磁性和热敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)基微凝胶用于磁控释放

摘要

本论文描述了一种通过温度诱导乳化法制备磁性和热敏性微凝胶的方法，该过程无需化学反应。这些敏感性微凝胶是通过混合聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）、聚乙烯亚胺（PEI）和Fe₃O₄-NH₂纳米颗粒制备而成，有望用于磁控和热触发的药物释放。

摘要

设计并制备了包载抗癌药物姜黄素（Cur）的磁性和热敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPAAm)/Fe₃O₄-NH₂ 微凝胶，用于实现磁触发释放。通过温度诱导乳液法并结合物理交联工艺，将PNIPAAm、聚乙烯亚胺（PEI）和Fe₃O₄-NH₂ 磁性纳米颗粒混合，制得具有球形结构的PNIPAAm基磁性微凝胶。由于Fe₃O₄-NH₂ 纳米颗粒具有良好的分散性，其被嵌入聚合物基质内部。Fe₃O₄-NH₂ 和PEI表面暴露的氨基通过与PNIPAAm的酰胺基团发生物理交联，从而维持了微凝胶的球形结构。疏水性抗癌药物姜黄素在包载入微凝胶后可在水中分散。采用透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和紫外-可见光谱分析对微凝胶进行了表征。此外，在外加高频磁场（HFMF）下研究了磁触发释放行为。由于磁感应加热（热疗）效应，在对微凝胶施加HFMF后，观察到姜黄素显著的"突释"现象。本文描述了Cur-PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 微凝胶包载姜黄素的磁触发可控释放，该系统在肿瘤治疗中具有潜在应用价值。

引言

水凝胶是三维（3D）聚合物网络，不溶于水但可在水溶液中溶胀¹。该聚合物网络包含亲水区域（可被水化以形成水凝胶结构）以及交联构象（可防止网络塌陷）。目前已有多种方法被研究用于制备水凝胶，例如乳液聚合、阴离子共聚、相邻聚合物链的交联以及反相微乳液聚合²。通过这些方法引入物理或化学交联，以获得结构稳定的水凝胶^1,3。化学交联通常需要交联剂的参与，该交联剂连接聚合物的主链或侧链。与化学交联相比，物理交联在制备水凝胶时更具优势，因其无需使用交联剂，而这些交联剂在实际应用中往往具有毒性⁴。目前已有多种方法被用于合成物理交联水凝胶，例如通过离子相互作用交联、结晶作用、两亲性嵌段之间的结合或在聚合物链上的接枝，以及氢键作用等^4,5,6,7。

刺激响应性聚合物能够响应不同的环境条件（例如，温度、pH、光、离子强度和磁场）而发生构象、化学或物理性质的变化，近年来因其在可控释放系统、药物递送和抗癌治疗中的潜在应用而受到广泛关注^8,9,10,11,12。研究人员目前主要关注热响应性聚合物，因为其内在温度易于调控。PNIPAAm 是一种热响应性聚合物，分子结构中同时含有亲水性酰胺基团和疏水性异丙基基团，并具有较低的临界溶解温度（LCST）¹³。在低温条件下（低于 LCST），酰胺基团与水分子之间的氢键作用使 PNIPAAm 在水溶液中具有良好的分散性；而在高温条件下（高于 LCST），聚合物链之间形成氢键，排斥水分子，导致聚合物网络发生坍塌。基于这一独特性质，已有大量研究报道通过调节聚合物链长的疏水与亲水比例，如采用共聚、接枝或侧链修饰等方法，制备温度触发的自组装水凝胶，用于药物递送平台^14,15,16,17。

铁、钴和镍等磁性材料在过去几十年中也因其在生物化学应用中的潜力而受到越来越多的关注¹⁸。在这些材料中，氧化铁由于具有良好的稳定性和低毒性，成为应用最广泛的材料。纳米级氧化铁可迅速响应磁场，并表现出超顺磁性。然而，这类微小颗粒容易发生聚集，从而降低表面能，导致其分散性丧失。为了提高其在水中的分散性，通常采用接枝或包覆保护层的方法，不仅可使各个颗粒相互分离以维持稳定性，还可进一步功能化其反应位点¹⁹。

本研究中，我们制备了基于聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）的磁性微凝胶，用作可控释放系统的药物载体。合成过程如图1所示。与复杂的共聚反应和化学交联方法不同，本研究采用了一种新型的温度诱导PNIPAAm乳液结合物理交联的方法，无需额外添加表面活性剂或交联剂即可获得微凝胶，从而简化了合成步骤并避免了潜在的毒性。在如此简单的制备工艺下，所合成的微凝胶能够良好分散水相中的磁性氧化铁纳米颗粒以及疏水性抗癌药物姜黄素。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、透射电子显微镜（TEM）和成像结果均证实了药物的分散与包封。由于嵌入了Fe₃O₄-NH₂，该磁性微凝胶在交变磁场（HFMF）下展现出作为可控释放微型装置的应用潜力。

方案

1. 表面修饰、可水分散磁性纳米颗粒 Fe₃O₄ 和 Fe3O4-NH₂ 的合成

1. 将 14.02 g FeCl₃、8.6 g FeCl₂·4H₂O 和 250 mL 水加入 500 mL 烧杯中。
2. 连接转子和控制器以设置机械搅拌。在室温（RT）下以 300 rpm 搅拌溶液 30 分钟。
3. 在室温下向溶液中加入 25 mL 氨水（33%），并继续以 300 rpm 搅拌 30 分钟。保持烧杯敞开。
   警告：吸入氨水可能引起鼻腔刺激。此步骤必须在合适的通风橱内进行。
4. 为收集磁性氧化铁（Fe₃O₄），停止机械搅拌。将磁铁置于烧杯下方以收集黑色颗粒。
   1. 待 Fe₃O₄ 纳米颗粒完全沉淀后，小心移除上清液。倾倒上清液时不要晃动烧杯，以免造成 Fe₃O₄ 损失。
   2. 移开磁铁，并向烧杯中加入 50 mL 新鲜水。
   3. 摇动烧杯以重新分散 Fe₃O₄。重复步骤 1.4 至 1.4.2 三次，以纯化 Fe₃O₄。
5. 最后一次洗涤后，将全部 Fe₃O₄（10 g）转移至 100 mL 玻璃瓶中。加水至总体积为 100 mL。剧烈摇动玻璃瓶，直至无可见结块。
   注意：此步骤可暂停。Fe₃O₄ 纳米颗粒已制备完成。
6. 用氨基硅烷对 Fe₃O₄ 进行修饰（Fe₃O₄-NH₂）。
   1. 取步骤 1.5 中的 100 mL 溶液转移至 1,000 mL 烧杯中。向烧杯中加入 10 mL 氨水、90 mL 水和 900 mL 乙醇。
   2. 使用磁力搅拌子以 300 rpm 混合溶液。在室温下逐滴加入 500 µL (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES），并继续搅拌 12 小时。
7. 按照第 1.4 节所述方法纯化并收集 Fe₃O₄-NH₂。
8. 将 1 g Fe₃O₄-NH₂（来自步骤 1.7）重新分散于 20 mL 玻璃瓶中的 20 mL 水中。
   注意：此步骤可暂停。Fe₃O₄-NH₂ 纳米颗粒已制备完成。

2. 通过热致乳液法合成有机-无机杂化微凝胶

1. 制备 溶液 1-1 和 1-2。
   1. 对于溶液 1-1，将 0.25 g PNIPAAm、5 mL Fe₃O₄ 溶液（来自步骤 1.5）和 0.2 g PEI 加入一个 50 mL 玻璃瓶中。加入 20 mL 水，并使用磁力搅拌子以 300 rpm 搅拌 30 分钟。
   2. 对于溶液 1-2，重复步骤 2.1.1，但将 Fe₃O₄ 替换为 Fe₃O₄-NH₂ 溶液（来自步骤 1.8）。
2. 制备 溶液 2：将 0.8 g PEI 和 18.2 mL 水加入一个 50 mL 玻璃瓶中。使用水浴将溶液加热至 70 °C，持续 30 分钟。另准备一瓶相同的 溶液 2。
3. 制备 PNIPAAm/Fe₃O₄。
   1. 使用超声细胞破碎仪进行超声处理（50 w），同时用磁力搅拌子搅拌（300 rpm），并用水浴将 溶液 2 加热至 70 °C。
   2. 使用 3 mL 注射器以 1 mL/min 的速率将 溶液 1-1 逐滴加入已加热的 溶液 2 中。
   3. 继续在 70 °C 下进行超声、搅拌和加热，持续 30 分钟。
   4. 将溶液冷却至室温。将溶液从细胞破碎仪和水浴中取出。
   5. 通过将磁铁靠近玻璃瓶来收集微凝胶。
   6. 待微凝胶沉淀至玻璃瓶底部后，移除上清液。
   7. 向玻璃瓶中再加入 25 mL 水，并通过涡旋重新分散微凝胶。该溶液即为 PNIPAAm/Fe₃O₄。
      注：此步骤可暂停。
4. 制备 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂。
   1. 使用超声细胞破碎仪进行超声处理（50 w），同时用磁力搅拌子搅拌（300 rpm），并用水浴将 溶液 2 加热至 70 °C。
   2. 使用 3 mL 注射器以 1 mL/min 的速率将 溶液 1-2 逐滴加入已加热的 溶液 2 中。
   3. 继续在 70 °C 下进行超声、搅拌和加热，持续 30 分钟。
   4. 将溶液冷却至室温。将溶液从细胞破碎仪和水浴中取出。
   5. 通过将磁铁靠近玻璃瓶来收集微凝胶。
   6. 待微凝胶沉淀后，移除上清液。
   7. 向玻璃瓶中再加入 25 mL 水，并通过涡旋重新分散微凝胶。该溶液即为 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂。
      注：此步骤可暂停。

3. 姜黄素负载微凝胶（Cur-PNIPAAm/Fe₃O₄-NH ₂）的制备

注意：这些步骤必须在避光条件下进行。

1. 将 100 mg 的姜黄素和 20 mL 乙醇加入一个 20 mL 玻璃瓶中。
2. 取 2 mL 姜黄素溶液转移至 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 溶液中（见步骤 2.4.7）。在室温下以 400 rpm 搅拌过夜。
3. 在室温下以 400 rpm 搅拌过夜后，使用磁铁收集 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂，操作方法如步骤 2.4.5 和 2.4.6 所述。
4. 向玻璃瓶中再加入 25 mL 水，并通过涡旋重新分散微凝胶。该溶液即为 Cur-PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂。

4. 磁性触发药物释放

1. 取10 mL Cur-PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂溶液，加入2 mL水，转移至15 mL离心管中。
2. 将离心管置于线圈中心以施加HFMF²⁰，在15 KHz条件下施加HFMF 20分钟。
3. 在施加HFMF过程中，每隔2分钟取出0.5 mL溶液，并补充0.5 mL新鲜水。
4. 将取出的溶液转移至1 mL比色皿中。
5. 使用紫外-可见分光光度法在482 nm处测定所取出溶液的吸光度²¹。
6. 根据标准校准曲线中吸光度与浓度的关系，确定释放药物的浓度²²。
   注：标准校准关系式为：
   
   其中相关系数为0.9993。

5. 磁性微凝胶的表征

1. 热重分析仪（TGA）²³.
   1. 测量 PNIPAAm/Fe 的重量损失₃O₄ 和 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 在空气气氛下通过热重分析（TGA）测定的质量损失随温度的变化。
      1. 将样品从室温加热至 100 °C 并在该温度下保持10分钟以去除湿度。随后将样品加热 100 °C 到 800 °C 以……的速率 10 °C/min。称量样品。
      2. 绘制重量损失曲线 与 PNIPAAm/Fe 的温度₃O₄ 和 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂.
         注意：残留物重量为 Fe₃O₄ 或 Fe₃O₄-NH₂，而损失的重量是PNIPAAm。
2. 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）²⁴.
   1. 将10 mg样品与1 g KBr混合干燥 100 °C 过夜。
   2. 将步骤5.2.1中的混合物按照以下步骤（5.2.2.1 - 5.2.2.5）压制成片剂：
      1. 使用研钵和研杵将5.2.1步骤中的材料研磨成细粉。
      2. 将组装好的装置（研钵和研杵）放入压片机中，使装置精确地位于压片机的正中央。
      3. 将压力泵加压至20,000 psi。保持该压力5分钟。
         警告：必须将装置精确地置于压力机中央，否则样品会从研钵中飞溅而出，造成暴露相关的伤害。
      4. 从压片机中取出含有样品颗粒的模具和冲头。
      5. 将其倒置，推动活塞以挤出沉淀物。
   3. 使用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR），在400至4,000 cm⁻¹波数范围内记录样品的FT-IR吸收光谱^-1 4 cm^-1 分辨率²⁴.
3. 通过透射电子显微镜进行形态学观察²⁵.
   1. 将样品溶液滴加到覆有火棉胶的铜网上，然后在室温或真空干燥器中干燥 70 °C 烘箱过夜。
   2. 拍摄透射电子显微镜（TEM）图像。
      注意：强电子束可能损伤样品，因此透射电子显微镜图像应尽快采集。
4. 聚合物和微凝胶的水分散能力
   1. 配制 PNIPAAm 溶液时，将 7 mg PNIPAAm 和 7 mL 水加入一个 7 mL 玻璃瓶中。使用涡旋振荡器混合溶液，直至无聚集物存在。
   2. 制备 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 溶液，转移 0.7 mL 的 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 将溶液（步骤 2.4.7）转移至一个 7 mL 玻璃瓶中，加入 6.3 mL 水。使用涡旋振荡器混匀溶液，直至无沉淀存在。
   3. 制备 Cur-PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 溶液，转移 0.7 mL 的 Cur-PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 将溶液（步骤 3.4）转移至一个 7 mL 玻璃瓶中，加入 6.3 mL 水。使用涡旋振荡器混匀溶液，直至无沉淀存在。
   4. 使用数码相机拍摄溶液（步骤 5.4.1 - 5.4.3）的照片。
   5. 将溶液放入烘箱中，并将温度设置为 70 °C等待2小时直至达到平衡。
   6. 再次拍摄溶液的照片。为保持温度，需在1分钟内完成拍摄。避免摇动玻璃瓶，以免重新分散沉淀物。
5. 为磁性收集微凝胶，将强磁铁靠近 Cur-PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 溶液（步骤 5.4.3）。待微凝胶完全收集后，拍摄照片。
   1. 移去磁铁，涡旋微凝胶溶液至完全分散，再拍摄一张照片。

结果

PNIPAAm/PEI/Fe 合成示意图₃O₄-NH₂ 微凝胶如图所示 图1. 采用热重分析（TGA）来估算有机化合物相对于整个微凝胶的相对组成。由于只有有机化合物PNIPAAm能够被燃烧，因此可通过该方法确定PNIPAAm与Fe的相对组成₃O₄ （或 Fe₃O₄-NH₂）的测定结果如图所示 表1. 为什么 PNIPAAm/Fe₃O₄-NH₂ 微凝胶表现出更好的分散性，但氧化铁含量较低？这是由于在 PNIPAAm/Fe 中具有更强的相互作用和更优的分散性₃O₄-NH₂ 低于PNIPAAm/Fe中的情况₃O₄，Fe₃

讨论

制备过程中最重要的步骤位于第2部分实验方案中，即通过热致乳化法合成磁性微凝胶。如图2（透射电镜图像）所示，由于PNIPAAm（酰胺基团）、PEI（氨基基团）与Fe₃O₄-NH₂（氨基基团）之间强氢键作用形成的物理交联，微凝胶的球形结构在室温（低于LCST）下能够得以维持。根据图4中的对比结果，磁性微凝胶在低温（25 °C）或高温（70 °C）下均表现出良好的分散性。如图5所示，这些微凝胶还可通过磁铁收集，并能重新分散成均一的溶液。

通常，由疏水性和亲水性单体合成的水凝胶在传统制备过程中需要引入交联剂以形成三维网络结构^4,5,6,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚(N-异丙基丙烯酰胺)	Polyscience, Inc	21458-10	Mw ~40,000
(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷	Sigma-Aldrich	440140	> 99 %
氯化亚铁四水合物	Sigma-Aldrich	44939	99%
氯化铁	Sigma-Aldrich	157740	97%
姜黄素	Sigma-Aldrich	00280590
氢氧化铵	Fisher Chemical	A/3240/PB15	35%
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	806552	pH 7.4，液体，经无菌过滤
聚乙烯亚胺（PEI）	Sigma-Aldrich	P3143	50 % (w/v) 水溶液
高频磁场（HFMF）	Lantech Industrial Co., Ltd.,中国台湾	LT-15-80	15 kV, 50–100 kHz
紫外-可见分光光度法	Thermo Scientific Co.	Genesys
透射电子显微镜（TEM）	JEM-2100	JEOL
傅里叶变换红外光谱法（FTIR）	PerkinElmer	Spectrum 100
热重分析仪	PerkinElmer	Pyris 1
超声波细胞破碎仪	Hielscher Ultrasonics	UP50H