基于LERLIC-MS/MS的鸟枪法蛋白质组学中谷氨酰胺与天冬酰胺脱氨作用深度表征与定量分析

摘要

本文介绍了一种长程静电排斥-亲水相互作用色谱-串联质谱法（LERLIC-MS/MS）的逐步实验方案。该方法是一种新颖的技术，首次实现了通过鸟枪法蛋白质组学对谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺异构体进行定量分析和表征。

摘要

对蛋白质去酰胺化进行表征，对于揭示该蛋白质翻译后修饰（PTM）在人类病理学及其他生物化学背景中的作用和潜在功能至关重要。为了实现对蛋白质去酰胺化的表征，我们近期开发了一种新型的长程静电排斥-亲水相互作用色谱-串联质谱法（LERLIC-MS/MS），该方法能够从模型化合物到高度复杂的生物样本中分离谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）去酰胺化产生的异构体产物。因此，LERLIC-MS/MS是首个可用于分离和定量Gln去酰胺化异构体的 shotgun 蛋白质组学策略。我们还首次证明，本文所述的样品处理方案可稳定琥珀酰亚胺中间体，从而使其能够通过LERLIC-MS/MS进行表征。如本视频文章所示，LERLIC-MS/MS的应用有助于阐明当前尚未明确的蛋白质去酰胺化分子图谱。此外，LERLIC-MS/MS还进一步加深了对不同生物学背景下涉及去酰胺化的酶促反应的理解。

引言

脱酰胺是一种蛋白质翻译后修饰（PTM），通过修饰天冬酰胺（Asn）和/或谷氨酰胺（Gln）残基，在蛋白质主链上引入负电荷¹。该修饰作用于Asn残基时，会以约3:1的常见比例生成异构产物异天冬氨酸（isoAsp）和n-天冬氨酸（Asp）²。然而，这一比例可因修复酶L-异天冬氨酸甲基转移酶（PIMT）的作用而发生改变^3,4。类似地，Gln残基的脱酰胺反应以约1:7的比例生成异构的γ-谷氨酸（γ-Glu）和α-谷氨酸（α-Glu）^3,5，但该比例可因普遍存在的转谷氨酰胺酶2及其他转谷氨酰胺酶（包括最近被发现与脑内细胞外囊泡相关的转谷氨酰胺酶1）的作用而发生偏移⁶。

脱酰胺的来源可以是自发的或酶促的，前者 在谷氨酰胺残基上尤为常见，由转谷氨酰胺酶及其他酶介导 通过转酰胺作用实现分子间/分子内交联（参见 ³ 有关谷氨酰胺转氨作用及其在多种慢性及致命性人类疾病中影响的更多细节）。因此，脱酰胺是一种对受影响分子的结构和功能具有重要影....

方案

1. 装填长柱长阴离子交换（LAX）毛细管柱

（注意：尽管LAX色谱柱可按照本方案所述在家中自行填装，但LAX色谱柱也可商业购买，详见材料与试剂表中的进一步说明）。

1. 取50 mg弱阴离子交换填料，加入3.5 mL 装柱缓冲液（表1）中，制备成浆液。
2. 使用雌-雌接头、卡套和雌螺母组装毛细管柱的一端（柱长50 cm，内径200 µm）。将一片孔径为1微米、外径1/16"的筛板置于雌-雌接头内部。（注意：所用筛板的孔径必须小于填料粒径，以防止填料从柱中泄漏）。
3. 使用压力泵（压力为4,500 psi）将浆液装入毛细管柱中。（注意：持续装柱直至在柱入口处可见填料）。
4. 按照第1.2步所述方法组装毛细管柱的另一端。

2. 样品制备

本方案概述了应用 LERLIC-MS/MS 分析人脑组织作为模型蛋白质组的方法。（注意：若使用其他组织或蛋白质组样品，应相应调整样品制备步骤。）

1. 组织匀浆：
   a. 用1×磷酸盐缓冲液洗涤脑组织（50至100 mg），每次5分钟，重复三次。
   b. 在4 °C条件下，使用组织匀浆仪，在安全锁紧管中以最大强度将组织按1....

结果

谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）残基的脱氨作用被认为是一种与多种慢性及致命性疾病相关的变性蛋白质修饰（DPM）¹⁴。已有研究表明，这种翻译后修饰可用于预测抗体及其他分子在人体及类似生物环境中的半衰期和降解状态^1,15。实际上，蛋白质脱氨的意义不仅限于生物医学领域，因此该修饰广泛存在于多种蛋白质组中^16,17，一些研究还表明脱氨作用在对绘画作品和考古遗存进行精确定年方面具有潜在应用价值^18,19。尽管长期以来蛋白质脱氨在不同背景下的重要性和功能已得到确认，但直到最近，针对该翻译后修饰进行深入表征的技术手段仍长期缺乏进展³。

讨论

在本视频文章中，我们介绍了一种逐步操作的 LERLIC-MS/MS³ 实验方案，该方法可用于深入表征蛋白质去酰胺化修饰的程度，并准确确定参与该蛋白质修饰的酶促过程。LERLIC-MS/MS 基于使用长柱长（50 cm）的 LAX 柱，其分离原理为静电排斥-亲水相互作用色谱法（ERLIC）²⁷。如我们的研究所示³，采用长柱长色谱柱可最大限度地发挥 ERLIC 根据肽段等电点进行分离的潜力²⁷。

LERLIC-MS/MS 代表了一种新型的 shotgun 一维分离策略，该工作流程在样品处理过程中可节省大量手动操作时间，尽管在高度复杂的蛋白质组上获得最佳结果需要 1,200 分钟的梯度洗脱，如文献³所述。在 LERLIC-MS/MS 中，仅需 60 分钟梯度即可首次在 shotgun 蛋白质组学中实现模型化合物上 Gln 脱酰胺异构体的最佳分离

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PolyCAT 3 µm 100-Å（散装材料）	PolyLC Inc.	特殊订购
长型离子交换毛细管柱，50 cm - 200 µm 内径	PolyLC Inc.	特殊订购
PEEKsil 管，1/16" 外径 × 200 µm 内径 × 50 cm 长度	SGE Analytical Science（由澳大利亚Trajan Scientific提供）	620050
用于1/16" 外径管的雌-雌接头	Upchurch Scientific	UPCHF-125
微接头用雌螺母	Upchurch Scientific	UPCHP-416
微接头	Upchurch Scientific	UPCHF-132
压力炸弹 NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
岛津 Prominence UFLC 系统	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
安全锁扣管	Eppendorf	T9661-1000EA
不锈钢珠，0.9 – 2.0 mm，1磅，非无菌	Next Advance	SSB14B
台式离心机	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
标准数字加热循环浴，120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack C18 脱盐柱，50 mg	Waters	WAT020805
真空浓缩仪	Eppendorf	Concentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite 质谱仪	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	TCSI-SS2
培养箱 INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5111
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	11836170001 (ROCHE)
磷酸盐缓冲液 10x（稀释至1x）	Sigma-Aldrich	P5493
乙酸铵	Sigma-Aldrich	A1542
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D0632
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	i6125
甲酸	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
氢氧化铵	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
色谱纯乙腈	Sigma-Aldrich	675415
色谱纯异丙醇	Sigma-Aldrich	675431
色谱纯水	Sigma-Aldrich	14263