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方法文章

小鼠胰腺的解剖以用于组织学分析和代谢谱检测

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DOI：

10.3791/55647

⸱

2017年8月19日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

本文内容

摘要

本视频文章详细演示了通过解剖从小鼠体内成功摘除胰腺以进行组织学分析和代谢谱检测所需的各项操作步骤。

摘要

我们一直在研究一种胰腺特异性转录因子，即1a cre-重组酶；lox-stop-lox-Kristen大鼠肉瘤病毒基因在第12个密码子处发生甘氨酸到天冬氨酸突变的小鼠品系（Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+），作为人类胰腺癌的模型。我们目前研究的目标是鉴定胰腺癌进展过程中新的代谢生物标志物。我们已对尿液、粪便、血液及胰腺组织提取物进行了代谢谱分析，并对胰腺组织进行了组织学分析以确定癌症进展的阶段。小鼠的胰腺不像人类那样是一个结构清晰的实体器官，而是一种弥散分布的软组织，对于不熟悉小鼠内部解剖结构或缺乏甚至没有小鼠器官解剖经验的人员而言，很难准确识别。本文旨在提供详细的分步可视化演示，指导初学者通过解剖方法完整取出小鼠胰腺。本文尤其适用于刚开始从事需要通过解剖获取小鼠胰腺以进行代谢谱分析或组织学分析研究的学生和科研人员。

引言

小鼠已成为研究人类胰腺癌的重要动物模型1,2。在Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+ 小鼠模型中，Kirsten大鼠肉瘤（K-Ras）癌基因仅在胰腺中被激活，从而引发胰腺内癌前病变，即胰腺上皮内瘤变（PanINs），并进一步发展为胰腺导管腺癌（通常称为PDACs）3。该小鼠模型系统是目前可用于研究人类胰腺癌的最佳动物模型之一4,5，其额外优势在于PanINs通常在出生后前五个月内出现，并常于一年内进展为PDAC4,5，而人类胰腺癌多发于60至70岁年龄段。

通过解剖分离提取 Ptf1a 胰腺cre/+;LSL-KrasG12D/+ 不同年龄的小鼠可用于对胰腺癌发生进行详细的纵向组织学检查，涵盖从最早的胰腺上皮内瘤变（PanIN）阶段到胰腺导管腺癌（PDAC）发展的全过程3,4,5. 采集五至十五个月龄的胰腺也可用于制备组织提取物，以表征胰腺全局性变化4 从健康组织向病变组织转变过程中发生的代谢变化6,7.

本文提供了小鼠胰腺提取所需步骤的完整可视化指南，并给出了胰腺储存以供后续分析的指导建议。本指南对于从事其他胰腺疾病（包括1型糖尿病）研究的研究人员同样具有重要价值，尤其适用于初次开展小鼠胰腺采集研究的学生和科研人员，可用于代谢谱分析或组织学分析等实验。

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方案

视频中展示及下文所述实验程序已获得迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 准备与刺激测试

  1. 建立两个独立的手术区域，即手术操作台和术后处理台。在两个区域分别准备好所有必需的材料和器械。
    1. 在通风橱下放置手术台。将手术台上的设备合理布局，以确保操作过程能够持续、顺畅地进行。
    2. 在手术室内靠近主手术台的同一房间中设立一个术后操作台。在整个手术过程中，保持两个操作台均为无菌环境。
  2. 将以下物品放置于手术台上：一个带盖玻璃瓶、一个15 mL离心管、一把手术剪、一瓶70%乙醇挤压瓶、两块泡沫板、两把镊子、两支1 mL 21号针头注射器、两个50 mL离心管、一个离心管、一个冻存管、四块手术垫、十枚大头针、一个消毒湿巾分配器以及一个锐器盒。
  3. 将以下物品放置于术后操作台：一台分析天平、一个4 L液氮杜瓦瓶、一个浅口宽口杜瓦瓶、一个可漂浮的微量离心管架、一把手术剪、两把镊子、四个冻存管以及一瓶无菌擦拭巾。
  4. 用甲醛溶液将一个50 mL和一个15 mL离心管填充至75%体积。
  5. 用一根大头针固定手术垫的每个角，将其固定在一块约30 cm × 30 cm的泡沫板上，作为解剖板。手术过程中使用其余四根大头针。另准备一块较小的泡沫板并贴上手术垫，用于将器官转移至术后操作台。
    警告：异氟烷（99.9%）为有毒化学品，应在通风橱中使用，以确保有效清除废弃麻醉气体，达到最高安全水平8有关使用异氟烷的开放滴加法对研究人员带来的风险的更多信息，可参见 Taylor 和 Mook 的文章8.
  6. 将一块手术垫放入玻璃罐中，滴加数滴异氟烷（99.9%）使其浸润，并在罐口覆盖一张纸巾，以防止小鼠直接接触异氟烷。同样，用一块浸有数滴异氟烷的手术垫衬垫剩余的试管内壁，并在管口再覆盖一层垫片，以避免小鼠与异氟烷直接接触。
  7. 将液氮倒入浅口宽口杜瓦瓶中，直至达到最高填充线。
  8. 将选定用于解剖的小鼠放入麻醉室中， 即 用盖子盖住装有浸透数滴异氟烷（99.9%）垫片的玻璃罐，持续约1分钟。
    注意：此时间因小鼠个体而异。一旦小鼠失去意识，立即将其从麻醉 chamber 中取出，并置于手术板上。
  9. 将小鼠摆成仰卧位，头部朝向远离实验人员的方向。将小鼠头部放入内衬浸有数滴异氟烷（99.9%）的手术垫的管中，通过足部夹捏刺激测试，确认小鼠对刺激无反应。
    1. 如果该测试失败且小鼠对足部夹捏测试有反应，则重复步骤 1.8。

2. 初始切口、心脏穿刺与安乐死

  1. 用大头针将小鼠的四肢固定在手术泡沫板上，并用70%乙醇润湿小鼠腹侧。
  2. 用镊子夹住尿道口附近的毛皮/皮肤并轻轻向上提起。使用手术剪从尿道口开始，沿中线向上剪开，直至下颌，切开腹腔。
    1. 在初始切口的起始点附近，用镊子夹住一侧毛皮/皮肤，再用剪刀向下并向后足方向斜向剪开另一切口。
    2. 以相同方式在对侧重复此操作。
      注意：可将毛皮/皮肤用大头针固定以扩大切口，但并非必需。
  3. 找到心脏，移除包裹心脏的心包（即心脏周围的囊膜），以避免堵塞注射器针头。
    1. 用镊子夹住心包，用剪刀剪开。小心地将注射器针头插入跳动的心脏进行心脏穿刺，并缓慢回拉活塞开始采血。
    2. 为获得最佳血液采集效果，可操作注射器活塞模拟心脏泵血动作，避免抽吸过快。
      注意：通常可采集约1 mL血液。
    3. 完成采血后，将血液排入离心管中，并将注射器丢弃至锐器容器中。
    4. 完成心脏穿刺后，通过切断心脏连接组织实施安乐死。
      注意：本实验在心脏穿刺前未在注射器中添加抗凝剂肝素（heparin），以便血液凝固从而收集血清。然而，若研究人员希望防止血液凝固以收集血浆，则可在心脏穿刺前向注射器中添加肝素。
  4. 若研究涉及小鼠基因分型，可用剪刀剪取部分耳组织，放入离心管中用于基因型验证。

3. 胰腺提取

  1. 在小鼠左侧找到胃。使用两把镊子轻轻（以避免撕裂）将胰腺从胃和十二指肠分离。
    注意：在将胰腺从胃和肠道分离时，必须非常轻柔地使用镊子，引导胰腺组织远离器官，切勿用镊子压碎或撕裂胰腺。
    1. 继续将胰腺从小肠的空肠和回肠部分分离，最后从大肠的盲肠处分离。
  2. 在盲肠处重新调整镊子位置，沿剩余的结肠继续向直肠方向分离胰腺。
    注意：此时可方便地剪除从胃至直肠前段结肠的组织部分。
  3. 定位胰腺及其附着的脾脏。将胰腺向小鼠右侧滑动。用镊子分离胰腺与胸腔之间的剩余连接，以完全游离胰腺及其相连的脾脏。
  4. 取出胰腺并铺开展开以便检查。为便于识别，保留脾脏与胰腺相连。
    1. 清除胰腺上的所有结缔组织、脂肪及肠系膜组织。
      注意：此类组织颜色较白，因此可与颜色偏粉的胰腺组织轻易区分。若需完整切除胰腺，此步骤尤为重要。例如，当需要测量胰腺重量并与体重或不同动物组间进行比较时。在Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+小鼠模型中，特别是在较年长的月份，可能出现坚硬的纤维化胰腺组织。此时必须仔细分离胰腺，因为肠道可能与肿瘤组织交织在一起。在病情进展较重的情况下，还可能出现异常的脾脏和肝脏组织。
  5. 如有需要，此时可移除其他器官。

4. 数据收集与存储

  1. 器官取出后，将样本转移至术后区域进行保存。
  2. 称量每个器官，并将其放入相应的冷冻保存管中。
    注意：除记录各样本质量外，还应记录任何异常情况，以供后续参考。
  3. 称重完成后，将器官立即放入液氮中进行速冻。
  4. 速冻后，将器官置于 -80 °C 环境中长期保存。
  5. 将经福尔马林固定的样本置于实验台面上过夜，次日早晨将保存液由福尔马林更换为 70% 乙醇。
    注意：这些样本应于 4 °C 条件下长期保存。
  6. 对于长期保存，应将血液和耳组织穿孔样本在 -80 °C 冻存。若需从血液中收集血清，先使血液凝固 30 分钟，然后离心。用移液器吸取血清部分，随后于 -80 °C 保存。

5. 清理

  1. 使用消毒湿巾对所有解剖工具进行消毒。将内衬浸有异氟烷的手术垫的离心管盖上盖子。用新的手术垫替换泡沫板上的旧手术垫。根据机构的动物处理政策，丢弃未采集的小鼠组织部分。

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结果

图1展示了操作环境区域的概览，图2展示了术后操作区域。尽管该设置仅提供了最基本的设备和准备区域，但操作人员可根据自身需求进行调整。该实验方案应根据具体实验需求进行优化。本操作以终止小鼠生命为目的，需进行适当的安乐死处理9。当研究人员准备就绪后，将小鼠放入含有浸有异氟烷棉垫的麻醉舱中（图3）。

小鼠失去意识后，将其取下并背侧朝上固定于板上。应进行足趾夹捏操作，以确认小鼠对疼痛无反应（图4）。使用70%乙醇对初始切口区域进行消毒。为确保充分获取血液，必须在切除胰腺前首先完成终末采血。在采血前，应去除心包膜，以防止21 G针头开口堵塞。完成终末采血后，通过切断心脏作为辅助安乐...

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讨论

相对于现有方法的意义
尽管目前已有一些非正式的小鼠解剖视频，但本视频文章首次提供了专业级质量、经同行评审的视觉演示，全面展示通过解剖提取和收获小鼠胰腺所需的各个详细步骤10。由于胰腺是代谢活动和胰岛素生成的主要器官，通过解剖分离并收获胰腺可保留其生理特性11。在成功分离胰腺后，可对样本进行后续分析。该操作方法使得在同一时间框架内，能够对同一个个体内其他组织之间的相互作用进行比较与研究。

技术的局限性
该方法最大的局限性在于需要终止小鼠的生命，从而无法对同一只小鼠进行纵向追踪以及多次组织样本的采集。为了分析与年龄、性别或其他定量因素相关的趋势，必须采用横断面群体设计，正如我们在胰腺癌代谢生物标志物研究中所实施的那样。本实验方案的另一个局限性是无法暂停操作流程。一旦开始实施安乐死，就必须完整地完成整个操作过程。

实验方案中的关键步...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

MAK 感谢美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助项目（资助号：1R15CA152985-01A1）对本工作的支持。本项目还获得了迈阿密大学本科生研究奖计划、迈阿密大学博士-本科生学术机会计划以及迈阿密大学暑期学者计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
玻璃罐 康宁3140-150视频中使用的玻璃罐已停产。  这是其替代品。
玻璃罐盖子康宁9985-150视频中使用的玻璃罐盖子已停产。  这是其替代品。
15 mL Falcon管Fisher Scientific339650
手术剪Fisher Scientific9201
挤压瓶 Fisher Scientific03-409-10DD
100% 乙醇Fisher Scientific22-032-103
甲醛溶液Fisher Scientific245-684
泡沫板Therapak562908
镊子Fisher Scientific200205SHN
1 mL 21G 注射器BD 生物科学309624
50 mL Falcon管Fisher Scientific339652
2.0 mL 微型离心管 Fisher Scientific02-681-258
手术垫Fisher ScientificS67011
T型针长度：  2" 高级商店产品X32T-05
消毒湿巾Professional Disposables International Inc.Q85084
锐器盒Fisher Scientific14-827-122
分析天平Marshall ScientificME-AE200
4L 杜瓦瓶泰勒-沃顿4LD
浅口广口杜瓦瓶Fisher ScientificF3087-V
悬浮微管架VWR60986-100
1.2 mL 冻存管，无菌Fisher Scientific10-500-25
异氟烷（Isothesia，异氟醚） Henry Schein 动物健康050033
液氮莱特兄弟NIT-60-XX
小鼠 Kras 品系杰克逊实验室OO8179
小鼠 Cre 品系MMRRCOOO435-UNC

参考文献

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