本文介绍了一种制备tRNA(UUU)以及通过琼脂糖凝胶阻滞实验分析tRNA(UUU)与酶TcdA形成复合物的方法。
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摘要
摘要
我们展示了tRNA(UUU)的表达与纯化方法 大肠杆菌 并通过凝胶阻滞实验分析tRNA(UUU)与TcdA的结合情况 N6苏氨酰氨甲酰腺苷（t6A) 脱水酶，可使连接在tRNA反密码子茎环（ASL）中A37位点的苏氨酰氨甲酰侧链环化，形成环状t6A (ct6A) 编码tRNA(UUU)的合成基因的转录被诱导 E. coli 使用1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导，含tRNA的细胞在诱导后24小时收集。采用酸性酚抽提法纯化RNA组分。通过凝胶过滤层析获得纯化的tRNA，该方法可有效将小分子tRNA与较大尺寸的完整或片段化核酸分离。为分析TcdA与tRNA(UUU)的结合，将TcdA与tRNA(UUU)混合，并在4 °C下进行非变性琼脂糖凝胶电泳分离。游离的tRNA(UUU)迁移较快，而TcdA-tRNA(UUU)复合物因迁移率降低，在染色后可在凝胶中观察到滞留条带。我们证实TcdA是一种能够结合tRNA(UUU)的酶。该凝胶滞留实验可用于研究TcdA突变体以及添加剂和其他蛋白质对结合的影响。
引言
凝胶阻滞实验1 （也称为电泳迁移率变动分析，EMSA）是一种用于研究和表征蛋白质-核酸相互作用的电泳方法。该方法可分析蛋白质-DNA以及蛋白质-RNA相互作用，尤其适用于tRNA与tRNA结合蛋白之间的相互作用，既可使用纯化的组分，也可使用复杂的蛋白质混合物例如，细胞裂解物）或核酸（例如tRNA 池）。我们已将凝胶阻滞实验应用于研究纯化的 tRNA(UUU) 与 TcdA 之间的相互作用，一种 N6苏氨酰氨甲酰腺苷（t6A) 脱水酶，可使连接在tRNA反密码子茎环（ASL）A37位点的苏氨酰氨甲酰侧链环化，形成环状t6 (ct6A)2,3TcdA 也称为 CsdL3,4。该 tcdA/csdL 基因与该基因形成一个簇 csdA 和 csdE 基因5，编码半胱氨酸脱硫酶和半胱氨酸亚磺酸脱硫酶（CSD）系统的硫受体，对维持TcdA功能至关重要 体内3.
凝胶阻滞实验的原理在于，游离的核酸分子由于带有强烈的负电荷，能够快速迁移至聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶的前沿；而相同核酸与蛋白质形成的复合物，其电泳迁移率则显著降低。这种迁移率的降低表现为一条 "移位" 在核酸-蛋白质复合物中，这些复合物在凝胶上呈现为清晰的条带。带正电荷且分子量较大的核酸-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率降低更显著，表现出更大的迁移偏移。
由于复合物的电荷中和是蛋白质-核酸复合物的普遍现象，凝胶阻滞实验可广泛应用于多种复合物和核酸类型。该方法简单、经济，仅需配备基本设备的实验室即可开展。实验仅需少量蛋白质和tRNA，相较于其他通常消耗更多样品的生物物理技术，具有明显优势。
凝胶阻滞实验已广泛用于转录因子的研究。该实验可用于分析转录因子与多种不同DNA序列结合的动力学、结合强度及特异性。事实上，电泳迁移率变动实验（EMSA）最初正是在这一领域发展起来的6,7。使用RNA8,9,10,11和tRNA分子的凝胶阻滞实验也已被应用于核糖体研究，以及分析如本文所述的在转录后修饰tRNA核苷的酶类。
多种不同参数会影响凝胶阻滞实验的结果，例如温度、蛋白质和tRNA样品的质量以及结合强度。实验的周密规划与严谨操作对于正确解读游离核酸与蛋白质结合物种的结果至关重要。在此，我们使用了将编码tRNA(UUU)的合成基因克隆至表达载体中的系统，该载体的启动子缺少Shine-Dalgarno核糖体结合位点，从而能够大量合成tRNA2。本详细实验方案旨在为开展tRNA凝胶阻滞实验提供清晰指导，并帮助避免常见错误。
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方案
注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本实验方案中使用的多种化学试剂具有毒性和腐蚀性。使用苯酚提取tRNA时，应采取适当的防护措施，包括在通风橱中操作，并佩戴个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。 等等）。本方案使用一种无毒的核酸染料。若使用其他染料，且该染料具有毒性或致癌性，则可能需要采取额外的预防措施，并对染色剂进行特殊处理。例如溴化乙锭
1. 琼脂糖凝胶的制备
- 称取 2 g 琼脂糖，加入玻璃瓶中，用于制备 2% w/v 的琼脂糖凝胶。
- 向含有琼脂糖的瓶中加入 100 mL 1× 硼酸-乙二胺四乙酸（EDTA）（TBE）电泳缓冲液，放入微波炉加热至溶解。每隔 30 秒取出摇匀，充分混匀，重复此步骤直至琼脂糖完全溶解。将琼脂糖溶液冷却至约 50–60 °C。
- 用胶带封闭凝胶托盘的开口边缘以形成模具，插入合适的梳子以形成加样孔，然后倒入熔融的琼脂糖溶液。避免产生气泡，并在室温下静置使其完全凝固。
- 待凝胶完全凝固后，将凝胶托盘放入电泳装置中，并加入 TBE 缓冲液至完全浸没凝胶。
2. tRNA 的制备
- 表达tRNA(UUU) E. coli
- 早上，使用一管冷冻的 E. coli 表达载体 pET23d-EcUUU 转化的 BL21(DE3)2 （含有编码该基因） E. coli tRNA(UUU))，在添加了100 µg/mL氨苄青霉素的低盐Luria肉汤（LB）平板上划线。将平板倒置，放入37 °C培养箱中培养至菌落出现（傍晚）。
- 将一个生长良好的单菌落接种于5 mL LB培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素）中，于37 °C、220 rpm条件下过夜培养。
- 次日早晨，将细胞离心（4 °C，6,500 × g，10 分钟），弃上清，加入 5 mL 新鲜 LB 培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）重悬细胞。取该菌悬液接种于 200 mL LB 培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）中，于 37 °C、220 rpm 振荡培养 5 小时。
- 当培养物在 590 nm 处的光密度（OD590当菌液浓度达到 0.6 - 0.8 时，向培养物中加入 1 mM IPTG 以诱导 tRNA(UUU) 基因表达。在 37 °C 下孵育 3 小时。
- 在 4 °C 条件下，以 6,500 x g 离心 10 分钟收集细胞。
- 裂解与提取
- 将细胞沉淀重悬于5 mL裂解缓冲液（0.3 M醋酸钠，10 mM EDTA）中。此后，使用经高压灭菌的缓冲液，并将所有含tRNA的样品置于4 °C保存，以防止tRNA降解。
- 在通风橱中，向重悬的细胞沉淀中加入1体积酸性酚（pH 4.3）。颠倒混匀1分钟以裂解细胞，然后在4 °C下于10,000 × g离心10分钟。
- 使用移液器收集上层水相，其中含有可溶性tRNA(UUU)（以及其他tRNA池的较低浓度成分），注意避免吸入有机相（下层）。将下层有机相及含有细胞碎片的沉淀弃入适当的容器中。
- 通过将可溶性（水相）部分与2.5体积的100% v/v乙醇充分混合，并于4 °C颠倒孵育1小时，使tRNA沉淀。随后在4 °C下以15,000 × g离心30分钟。
- 小心倾去上清液，将富含tRNA的沉淀重悬于4 mL凝胶过滤缓冲液（20 mM磷酸钠或磷酸钾，pH 7.4，0.1 mM EDTA）中。取5 µL重悬的tRNA混合物，在2%（w/v）琼脂糖凝胶上进行电泳。
注意：高质量的tRNA表现为单一条带（分子大小在50-100 bp之间）。
- tRNA(UUU)的纯化
- 遵循标准的色谱操作规范12将重悬的tRNA(UUU)上样至预先用凝胶过滤缓冲液（流动相）平衡的高分辨率制备型凝胶过滤柱（柱尺寸：16 × 600 mm，柱床体积：120 mL，分离范围：1,000–70,000 Da）。设置流速为1 mL/min以洗脱样品。
注意：tRNA(UUU) 峰的洗脱体积约为 75.5 mL。通常每升培养液可获得 0.5–1.0 mg 的 tRNA。 - 通过在2% w/v琼脂糖凝胶上电泳各5 - 10 µL样品，于代表性洗脱体积下分析样品。
- 遵循标准的色谱操作规范12将重悬的tRNA(UUU)上样至预先用凝胶过滤缓冲液（流动相）平衡的高分辨率制备型凝胶过滤柱（柱尺寸：16 × 600 mm，柱床体积：120 mL，分离范围：1,000–70,000 Da）。设置流速为1 mL/min以洗脱样品。
3. 样品制备
- 根据 López-Estepa et al.2 的方法表达并纯化 TcdA。
注意：本研究最多可使用 250 µM 的 TcdA。 - 根据 表1 将相应体积的 TcdA 加入已正确标记的 1.5 mL 离心管中。加入 1.6 mM tris(2-羧乙基)磷（TCEP）（终浓度），并用移液器轻轻混匀。盖紧管盖，在室温下孵育 5 分钟。
- 加入 10 µM 三磷酸腺苷（ATP）和 50 mM MgCl2（终浓度）。用移液器混匀后，在室温下孵育 5 分钟。
- 根据 表1 加入纯化的 tRNA(UUU)（第 2.3 节），用移液器混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
- 加入磷酸盐缓冲液（PBS）至终体积为 100 µL。充分混匀后，加入甘油至终浓度为 10% v/v。
- 涡旋震荡样品，然后短暂离心（10,000 × g，1 分钟，4 °C）使管内液体沉降至管底。
4. 凝胶加样与电泳过程
- 将电泳装置放入装有碎冰的托盘中，以在电泳过程中保持电泳槽温度为 4 °C。
- 小心地用移液器将每个样品 5 µL 加入相应的加样孔中，并加入合适的 DNA 分子量标记物。
- 将电极插入电源装置对应的插槽中。打开电源装置，将电压设为 100 V，电泳运行 90 分钟。
5. 凝胶染色以观察 tRNA-蛋白质相互作用
- 通过将 50 mL TBE 与 1x 浓度的合适 DNA 染料混合来配制染色液。用铝箔覆盖染色容器，避免染色液暴露于阳光下。
注意：DNA 染料通常以 10,000 或 20,000x 浓缩液形式储存。 - 电泳 90 分钟后，小心地将凝胶从托盘中取出，并放入盛有染色液的容器中。在室温下置于摇床上，以低速摇动染色 30 分钟。
- 从染色容器中取出琼脂糖凝胶，轻轻在纤维素纸或滤纸上轻拍以去除多余液体，然后直接放置在透射仪上。打开紫外光以观察含有 tRNA 的条带，并拍摄凝胶图像。
- 蛋白质染色（可选）。
- 按照安全规程妥善弃置 DNA 染色液，并替换为 50 mL 考马斯亮蓝（CBB）溶液。将托盘置于摇床上，在室温下染色过夜（>12 小时）。弃去 CBB 染色液，加入 50 mL PBS 以去除多余的染料。在摇床上脱色 1 小时。
- 在白光透射仪下观察含有蛋白质的 tRNA 复合物，并拍摄凝胶照片，与 tRNA 的紫外凝胶图像进行比较。
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结果
通过在强诱导型 T7 启动子控制下于 E. coli 中表达 tRNA 基因，可获得大量 tRNA(UUU)。表达的 tRNA(UUU) 在细胞质中积累，并在天然丰度 tRNA 池中富集。采用两步纯化流程——捕获/提取步骤和凝胶过滤/精制步骤——以获得适用于 EMSA 的高纯度 tRNA。捕获/提取步骤使用 pH 4.3 的苯酚，实现蛋白质、细胞碎片、DNA 的同时沉淀以及 tRNA（及其他 RNA 分子）的提取。在此步骤中，可通过 2% w/v 琼脂糖凝胶电泳评估总 tRNA 池的量。第二步采用凝胶过滤层析，根据 RNA 分子的大小进行分离。使用 254 nm 处的紫外吸收曲线监测分离过程并识别主要洗脱峰（图 1 顶部）。取代表性洗脱组分在 2% w/v 琼脂糖凝胶上进行电泳分析（图 1 底部）。大部分 tRNA 分子在层析过程中共洗脱于单一峰（中间峰）中（此处为 1...
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讨论
本文所述的蛋白质-tRNA 琼脂糖凝胶阻滞实验可通过多种方式进行修改。首先，可降低凝胶中琼脂糖的百分比，以便分离和观察明显大于本实验中分析的复合物（120 kDa）的蛋白质-tRNA 复合物。其次，若目标蛋白质具有热不稳定性，则必须采取额外预防措施，确保电泳装置的温度保持在可接受的最高温度以下，例如将电泳装置移至冷室，或在电泳槽内使用冰袋以迅速消散运行过程中产生的热量。其他缓冲液组成（例如，0.5X TB，三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐）和运行参数（> 20 V/cm）也可根据需要或样品的可接受性进行调整，以缩短运行时间11。如果在样品制备过程中观察到 RNA 降解，可降低建议的 MgCl2 浓度，因为二价阳离子可能催化核酸的断裂。
该技术的主要局限性在于，蛋白质-tRNA 条带通常比基于丙烯酰胺的凝胶阻滞方法中的条带略为弥散，后者的条带通常更锐利、更清晰。另一个局限性是，若需同时分析多个样品，或分离不同大小和电荷的蛋白质-tRNA 复合物，则可能需要更宽、更长的凝胶。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
MCV 是 CIB 所内计划“改善生命分子机器”（MACBET）的成员。本研究的开展获得了西班牙卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）资助（项目编号 PI12/01667，授予 MCV）、西班牙经济与竞争力部（Ministerio de Economía y Competitividad）资助（项目编号 CTQ2015-66206-C2-2-R 和 SAF2015-72961-EXP，授予 MCV）、马德里地区政府资助（项目编号 S2010/BD-2316，授予 MCV）以及欧洲委员会第七框架计划（FP7）项目 ComplexINC（合同编号 279039，授予 MCV）的支持。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3溶原菌在IPTG诱导后表达T7 RNA聚合酶。 |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d赋予氨苄青霉素抗性；含有T7启动子。 |
| LB培养基（低盐，Lennox L培养基），颗粒状 | Melford | GL1703 | 也可使用常规高盐LB培养基。 |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| 恒温摇床 | NBS | Excella E24 | 任何具备温度控制功能的摇床培养箱均可使用。 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），>=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| 乙酸钠，无水，>99% | Melford | B4017 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA），二钠盐，>99% | Acros Organics | AC327205000 | 吸入后有害。 |
| 离心机（带制冷） | Eppendorf | 5430 | |
| 离心机转子（带制冷） | Eppendorf | 5430/5430P | |
| 离心机 | Sorvall | RC5C | |
| 离心机转子 | Sorvall | SLA-3000 | |
| 苯酚溶液，用0.1 M柠檬酸缓冲液饱和，pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | 急性毒性（经口、经皮、吸入），具腐蚀性 |
| 分析纯无水乙醇，100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| 磷酸氢二钠二水合物，Na2HPO4，>=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| 磷酸二氢钾，KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| 琼脂糖 | Melford | MB1200 | |
| Tris [三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐] | Melford | T1513 | |
| 硼酸 | Melford | B0503 | |
| 微波炉 | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [三(2-羧乙基)膦盐酸盐] | Sigma-Aldrich | C4706 | 对金属和皮肤具有腐蚀性。 |
| ATP [腺苷5′-三磷酸二钠盐水合物]，I级，>=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 氯化镁（MgCl2），无水，>=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 氯化钠（NaCl），>99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| 氯化钾（KCl），>99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| 电泳电源 | Consort | EV261 | |
| 电泳装置 | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe核酸染料 | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000倍储存液 |
| 紫外透射仪（G:Box/EF） | Syngene | 2216498 | |
| 考马斯亮蓝G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| 摇床（Gyro-Rocker） | Stuart | SSL3 | |
| 涡旋混合器 | Fisher brand | 13214789 |
参考文献
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- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606(2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
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- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
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- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).
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