LERLIC-MS / MS进行深入表征和谷氨酰胺的定量和天冬酰胺脱酰胺在鸟枪蛋白质组学

Summary

这里，我们提出的长条静电排斥亲水相互作用色谱 - 串联质谱（LERLIC-MS / MS）的方法的一个步骤一步协议。这是一种新的方法，使通过鸟枪蛋白质组学的谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺亚型的第一次定量和定性。

Abstract

蛋白质脱酰胺化的表征是势在必行破译在人体病理学和其他生化上下文该蛋白的翻译后修饰（PTM）的作用（S）和潜力。为了进行蛋白质脱酰胺的表征，我们最近开发了一种新型长条静电排斥亲水性相互作用色谱 - 串联质谱（LERLIC-MS / MS）方法，其可以分离谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（ASN）同种型脱酰胺的产物从模型化合物到高度复杂的生物样品。 LERLIC-MS / MS，因此，第一鸟枪蛋白质组学策略的Gln脱酰胺同种型的分离和定量。我们还证明，作为新颖性，在这里列出的样品处理方案稳定琥珀酰亚胺中间体允许由LERLIC-MS / MS表征。如图所示这个视频文章中LERLIC-MS / MS的应用可以帮助阐明目前不明蛋白质脱酰胺的n个分子阵列。此外，LERLIC-MS / MS提供了涵盖不同的生物学背景脱酰胺酶反应的进一步理解。

Introduction

脱酰胺是一种蛋白质翻译后修饰（PTM），通过天冬酰胺（ASN）和/或谷氨酰胺（Gln）残基¹的变形例引入了一个负电荷的蛋白质骨架。 1比^2:此修改而影响的Asn残基处的共同3生成异构产物异天冬氨酸（异Asp）和正 -天冬氨酸（ASP）。尽管如此，该比率可以通过修复酶L-isoaspartyl甲基^{（PIMT）3，4}的干预而改变。类似地，谷氨酰胺残基的脱酰胺化，生成以预期1异构γ-谷氨酸（γ-Glu），并且的α-谷氨酸亚型（α-GLU）:7的比例^3,5，但此比例可通过的作用而移普遍存在的酶的转谷氨酰胺酶2和其它转谷氨酰胺酶，转谷氨酰胺酶包括1，一个电子nzyme最近被确定为与大脑中的⁶外囊泡。

脱酰胺的起源可以是自发的或酶促的，前者是特别常见的谷氨酰胺残基，其中的转谷氨酰胺酶和其它酶通过转酰氨调解帧间/分子内交联（参见第³对谷氨酰胺酰氨进一步细节及其含义在几种慢性和致命人类疾病）。因此，脱酰胺是具有在所述结构上的一个关键反响和功能的影响分子<....

Protocol

1.包装长的长度阴离子交换（LAX）毛细管柱

（注意:虽然LAX列可以在家里装，因为我们在这个协议描述，LAX列也可购得，见材料与试剂的表的其他细节）。

1. 暂停50毫克弱阴离子交换包装材料的在3.5mL的包装缓冲器 （ 表1）以制备淤浆。
2. 组装该毛细管柱（50厘米长 - 200微米内径（ID）管）的端部使用一个母对阴配合，一个套圈和阴螺母。放置屏幕1/16" 1微米OD的孔尺寸的女性与阴配件内（注意:此处所用的屏幕必须具有更小的孔尺寸比包装材料的颗粒尺寸，以防止来自所述材料的泄漏柱）。
3. 包用在4500 PSI操作压力泵浆毛细管。 （注:打包coluMN，直到包装材料是在列的条目）可见。
4. 如在点1.2描述组装该毛细管柱的另一端。

2.样品制备

该协议概述LERLIC-MS / MS的应用程序来分析人类脑组织作为模型蛋白质组。 （注意:如果使用其它组织或蛋白质组样品中，样品制备程序应适应。）

1. 组织均匀化退火:
   一个。洗涤脑组织（50〜100毫克）与五分钟三次1×磷酸盐缓冲溶液。
   湾均质化的组织在1:1:2.5的组织/金属珠/ SDC匀浆缓冲液

Results

谷氨酰胺和天冬酰胺残基的脱酰胺化被认为在几种慢性和致命疾病¹⁴牵连退行性蛋白修饰（DPM）。已经证明，这种PTM可以预测的抗体和其他分子的半衰期和降解状态在人体内和相似的生物学背景^1，15。蛋白质脱酰胺的意义，其实超越了生物医学的背景下，因此这种修改存在于不同的蛋白质组^16,17和一些研究已经证实当时脱酰胺的潜力，进行绘画的准确约会和考古遗迹^18，19 。虽然意义和不同背景的蛋白质脱酰胺的功能已经肯定了半天，再是直到最近在实现这一PTM ³的深入表征方式缺乏技术进步的。

Discussion

在该视频文章，我们提出LERLIC-MS / MS ³的步骤一步协议，一种方法来进行深入的表征和准确地确定蛋白质脱酰胺和涉及在此蛋白质修饰的酶过程的程度。 LERLIC-MS / MS是基于静电排斥亲水性相互作用色谱^{（ERLIC）27}的原则下使用的长长度（50厘米）的LAX。使用长长度列，如在我们的研究³中所示，根据它们的等电点²⁷ ERLIC的电位最大化到单独的肽。

LERLIC-MS / MS表示一个新颖猎枪一维分离的策略，即虽然它需要一个1200分钟梯度，如^3中所指示，以获得对高度复杂蛋白质组最佳的结果样品处理过程中节省了时间上的手的工作流。甲60分钟gradien吨LERLIC-MS / MS还可以实现对模型化合物用于鸟枪蛋白质组学³中的第一时间谷氨酰胺的脱酰胺亚型的最佳分离。基于这两种应.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 和微型;m 100-& 阿林;（散装材料）	PolyLC 公司	特殊订购
长离子交换毛细管柱 50 cm - 200 µm ID	PolyLC 公司	特别订购
PEEKsil 管 1/16" 外径 x 200 µm ID x 50 cm 长	Trajan Scientific Australia 下的 SGE 分析科学	620050
内螺纹对内螺纹接头，用于 1/16" 外径	Upchurch Scientific	UPCHF-125
内螺纹螺母，用于微铁	Upchurch Scientific	UPCHP-416
微铁	Upchurch Scientific	UPCHF-132
压力炸弹 NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
岛津 Prominence UFLCsystem	岛津	Prominence UFLC
子弹头搅拌机	Next Advance	BBX24
安全锁管	Eppendorf	T9661-1000EA
不锈钢珠子。0.9 – 2.0 mm. 1 lb. 非无菌。	Next Advance	SSB14B
台式离心机	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
标准数字加热循环浴槽，120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 脱盐滤芯 50 毫克	Waters	WAT020805
Vacumm 浓缩器	Eppendorf	浓缩仪 Plus 系统
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC 色谱柱
Orbitrap Elite 质谱仪	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom 热捕获喷雾	Michrom-Bruker 公司	TCSI-SS2
培养箱 INCUCELL	MMM 组	INCUCELL111
级改良胰蛋白酶	Promega	V5111
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片	罗氏	11836170001 （ROCHE）
磷酸盐缓冲溶液 10x（稀释至 1x）	Sigma-Aldrich	P5493
醋酸铵	Sigma-Aldrich	A1542
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D0632
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	i6125
甲酸	Sigma-Aldrich	F0507 （霍尼韦尔）
氢氧化铵	Sigma-Aldrich	338818 （霍尼韦尔）
乙腈 HPLC 级	Sigma-Aldrich	675415
异丙醇 HPLC 级	Sigma-Aldrich	675431
Water HPLC 级	Sigma-Aldrich	14263