用于软件辅助追踪动态细胞突起中蛋白质浓度的图形用户界面

摘要

我们提出了一种软件解决方案，用于沿动态细胞突起长度方向半自动追踪相对蛋白质浓度。

摘要

丝状伪足是与细胞迁移和细胞间通讯相关的动态手指状细胞突起。为了更好地理解丝状伪足启动、延伸以及后续稳定或回缩过程中复杂的信号传导机制，确定这些动态结构中蛋白质活性的时间和空间分布至关重要。为了分析丝状伪足中的蛋白质功能，我们近期开发了一种可适应丝状伪足形态变化的半自动追踪算法，从而能够同时分析突起的动态行为以及沿整个丝状伪足长度方向上的相对蛋白质浓度。本文提供了一套详细的分步操作方案，涵盖优化的细胞处理、图像采集和软件分析流程。我们还进一步提供了在图像分析和数据呈现过程中使用可选功能的操作说明，以及针对各个关键步骤的故障排除指南。最后，本文还对所描述的图像分析软件与其他可用于丝状伪足定量分析的程序进行了比较。综上所述，本方案为利用图像分析软件精确分析丝状伪足突起中的蛋白质动态变化提供了完整的技术框架。

引言

肌动蛋白调控蛋白的时空控制与丝状伪足的动力学相关^1,2。因此，通过时间追踪整个丝状伪足长度上空间分辨的蛋白质浓度，对于深入理解这些动态结构的起始、延伸、稳定或塌陷机制至关重要^3,4。与在细胞质中进行的蛋白质分析不同——后者许多细胞形态变化发生在较大尺度上，丝状伪足是持续屈曲⁵和弯曲的动态微结构，因而无法采用简单的线扫描等方法进行分析。

用于追踪丝状伪足形态的不同软件解决方案均有提供 ^6,7,8,9同样，已开发出用于追踪细胞体内蛋白质动态变化的比率成像分析软件。 ^10,11为了整合丝状伪足形态的自动追踪与时空蛋白质分析，我们近期开发了一款基于凸包算法的图像分析软件 ¹². 这种新型分....

方案

1. 细胞培养

1. 在含有 4.5 g/L D-葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、丙酮酸、10% 胎牛血清和 10 单位/毫升青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养 HeLa 或 COS 细胞。在不含 L-谷氨酰胺、谷氨酸或天冬氨酸的培养基中培养神经元，并补充 0.5 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、无血清神经元补充剂和 10 单位/毫升青霉素/链霉素。
2. 当细胞融合度达到 40% 时，按照制造商说明书使用转染试剂将细胞与目标质粒共转染。将转染后的细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 15–18 小时。
3. 为减少成像过程中因蒸发引起的 pH 值和渗透压变化，在成像前将预热至 37 °C 的含 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的培养基加入细胞培养腔室至总体积的 90%。为密封盖子，先在盖子内侧涂一层薄薄的真空脂，然后轻轻将其压在含有转染细胞的培养腔室上。

2. 图像采集

注意：丝状伪足的长度范围为 2-10 µm¹³。丝状伪足的平均生长速度为 0.05-0.1 µm/s^13,14。

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结果

利用转染了丝状肌动蛋白标记物（f-tractin¹⁸，红色）和细胞质参考标记（绿色）的COS细胞，我们观察到富含肌动蛋白的丝状伪足突起（图3A，上图）。时间序列图像显示，丝状伪足会快速延伸和回缩（图3A，中图）。通过图像分析软件，我们追踪了单个丝状伪足的动态变化。手动测量与图像分析软件测得的丝状伪足长度之间的比较显示，其Pearson互相关系数为0.947，表明该软件能够可靠地追踪丝状伪足的延伸过程¹²。除了单个丝状伪足的生长和回缩速率外，图3A底部的明暗图还展示了肌动蛋白的荧光强度（上）、细胞质参考标记的荧光强度（中），以及相对于细胞质参考标准化后的肌动蛋白相对浓度（下）。综上所述，这些实验结果证明，该程序能够在COS细胞中可靠地测量单个丝状伪足整个生命周期内的生长动力学以及空间分辨的相对蛋白质浓度.......

讨论

本文介绍了一种详细的实验方案，用于追踪丝状伪足的生长动态，并通过凸包算法分析这些动态结构中相对蛋白质浓度。利用该软件，可在单次运行中对最多3个通道进行两两比较，从而分析两个通道的相对浓度即 在整个伸展/回缩循环过程中测定蛋白质，并将图像和数据文件分别存储在不同的文件夹中。除了常规操作外，该软件还提供多个可调整参数，以便针对具体实验优化分析。这些参数调整的详细说明以及故障排除方法见方案部分及 表1.

图像分析并不局限于特定类型的显微镜，而是受限于时间序列的图像质量。鉴于其重要性，应在采集过程中针对每个通道优化图像质量。我们的实验表明，该算法对信噪比（SNR）较高的丝状伪足效果最佳 >4，使用放大倍数高于40倍且无像素合并的物镜，以1 Hz频率采集。当然，这仅在荧光染料与滤光片设置兼容的情况下适用（即 无串色现象；详见第2步实验方案）。考虑到相对强度是相互比较的，该分析对单个细胞间绝对荧光信号强度的微小差异不敏感。因此，为获得有意义的数据，需设定一个明确定义的参考通道（例如 细胞质标记物）具.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life Technologies	31966-021
10% 胎牛血清	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-027
1% 青霉素/链霉素	Biochrom AG	12212
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (1M 储存液)	Life Technologies	15630
Citrine-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Institute DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Institute DSMZ	ACC-60
3T3 细胞	Leibniz Institute DSMZ	ACC-59
显微镜	Nicon Eclipse
相机	Andor	DU888 Ultra
共聚焦单元	Yokagawa	CSU-X1
丙酮酸钠	Gibco	31966-021