到1克C-18盒。
    即执行3 - 5清理步骤，使用5毫升清理缓冲器的每个步骤中的1克C-18柱的样品。
    F。洗脱使用5毫升的洗脱缓冲液 （ 表7）的1克C-18盒式磁带的脱盐肽。
    G。在真空中干燥浓缩洗脱的肽。
    C。重新构成干燥的样品中的洗脱缓冲液的200μL的终体积。 （注意:使用剧烈和长（> 10分钟），涡旋，随后在超声浴超声处理之后30分钟期间以完全重新悬浮在注射缓冲液的干燥肽）
    天。调整样品LERLIC-MS / MS对ANA的注射体积lyze蛋白1 3之间，以微克。

3.一维LERLIC-MS / MS分离

  1. 液相色谱条件:
    流动相:
    A:0.1％甲酸的水（ 表8）。
    B:0.1％甲酸的乙腈（ 表9）
    流量:0.4微升/分钟
    柱:LAX毛细管柱（50厘米长 - 为200μmID）
    一个。使用下面的1200分钟梯度:95％B 40分钟，95 - 434分钟85％B，85 - 为522分钟70％B，70 - 为124分钟，35％B，35 - 3％B 45分钟，等度在5分钟的3％B，3 - 95％B历时7分钟，并保持等度在95％B 23分钟。
    湾执行使用LAX毛细管如塞拉＆盖勒特-帕劳等人指出的肽的分离。使用超高压液相色谱3。
  2. 质谱仪配置:
    一个。配置扫描事件的详细信息进行数据采集交替betwe烯全傅立叶变换质谱（FT-MS）和傅里叶变换 - 串联质谱法（FT-MS / MS）使用以下参数:
    A.1。数据采集​​模式:正
    A.2 FT-MS参数:
    质量范围:350 - 2000 M / Z
    分辨率60000
    微扫描:1每光谱
    自动增益控制:1×10 6
    A.3 FT-MS / MS参数:
    分段模式:高能碰撞解离（HCD）
    A.4质量范围:150 - 2000 M / Z
    A.5分辨率:30,000
    A.6前N个离子:10
    微扫描:1每光谱
    充电状态:> 2+
    隔离宽度:2达
    A.7自动增益控制:1×10 6
    湾执行如使用配备有纳米电喷雾离子源在1.5千伏工作轨道阱质谱仪在3所示的肽的质谱检测。

4.数据分析

  1. 执行prote在数据库检索到LERLIC-MS / MS使用获得使用特定的蛋白质组软件中的以下参数的数据:（注:进一步的细节请参见第3）。
    一个。离子公差为10ppm
    湾碎片离子公差:0.05沓
    C。假发现率（FDR）:1％
    天。数据库:UniProt的人体数据库
    即修正修改:Carbamydomethylation在半胱氨酸
    F。可变修饰（如果需要由软件）:氧化（MET），脱酰胺（Asn和谷氨酰胺）。
  2. 自信表征和异构体脱酰胺产物在LERLIC-MS / MS数据量化:
    一个。从LERLIC-MS / MS数据库导出搜索结果的spreedsheet软件进行分析。
    湾查找并提取脱酰胺肽及其非脱酰胺化的同行的整个列表。
    C。使用所获得的肽的列表作为参考，以5ppm质量公差的提取使用一个适当的软件这些肽的离子色谱图（XICs）。 （注意:对用于XICs提取软件的详细信息，请参阅3）。
    天。目测检查得到的XICs以识别所指示3的异构体产物的分离式双峰洗脱。 （注:在MS / MS鉴定的水平可以容易地发现通过在数据库中检索结果的两个不同的保留时间的存在被引导的那些肽的异构体产物。）
    即从每个脱酰胺位点/肽的异构体产物的相对定量具有基于在所获得的XICs每个识别出的异构体的峰面积进行。

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Results

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谷氨酰胺和天冬酰胺残基的脱酰胺化被认为在几种慢性和致命疾病14牵连退行性蛋白修饰（DPM）。已经证明，这种PTM可以预测的抗体和其他分子的半衰期和降解状态在人体内和相似的生物学背景1，15。蛋白质脱酰胺的意义，其实超越了生物医学的背景下，因此这种修改存在于不同的蛋白质组16,17和一些研究已经证实当时脱酰胺的潜力，进行绘画的准确约会和考古遗迹18，19 。虽然意义和不同背景的蛋白质脱酰胺的功能已经肯定了半天，再是直到最近在实现这一PTM 3的深入表征方式缺乏技术进步的。

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在该视频文章，我们提出LERLIC-MS / MS 3的步骤一步协议，一种方法来进行深入的表征和准确地确定蛋白质脱酰胺和涉及在此蛋白质修饰的酶过程的程度。 LERLIC-MS / MS是基于静电排斥亲水性相互作用色谱（ERLIC）27的原则下使用的长长度（50厘米）的LAX。使用长长度列，如在我们的研究3中所示，根据它们的等电点27 ERLIC的电位最大化到单独的肽。

LERLIC-MS / MS表示一个新颖猎枪一维分离的策略，即虽然它需要一个1200分钟梯度，如3中所指示，以获得对高度复杂蛋白质组最佳的结果样品处理过程中节省了时间上的手的工作流。甲60分钟gradien吨LERLIC-MS / MS还可以实现对模型化合物用于鸟枪蛋白质组学3中的第一时间谷氨酰胺的脱酰胺亚型的最佳分离。基于这两种应...

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Disclosures

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作者什么都没有透露。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

，新加坡（-OF-NMRC IRG-0003-2016），和NTU-NHG老化研究资助的国家医学研究理事会（:这项工作是在部分地由教育的新加坡教育部（授予ARC9 / 15级2）资助项目格兰特ARG / 14017）。我们想表达我们的感谢和最诚挚的感谢安德鲁·阿尔珀特博士和PolyLC团队亲切与成为可能这项研究包装材料提供给我们。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PolyCAT 3 和微型;m 100-& 阿林;（散装材料）PolyLC 公司特殊订购
长离子交换毛细管柱 50 cm - 200 µm IDPolyLC 公司特别订购
PEEKsil 管 1/16" 外径 x 200 µm ID x 50 cm 长Trajan Scientific Australia 下的 SGE 分析科学 620050
内螺纹对内螺纹接头，用于 1/16" 外径Upchurch ScientificUPCHF-125
内螺纹螺母，用于微铁Upchurch ScientificUPCHP-416
微铁Upchurch ScientificUPCHF-132
压力炸弹 NanoBaumeWestern Fluids EngineeringSP-400
岛津 Prominence UFLCsystem岛津Prominence UFLC
子弹头搅拌机Next AdvanceBBX24
安全锁管Eppendorf T9661-1000EA
不锈钢珠子。0.9 – 2.0 mm. 1 lb. 非无菌。Next AdvanceSSB14B
台式离心机 Hettich ZentrifugenRotina 380 R
标准数字加热循环浴槽，120VACPolyScience 8006 6L8006A11B
Sep-pack c18 脱盐滤芯 50 毫克WatersWAT020805
Vacumm 浓缩器Eppendorf 浓缩仪 Plus 系统
Dionex UltiMate 3000 UHPLC DionexUltiMate 3000 UHPLC 色谱柱 
Orbitrap Elite 质谱仪Thermo Fisher Scientific Inc.ORBITRAP ELITE
Michrom 热捕获喷雾 Michrom-Bruker 公司TCSI-SS2
培养箱 INCUCELL MMM 组INCUCELL111
级改良胰蛋白酶PromegaV5111
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片罗氏11836170001 （ROCHE）
磷酸盐缓冲溶液 10x（稀释至 1x）Sigma-AldrichP5493
醋酸铵Sigma-AldrichA1542
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750
二硫苏糖醇Sigma-AldrichD0632
碘乙酰胺Sigma-Aldrichi6125
甲酸Sigma-AldrichF0507 （霍尼韦尔）
氢氧化铵Sigma-Aldrich338818 （霍尼韦尔）
乙腈 HPLC 级Sigma-Aldrich675415
异丙醇 HPLC 级Sigma-Aldrich675431
Water HPLC 级Sigma-Aldrich14263
管 管 管 测序剂

References

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