蛋白质-tRNA 琼脂糖凝胶阻滞分析法用于研究 N6苏氨酰氨甲酰腺苷 TcdA 功能

摘要

本文介绍了一种制备tRNA(UUU)以及通过琼脂糖凝胶阻滞实验分析tRNA(UUU)与酶TcdA形成复合物的方法。

摘要

我们展示了tRNA(UUU)的表达与纯化方法 大肠杆菌 并通过凝胶阻滞实验分析tRNA(UUU)与TcdA的结合情况 N⁶苏氨酰氨甲酰腺苷（t⁶A) 脱水酶，可使连接在tRNA反密码子茎环（ASL）中A37位点的苏氨酰氨甲酰侧链环化，形成环状t⁶A (ct⁶A) 编码tRNA(UUU)的合成基因的转录被诱导 E. coli 使用1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导，含tRNA的细胞在诱导后24小时收集。采用酸性酚抽提法纯化RNA组分。通过凝胶过滤层析获得纯化的tRNA，该方法可有效将小分子tRNA与较大尺寸的完整或片段化核酸分离。为分析TcdA与tRNA(UUU)的结合，将TcdA与tRNA(UUU)混合，并在4 °C下进行非变性琼脂糖凝胶电泳分离。游离的tRNA(UUU)迁移较快，而TcdA-tRNA(UUU)复合物因迁移率降低，在染色后可在凝胶中观察到滞留条带。我们证实TcdA是一种能够结合tRNA(UUU)的酶。该凝胶滞留实验可用于研究TcdA突变体以及添加剂和其他蛋白质对结合的影响。

引言

凝胶阻滞实验¹ （也称为电泳迁移率变动分析，EMSA）是一种用于研究和表征蛋白质-核酸相互作用的电泳方法。该方法可分析蛋白质-DNA以及蛋白质-RNA相互作用，尤其适用于tRNA与tRNA结合蛋白之间的相互作用，既可使用纯化的组分，也可使用复杂的蛋白质混合物例如，细胞裂解物）或核酸（例如tRNA 池）。我们已将凝胶阻滞实验应用于研究纯化的 tRNA(UUU) 与 TcdA 之间的相互作用，一种 N⁶苏氨酰氨甲酰腺苷（t⁶A) 脱水酶，可使连接在tRNA反密码子茎环（ASL）A37位点的苏氨酰氨甲酰侧链环化，形成环状t⁶ (ct⁶A)^2,3TcdA 也称为 CsdL^3,4。该 tcdA/csdL 基因与该基因形成一个簇 csdA 和 csdE 基因⁵，编码半胱氨酸脱硫酶和半胱氨酸亚磺酸脱硫酶（CSD）系统的硫受体，对维持TcdA功能至关重要 体内

方案

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本实验方案中使用的多种化学试剂具有毒性和腐蚀性。使用苯酚提取tRNA时，应采取适当的防护措施，包括在通风橱中操作，并佩戴个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。 等等）。本方案使用一种无毒的核酸染料。若使用其他染料，且该染料具有毒性或致癌性，则可能需要采取额外的预防措施，并对染色剂进行特殊处理。例如溴化乙锭

1. 琼脂糖凝胶的制备

1. 称取 2 g 琼脂糖，加入玻璃瓶中，用于制备 2% w/v 的琼脂糖凝胶。
2. 向含有琼脂糖的瓶中加入 100 mL 1× 硼酸-乙二胺四乙酸（EDTA）（TBE）电泳缓冲液，放入微波炉加热至溶解。每隔 30 秒取出摇匀，充分混匀，重复此步骤直至琼脂糖完全溶解。将琼脂糖溶液冷却至约 50–60 °C。
3. 用胶带封闭凝胶托盘的开口边缘以形成模具，插入合适的梳子以形成加样孔，然后倒入熔融的琼脂糖溶液。避免产生气泡，并在室温下静置使其完全凝固。
4. 待凝胶完全凝固后，将凝胶托盘放入电泳装置中，并加入 TBE 缓冲液至完全浸没凝胶。

2. tRNA 的制备

1. 表达tRNA(UUU) E. coli
   1. 早上，使用一....

结果

通过在强诱导型 T7 启动子控制下于 E. coli 中表达 tRNA 基因，可获得大量 tRNA(UUU)。表达的 tRNA(UUU) 在细胞质中积累，并在天然丰度 tRNA 池中富集。采用两步纯化流程——捕获/提取步骤和凝胶过滤/精制步骤——以获得适用于 EMSA 的高纯度 tRNA。捕获/提取步骤使用 pH 4.3 的苯酚，实现蛋白质、细胞碎片、DNA 的同时沉淀以及 tRNA（及其他 RNA 分子）的提取。在此步骤中，可通过 2% w/v 琼脂糖凝胶电泳评估总 tRNA 池的量。第二步采用凝胶过滤层析，根据 RNA 分子的大小进行分离。使用 254 nm 处的紫外吸收曲线监测分离过程并识别主要洗脱峰（图 1 顶部）。取代表性洗脱组分在 2% w/v 琼脂糖凝胶上进行电泳分析（图 1 底部）。大部分 tRNA 分子在层析过程中共洗脱于单一峰（中间峰）中（此处为 1.......

讨论

本文所述的蛋白质-tRNA 琼脂糖凝胶阻滞实验可通过多种方式进行修改。首先，可降低凝胶中琼脂糖的百分比，以便分离和观察明显大于本实验中分析的复合物（120 kDa）的蛋白质-tRNA 复合物。其次，若目标蛋白质具有热不稳定性，则必须采取额外预防措施，确保电泳装置的温度保持在可接受的最高温度以下，例如将电泳装置移至冷室，或在电泳槽内使用冰袋以迅速消散运行过程中产生的热量。其他缓冲液组成（例如，0.5X TB，三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐）和运行参数（> 20 V/cm）也可根据需要或样品的可接受性进行调整，以缩短运行时间¹¹。如果在样品制备过程中观察到 RNA 降解，可降低建议的 MgCl₂ 浓度，因为二价阳离子可能催化核酸的断裂。

该技术的主要局限性在于，蛋白质-tRNA 条带通常比基于丙烯酰胺的凝胶阻滞方法中的条带略为弥散，后者的条带通常更锐利、更清晰。另一个局限性是，若需同时分析多个样品，或分离不同大小和电荷的蛋白质-tRNA 复合物，则可能需要更宽、更长的凝胶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E. coli BL21(DE3)	Novagen	70235	DE3溶原菌在IPTG诱导后表达T7 RNA聚合酶。
pET23d	Novagen	69748-3	pET23d赋予氨苄青霉素抗性；含有T7启动子。
LB培养基（低盐，Lennox L培养基），颗粒状	Melford	GL1703	也可使用常规高盐LB培养基。
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	10419313
恒温摇床	NBS	Excella E24	任何具备温度控制功能的摇床培养箱均可使用。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），>=99%	Acros Organics	BP1755
乙酸钠，无水，>99%	Melford	B4017
乙二胺四乙酸（EDTA），二钠盐，>99%	Acros Organics	AC327205000	吸入后有害。
离心机（带制冷）	Eppendorf	5430
离心机转子（带制冷）	Eppendorf	5430/5430P
离心机	Sorvall	RC5C
离心机转子	Sorvall	SLA-3000
苯酚溶液，用0.1 M柠檬酸缓冲液饱和，pH 4.3 ± 0.2	Sigma-Aldrich	P4682	急性毒性（经口、经皮、吸入），具腐蚀性
分析纯无水乙醇，100% v/v	Merck Millipore	100983
磷酸氢二钠二水合物，Na2HPO4，>=99%	Sigma-Aldrich	71643
磷酸二氢钾，KH2PO4	Merck	48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75	GE Healthcare	28989333
琼脂糖	Melford	MB1200
Tris [三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐]	Melford	T1513
硼酸	Melford	B0503
微波炉	Haier	HDA-2070M
TCEP [三(2-羧乙基)膦盐酸盐]	Sigma-Aldrich	C4706	对金属和皮肤具有腐蚀性。
ATP [腺苷5′-三磷酸二钠盐水合物]，I级，>=99%	Sigma-Aldrich	A2383
氯化镁（MgCl2），无水，>=98%	Sigma-Aldrich	M8266
氯化钠（NaCl），>99%	Fisher Bioreagents	BP358
氯化钾（KCl），>99%	Melford	P0515
NZYDNA Ladder VI	NZYtech	MB8901
电泳电源	Consort	EV261
电泳装置	Real Laboratory	RELSMINI10
Real Safe核酸染料	Real Laboratory	RBMSAFE	20,000倍储存液
紫外透射仪（G:Box/EF）	Syngene	2216498
考马斯亮蓝G	Sigma-Aldrich	B0770
摇床（Gyro-Rocker）	Stuart	SSL3
涡旋混合器	Fisher brand	13214789