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基于心肌细胞的执行器与自稳定生物机器人——第二部分

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DOI：

10.3791/55643

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2017年5月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Aerospace and Mechanical Engineering, Bioengineering Graduate Program, University of Notre Dame, 2Division of Electrical and Computer Engineering, Louisiana State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究中，将心肌细胞接种于具有功能化弹性悬臂臂的生物驱动器及自稳定游动生物机器人上，进行培养，并随时间对其生物化学和生物力学特性进行表征。

摘要

近年来，人们开发出由活细胞或组织组分与合成机械骨架整合而成的混合装置。这类装置被称为生物机器人，其动力完全来源于活体组分收缩活动所产生的力，由于具有多种内在优势，有望成为传统全人工机器人的替代方案。本文描述了在本系列文章第一部分中已完成设计、制备和功能化的生物致动器及生物机器人装置的细胞接种与表征方法。所制备的生物致动器和生物机器人装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底和薄膜悬臂梁构成，并通过纤连蛋白处理实现细胞黏附功能化。功能化后，将新生大鼠心肌细胞以高密度接种至PDMS悬臂梁上，形成融合的细胞单层。每日对装置进行成像，并分析悬臂梁的运动情况。接种后第二天，观察到细胞自发收缩所产生的力导致悬臂梁发生弯曲。通过对悬臂梁弯曲的定量分析，发现随着细胞随时间成熟，其施加的表面应力逐渐增加。同样，我们观察到由于PDMS悬臂梁（作为鳍状结构）的驱动作用，生物机器人产生运动。通过对装置游动特征的量化分析，观察到多种推进模式，这些模式受鳍的静息角度影响。运动方向和搏动频率也由鳍的静息角度决定，最大游动速度达到142 µm/s。在本论文中，我们详细描述了将心肌细胞接种至制备好的装置上的操作流程，以及对生物致动器和生物机器人活性进行评估的方法。

引言

生物机器人是基于活细胞的装置，这些细胞被整合在通常由软性弹性材料（如聚二甲基硅氧烷（PDMS）或水凝胶）构成的机械骨架中1。这些细胞会自发地或在刺激下发生节律性收缩，从而发挥驱动器的作用。细胞收缩产生的动力可驱动多种生物机器人。由于具有收缩特性，哺乳动物的心肌细胞和骨骼肌细胞常被用于生物机器人的驱动。除了心肌细胞和骨骼肌细胞外，其他类型的细胞，如昆虫肌肉组织2和离体肌肉组织3，也已被使用。昆虫肌肉组织能够在室温下实现生物驱动器的运行。

生物机器人功能与性能主要取决于生物执行器的强度和稳定性即 肌肉细胞），而机械骨架结构主要决定了运动、稳定性和动力的机制。由于这些装置完全由细胞产生的力驱动，因此不会产生化学污染物或运行噪音，从而成为比其他传统机器人更节能的替代方案。已有多种文献探讨了将活细胞和组织整合到生物机器人中的不同方法。1,4,5微加工和组织工程技术的进步使得能够行走、抓握、游泳或泵送的生物机器人得以开发5,6通常，细胞直接培养在机械性（聚合物）支架上形成融合的细胞层，或在支架内被塑造成三维驱动结构，如环状或条状结构。生物机器人大多使用心肌细胞层制备。6,7，因为这些细胞具有无需外部刺激即可自发收缩的内在能力。另一方面，由于骨骼肌细胞需要外界刺激才能引发收缩，有关骨骼肌细胞片层的报道较为有限 体外 以启动膜去极化8.

本方案首先描述了如何将心肌细胞接种到由薄层PDMS悬臂梁制成的功能化生物驱动器上。随后详细介绍了接种过程及游泳曲线的分析方法。该悬臂梁经细胞黏附蛋白（如纤连蛋白）功能化处理，并完全接种心肌细胞。当接种在装置上的细胞发生收缩时，会引起悬臂梁弯曲，从而发挥驱动作用。随着时间推移，细胞逐渐成熟，我们通过分析悬臂梁弯曲的视频来追踪装置表面应力的变化。此处开发的生物驱动器可用于测定任何类型细胞（如成纤维细胞或诱导性多能干细胞）在分化过程中的收缩特性。

早期关于生物机器人（biorobot）的研究大多集中在开发生物驱动器上，而对生物机器人结构设计和功能特性的优化则长期被忽视。最近，少数研究展示了受自然界启发的生物机器人游泳模式的实现。例如，已成功构建出基于鞭毛运动6、水母推进9以及生物混合射线结构4的游动型生物机器人。与文献中其他研究不同，本文聚焦于通过改变机械骨架的特性来构建一种自稳定结构。本研究开发的生物机器人能够在游动过程中保持恒定的俯仰角、滚动角和浸没深度。这些参数可通过调节各基底复合材料的厚度进行调控。聚二甲基硅氧烷（PDMS）驱动器的制备、可潜行生物机器人的构建以及设备功能化所涉及的制造步骤，已在本系列文章的第一部分以及我们近期的工作中进行了详细描述7。本文所发展的技术有望为开发用于多种应用场景（如货物递送）的新型高效生物机器人开辟道路。

本研究中采用的分离过程与先前研究10以及近期发表的工作7中描述的方法相似。用于制备PDMS驱动器和生物机器人装置的微加工方法在本两部分系列论文的第一部分中有详细描述。本文的实验方案部分介绍了在PDMS驱动器和生物机器人经细胞黏附蛋白功能化后，将其接种心肌细胞的具体步骤。

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方案

本文所述所有操作均依据已批准的方案，并遵循圣母大学机构动物护理与使用委员会的法规进行。

1. 细胞接种与培养

  1. 开始前，准备好所需物品：小漏斗、移液器，以及添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素抗生素的温热杜氏改良伊格尔培养基（DMEM完全培养基）。
  2. 取出含有功能化装置（生物致动器或生物机器人）的T-25培养瓶。有关装置制备、功能化处理及细胞接种前储存的详细信息，请参见本两部分论文第一部分的第4节。
  3. 准备一个漏斗，可通过卷起一小块方形塑料片制成。将其放置在T-25培养瓶内的生物致动器或生物机器人上方。调整漏斗较宽一端的直径，使其完全覆盖装置，并调节高度，确保在拧紧瓶盖时漏斗能紧密贴合。
    1. 对于生物机器人，在整个接种过程中使用磁铁将装置固定在培养瓶底部。
      注意： 此处使用了一个直径为1.26英寸的钕铁硼圆盘磁铁，但任何尺寸和磁力相似的磁铁均可用于固定带有磁性镍-PDMS复合基底的生物机器人。
    2. 使用前，将塑料片进行至少30分钟的紫外灭菌处理。
  4. 确保漏斗底部与培养瓶之间无较大缝隙。
  5. 将心肌细胞重悬于DMEM完全培养基中，细胞密度为1.6 × 107 个/mL，并通过漏斗缓慢滴加400 µL细胞悬液至装置上。使用血细胞计数板或其他细胞计数仪确定所获得的细胞数量。
  6. 缓慢将整个系统放回培养箱中，避免扰动装置和漏斗。在37 °C条件下培养24小时。
  7. 培养结束后，缓慢移除漏斗，用PBS轻轻清洗样品，并向培养瓶中补充10 mL新鲜的DMEM完全培养基。
    注意： 对于生物机器人，需移除磁铁，使装置处于悬浮状态。

2. 生物化学表征

  1. 钙流检测
    注意：钙流检测用于评估细胞间的连接性。用荧光性、钙离子特异性染料对细胞进行负载的操作步骤遵循先前已建立的方案11。
    1. 首先，准备好所需材料：钙黄绿素-4-乙酰甲酯（AM）酯、非离子型表面活性剂多元醇（见材料表）以及台氏盐溶液。
    2. 使用长镊子将装置从培养瓶中轻轻转移至含有2 mL台氏盐溶液的35 mm培养皿中。
    3. 在另一个离心管中，取1 mL预热至37 °C的温热台氏盐溶液，加入3–5 µL储备液钙黄绿素-4 AM染料（工作浓度：3–5 µM）和等量的非离子型表面活性剂多元醇（工作浓度：0.2 %）。用含有钙离子指示染料fluo-4和0.2%非离子型表面活性剂的温热台氏盐溶液替换样品中的溶液，在37 °C下孵育25–30分钟。
    4. 移除染料溶液，并用新鲜的台氏盐溶液轻轻洗涤样品。成像前，在2 mL新鲜完全DMEM培养基中再次孵育30分钟，温度为37 °C。
      注意：该检测的结果及相关视频已在先前发表的研究中提供7。
  2. 免疫荧光染色
    注意：所有样品的双重免疫染色均按照先前已建立的方案进行12。
    1. 首先，配制以下试剂：磷酸盐缓冲液（PBS）中含10%山羊血清（GS）、去离子水（diH2O）中含4%多聚甲醛（PFA）、PBS中含0.1%细胞裂解去垢剂（见材料表）、一抗（抗小鼠单克隆抗体心肌肌钙蛋白I和抗兔单克隆抗体连接蛋白43）、二抗（Alexa 594标记抗体和山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa 488标记抗体）以及DAPI。
      注意：多聚甲醛具有致癌性。
    2. 从培养瓶中取出目标样品，并用PBS轻轻洗涤两次。有关样品制备与功能化的详细信息，请参见本两部分论文第一部分的第4节。
    3. 在小盖玻片（直径：12 mm或15 mm）上滴加一滴PBS。用镊子轻轻夹住装置底部，用剪刀从连接底座顶部的一端剪断薄PDMS臂（悬臂，图1）。将带有细胞附着面朝上的悬臂转移至液滴中。PBS液滴可防止细胞干燥。
    4. 使用4% PFA固定样品，并如前所述进行双重免疫染色12。
    5. 免疫染色完成后，使用抗荧光淬灭封片剂将样品封固于洁净的载玻片上，置于黑暗环境中静置24小时。
    6. 对所有样品重复上述操作。
      注意：该检测的结果及相关图像在先前发表的研究中已有深入讨论7。

3. 成像

  1. 将T-25培养瓶直立放置于CO2培养箱中，并在培养箱内准备成像系统。使用配备变焦镜头的相机（见材料表）对设备进行拍摄（见材料表）。光源采用LED灯带。
    注意：此处使用了白光LED灯带，但任何普通LED灯均可使用。
  2. 将相机连接至操作系统，并打开相机专用软件（见材料表）。在顶部面板的“文件”选项卡下点击相机图像，以打开所有相机选项，并选择正确的相机。
  3. 在软件界面顶部面板的选项卡列表中选择“实时”模式。
  4. 通过调节镜头旋钮手动对图像进行对焦。在顶部面板中选择“裁剪至感兴趣区域（ROI）”，然后在视频画面中手动绘制一个矩形框，将生物驱动装置及其悬臂臂包含在内，以标记感兴趣区域。
    注意：选择合适的感兴趣区域可最小化图像文件的大小。
    1. 对于生物机器人，应捕获整个屏幕画面，以记录装置的游动运动。
      注意：生物机器人无需绘制感兴趣区域
  5. 开始录制前，在屏幕顶部面板的选项卡中选择“相机设置”。通过滑动滑块或手动输入数值，调节实时图像的曝光时间和像素比，以设定帧率。将帧率设置为约30 ± 2 fps。
    注意：更改曝光时间和像素比会改变实时图像的亮度和对比度。
  6. 在软件界面顶部面板点击“录制”按钮，开始以1,000 × 1,000像素分辨率精确录制30秒的驱动器视频。对所有样品重复此过程。

4. 固定基底上生物驱动器的图像分析

  1. 使用编程软件分析图像（例如， Matlab) 运行自定义脚本。参见 材料表 以及 补充文件 有关更多详细信息。
    注意： 该脚本显示录制视频的每一帧，接收用户鼠标输入以记录图像上悬臂各点的坐标，通过最小二乘法拟合计算经过输入点的圆的直径和圆心，并导出所有输入及计算得到的数据以供进一步使用。
    1. 单击图标以打开编程软件。单击 "文件" -> "开放" 从顶部菜单栏中选择用于图像分析的 .m 脚本文件。确保记录的 TIFF 图像与 .m 文件位于同一文件夹中。点击 "运行" 运行脚本。
      注意： 将弹出一个交互式界面以进行修改。
    2. 按压 "播放" 启动实际程序。单击 "开放" 按钮并定位将要分析的TIFF文件。
    3. 点击 "基底" 按钮，然后单击悬臂在顶部与基底连接的位置；按回车键。这将在每帧图像上放置一个方形标记，以指示悬臂基底的位置。
    4. 点击 "量程" 按钮，然后手动点击玻璃珠的一侧边缘。将鼠标指针移至玻璃珠的对侧，按下 "输入。"
      注意： 这将绘制一条测量玻璃珠直径的线。由于玻璃珠的直径为3 mm，因此可将3 mm与显示的像素对应起来。
    5. 点击 "分析" 按钮。在靠近代表悬臂梁基部的第一个方形标记的附近，沿悬臂梁点击。
    6. 点击“分析”按钮，然后在靠近代表悬臂梁基部的第一个方形标记的附近位置，沿悬臂梁依次点击。继续沿悬臂梁点击，包括其尖端，完成后按回车键。这将在悬臂梁上每个被点击的位置标记一个“x”。
      注意： 根据方形标记和 x 形标记的坐标，将使用最小二乘法拟合函数计算圆的中心和直径（参见所附补充文件中的脚本）。该圆将通过 x 形标记和方形标记，并自动叠加到图像上。
    7. 检查叠加的圆是否正确地描出了悬臂梁的轮廓。
      注意： 当悬臂非常平坦时，很难判断悬臂轮廓是否被正确追踪。参考 图3.
    8. 点击 "下一帧" 按钮。这将切换到 TIFF 文件的下一帧。基线和比例尺已从上一步骤中设置好。
    9. 重复步骤 4.1.5 至 4.1.7，直至完成 TIFF 文件中的所有帧。所有帧处理完毕后，单击 "导出" 按钮
      注意： 这将生成一个电子表格文件，文件名为刚刚分析的悬臂梁对应的TIFF文件名。请编辑文件名，以包含所分析的悬臂梁侧边信息（左侧或右侧）。
  2. 在电子表格中计算应力。
    1. 计算表面应力， "σ," 使用以下公式计算悬臂上的结果：
      figure-protocol-1
      其中 E、R、 v，h 分别为杨氏模量、曲率半径、泊松比和悬臂梁厚度。
      注意： 悬臂梁的厚度可以调整以改变其灵敏度。本研究中，参数值如下：E = 750 kPa，v = 0.49，h = 25 µm13,14.
    2. 使用4.2.1步骤中的公式计算表面应力。打开.xls电子表格文件。注意输出包含多列数据，首先显示基底和圆的x和y坐标，然后是曲率半径。根据这些数据计算所点击每个点的x和y坐标。
      注意： 将应力绘制在延时图像帧上，可显示悬臂梁所受作用力随时间的变化。波谷表示心肌细胞松弛期间或细胞牵引力在悬臂梁上产生的静态应力，波峰表示心肌细胞搏动时在悬臂梁上产生的动态应力，该值对应心肌细胞收缩所产生的最大作用力。

5. 游动生物机器人分析

  1. 使用图像分析软件记录生物机器人所在位置。
    注意： 参见材料清单中列出的本节所用软件。
    1. 打开图像分析软件（例如， ImageJ）。按下 "文件" 和 "开放" 并选择游泳生物机器人视频文件。点击 "好的" 并让程序加载文件。打开电子表格软件。
    2. 在加载的生物机器人视频中，找到一个已知尺寸的参照物（例如， 直径为3 mm并嵌入生物致动器中的玻璃珠。
      注意： 任何具有已知尺寸的物体均可使用。这将用于确定每个视频中像素与长度的比例关系。
    3. 使用 "直的" 用于在玻璃珠上绘制线条的工具。点击 "分析" 并选择 "设定比例尺。" 设置 "已知距离" 领域到 "3,000 µm" 并单击 "好的。"
      注意： 这将把 x 和 y 坐标设置为微米。
    4. 选择设备上在各帧之间无晃动的点作为标记点。
      注意： 建议选择基座的一个角落。
    5. 指向第5.1.4节中第一帧的选定位置。在电子表格中记录x和y坐标。
    6. 切换回图像分析软件窗口，按右箭头键切换到下一帧。再次指向标记点（步骤 5.1.4 中的标记），并在电子表格中记录 x 和 y 坐标。
    7. 对所有帧重复步骤 5.1.6。
  2. 使用坐标电子表格计算生物机器人的游泳参数7.
    1. 根据每个视频的已知帧率计算帧间周期。
    2. 计算帧间 x 和 y 坐标的变化以确定移动距离，包括总距离。
    3. 根据y轴上的最大变化值计算收缩幅度。通过两个收缩周期之间时间间隔的倒数，确定每个生物机器人的心跳频率。
    4. 根据每个装置在 x 方向上的总移动时间和移动距离，计算其游泳速度。
    5. 对每个已分析的生物机器人视频重复步骤 5.2。
    6. 对每个测量参数进行归一化处理。
      注意： 将所有数值进行归一化处理，以更清晰地展示差异。本方案展示了相对于具有低频收缩的水平模式仿生机器人（horizontal LF）的归一化方法。图4)7.

6. 蛋白质表达分析

注意： 在步骤 2.2.4 和 2.2.5 中制备的封片样品使用共聚焦显微镜进行成像。图像在三个通道（460 nm、488 nm 和 594 nm）中同时采集，放大倍数依次为 20X、40X 和 60X。每个样品在不同位置以 40X 放大倍数采集一组 5 张图像，每个通道保存为单独的 .TIFF 文件。曝光参数根据所用物镜的放大倍数确定，并在该放大倍数下所有图像采集过程中保持恒定。

  1. 打开图像分析软件并选择 "文件" -> "开放" 加载图像。
  2. 在图像帧上绘制一个矩形多边形以标记感兴趣区域（ROI）。选择 "分析" -> "测量" 用于测量平均荧光强度。
  3. 重复步骤6.2，从所有样本中收集强度测量值，并计算每种条件下的平均强度。
    注意： 此处，不同条件指的是不同的时间点，即第1天、第2天，直至第6天。
  4. 将结果导出至电子表格，以便进行进一步的统计分析和数据图绘制。

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结果

由薄PDMS悬臂（厚度为25 µm）和心肌细胞构成的生物致动器是游动生物机器人（biorobot）的核心，如图1中设备的示意图和截图所示。细胞在培养24小时后开始出现收缩现象，第2天即可观察到悬臂臂的弯曲。每天记录设备的侧面轮廓，并通过定制的图像分析脚本7根据悬臂臂的弯曲程度量化表面应力。静态应力和动态应力由每日的表面应力中提取得出（图2a）。需要注意的是，静态应力（细胞牵引力）指细胞在静息状态下对表面施加的收缩应力，而动态应力（细胞收缩力）则是细胞在最大收缩时产生的应力。

生物致动器持续表现出自发性收缩，最长可达10天，数据采集持续前6天。随着细胞在培养过程中逐渐成熟，静态应力和动态应力均随时间推移而逐渐增加（图2a）。由于不同样本间细胞成熟程度存在差异，导致受力测量值的标准差较大。第6天时，细胞表现出...

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讨论

本文所述方案介绍了一种成功的基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）驱动器和生物机器人的心肌细胞接种方法，该方法有助于心肌细胞的附着。此外，还描述了图像采集过程以及后续用于表征细胞行为和器件性能的分析方法。

在接种24小时后，我们观察到悬臂臂上的细胞出现自发性收缩；收缩强度随时间持续稳定增加，并在第6天达到峰值，随后逐渐减弱。尽管生物致动器的悬臂臂长度仅为4 mm，但在培养6天后尤其明显地观察到最大可达2.5 mm的大范围偏转。由于悬臂具有较低的杨氏模量（750 kPa）和超薄厚度（25 µm），因而能够产生如此大的偏转，从而驱动生物机器人产生强劲的推进力。为了评估这些细胞的力学特性，我们对每一天细胞产生的收缩力和牵引力进行了量化分析。薄层悬臂已被用于测量心肌细胞或其他肌肉细胞产生的收缩力和机械应力13,17。

本研究测得的最大动态收缩力为165 mN/m，与文献13报道的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

M. T. Holley 获得路易斯安那州立大学董事会研究生奖学金项目的资助，C. Danielson 获得霍华德·休斯医学研究所教授项目的资助。本研究获得美国国家科学基金会资助（项目编号：1530884）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学品与试剂
心肌细胞（原代心肌细胞）Charles RiverNA从出生2天的Sprague Dawley幼鼠中分离
杜尔贝科’改良型伊格尔培养基’DMEM培养基Hyclone Laboratories16750-074含4500 mg/L葡萄糖、4.0 mM L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠
Fetalclone III 血清Hyclone 工业公司，GE16777-240胎牛血清（FBS）
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD1408-100ML
青霉素G钠盐Sigma-AldrichP3032
山羊血清Sigma-AldrichG9023
4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐粉末（DAPI）Sigma-AldrichD9542
牛血浆纤维连接蛋白Sigma-AldrichF1141溶液（1 mg/ml）
钙黄绿素-AM 和碘化丙啶同型双聚体-1 试剂盒（活/死细胞染色试剂盒）分子探针L3224
钙离子荧光探针 Fluo-4, AM分子探针F14217钙离子指示剂染料
台氏盐溶液Sigma-AldrichT2397缓冲液溶液
Pluronic F-127分子探针P3000MP非离子型表面活性剂-20% 二甲基亚砜（DMSO）溶液
16% 甲醛电子显微镜15710注意：刺激性物质，易燃
Triton X-100Sigma-AldrichX-100 100 mL细胞裂解去污剂，（4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，聚乙二醇叔辛基苯基醚）
ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂分子探针P10144封片剂
Alexa Fluor 594 Phalloidin分子探针A12381肌动蛋白丝标记物
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594标记分子探针A-11012
pha分子探针A-11001
抗连接蛋白43抗体Abcamab11370缝隙连接标志物
抗心肌肌钙蛋白 I 抗体Abcamab10231收缩蛋白
16% 电镜级甲醛溶液电子显微镜100503-916
聚二甲基硅氧烷（PDMS）ElsevierSylgard 184
材料与设备
相机Thor LabsDCC1545M
LED灯带NANA任何无光谱发射的白色LED
共聚焦显微镜尼康 C2NA配备三组滤光片的共聚焦显微镜
变焦镜头无限型号# 252120
软件
MatlabMathworksNA用于第4节生物致动器分析。
Image J美国国立卫生研究院NA基于 Java 的图像处理软件。在第 5 节中用于 biorobot 分析。
Java 编写的免费图像处理与分析软件。（https://imagej.nih.gov/ij/）
Thor CamThor LabsNA相机操作软件

参考文献

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PDMS

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