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方法文章

中药制备：二仙汤及含二仙汤血清的制备 在体 内 和 体外 实验

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DOI：

10.3791/55654

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2017年5月31日

 ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2The Academy of Integrative Medicine of Fudan University

本文内容

摘要

在此，我们介绍二仙汤（EXD）的制备方法，包括四个步骤——浸泡、煎煮、过滤和浓缩，并演示将含有制备好的EXD的血清给予大鼠的操作。这些方法适用于 体内 和 体外 中药等草药煎剂的研究。

摘要

传统草药作为临床环境中的一种替代医学，近年来受到越来越多的关注。在将草药递送至体内之前，通常需要额外的提取步骤，以释放生药中的活性成分。水煎法是一种经典的提取方法，目前仍在临床实践中广泛使用。本文提出了一种二仙汤（EXD）的详细制备方案，旨在将草药煎剂应用于实验研究。文中描述了适用于动物实验的剂量换算方法，以及EXD制备的四个主要步骤：浸泡、水煎、过滤和浓缩。此外，还介绍了含EXD血清在大鼠中的应用方法 体外 验证。在此实验中，大鼠经口给予EXD连续三天。随后采集血液样本，灭活后离心并过滤。血清用培养基稀释后，可用于处理细胞或组织 体外例如，EXD 被应用于两者 体内 和 体外 研究并证明了EXD可增强成骨作用。本方案可作为中药制备与应用的参考。

引言

目前，人们对传统草药研究与应用的兴趣日益增长。与化学成分明确的现代药物不同，草药方剂含有某些未知成分，需要通过提取工艺来释放其活性化合物。尽管许多研究试图选择一种结构明确的小分子化合物作为整味草药或草药方剂的代表，但其药理效应和作用机制均无法等同于全方的整体效果1,2。虽然指纹图谱技术可用于分析复杂草药方剂的组成成分，但部分成分仍难以被清晰鉴定，这为全面整合所有提取物进行研究带来了挑战3。多种成分或提取物之间的相互作用共同介导了草药的治疗效果。为了保留这一优势，传统提取形式——水煎液——在临床中仍被广泛使用。由于提取过程对治疗效果具有显著影响，建立标准化的传统水煎煮方法尤为必要，特别是在进行体内（in vivo）研究时4,5。

另一方面，在探索药理机制时，中药汤剂在体外（in vitro）或离体（ex vivo）实验中的给药也存在挑战。含药血清的概念最早由Tashino于1988年提出6。此后，越来越多的研究人员将其应用于中药研究7,8,9。尽管含药血清方法存在一些局限性，例如血清中某些成分的干扰，但它仍被认为是一种能够较好模拟生理条件的研究方法。

二仙汤于20世纪50年代初研制而成，用于缓解更年期症状10,11,12,13。该方剂还被应用于再生障碍性贫血14、更年期骨质疏松15,16,17、卵巢早衰18、乳腺癌19、卵巢癌20以及青春期延迟21的治疗。本文中，我们提供了二仙汤（EXD）及其含药血清制备的详细方案。此外，我们还描述了EXD及其含药血清在小鼠更年期骨质疏松模型中的应用。

每名成年患者每日服用的 EXD 由 9 g Curculigo orchioides Gaertn、Herba Epimedii、Radix Morindae Officinalis 和 Radix Angelicae Sinensis，以及各 6 g 的 Cortex Phellodendri 和 Rhizoma Anemarrhenae 组成。根据以下公式22，小鼠的等效剂量为 0.1418 EXD/kg/天：dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3。其中 dA 和 dB 分别表示人和小鼠按体重计算的剂量（mg/kg），此处将 mg/kg 的剂量替换为 EXD/kg 数值；RA 和 RB 分别代表人和小鼠的体表面积换算系数，其值与（体表面积（m2）/ 体重（kg））2/3 成正比（见 表 1）；WA 和 WB 分别表示人和小鼠的体重（kg）。

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方案

该方案遵循上海中医药大学的动物护理指南，并已获得上海动物实验伦理委员会批准。

1. 方案 I：EXD 的制备

  1. 计算
    1. 对10只六个月大的雌性印迹控制区（ICR）小鼠组成的处理组施用EXD 小鼠（每只0.02 kg），每周5天，持续12周。
      注意：共需要 1.702 个 EXD。由于 EXD 以离散增量计量，实际操作中给予 2 个 EXD。
    2. 计算每只小鼠应用的 EXD 体积（即 V = (0.1418 EXD/kg•天) * (0.02 kg/只) * 50 mL/EXD = 0.14 mL/只•天
  2. 浸泡
    1. 将两个EXD的全部原材料放入即，仙茅（Curculigo orchioides Gaertn） (18 g) 淫羊藿 (18 g) 巴戟天 (18 g) 当归 (18 g) 黄柏 （12 克），以及 知母 （12 克），总计 96 克，放入带盖容器中。
      注意：建议使用陶瓷容器。
    2. 将生药材用500 mL蒸馏水浸泡1小时，水量以高出药材约2.5厘米为宜，确保所有药材充分浸透。
  3. 首次水煎
    1. 使用燃气灶或电磁炉以高火加热药材，直至水沸腾（约5 - 10分钟；具体时间取决于加热功率、容器以及药材和水的用量）。随后调至小火慢煎2小时。
  4. 初次过滤
    1. 用普通滤纸或纱布和棉花覆盖一个500 mL玻璃烧杯。将煎液小心地通过滤材倒入烧杯中，药渣留在容器内。
    2. 将滤纸上的剩余草药残渣放回容器中。
  5. 第二次水煎
    1. 向盛有草药的容器中加入蒸馏水，水量以高出草药约2.5厘米为宜。
    2. 重复步骤 1.3。
  6. 第二次过滤
    1. 重复步骤 1.4.1 和 1.4.2。
    2. 将第二次煎煮液倒入同一烧杯中，与第一次煎煮液混合均匀。
  7. 浓度
    1. 将烧杯置于燃气灶上，中间垫上无石棉的金属网，用小火加热煎液，并用玻璃棒缓慢持续地搅拌。
    2. 当药液浓缩至200 mL时，将其转移至500 mL烧杯中。
    3. 重复步骤1.7.1，直至药液浓缩至100 mL。
  8. 储存与给药
    1. 将浓缩药液转移至无菌玻璃瓶中，冷却至室温（RT）。若在一周内使用，则于4 °C保存；若需长期保存，则置于-70 °C。
    2. 使用灌胃针，每天对卵巢切除（OVX）小鼠给予 0.14 mL/只的药液，每周 5 天，持续 12 周。

2. 方案二：含EXD血清的制备

  1. 计算
    1. 使用0.15 kg作为每只大鼠（1月龄）的体重，计算大鼠等效剂量（RED）：dB = (1/60) * (90/100) * (60/0.15)1/3 = 0.111 EXD/kg/天。
      注意：制备100 mL含EXD血清的培养基（含10% EXD血清）需要总共10 mL含EXD血清。每只大鼠预计可提供2 mL血清，因此需准备6只大鼠（已计入20%损耗），连续给药EXD 3天，每天一次。所需EXD总量为：(0.111 EXD/kg•天) × (0.15 kg/只) × (6只) × (3天) = 0.300 EXD。由于EXD按离散增量计量，故使用1 EXD。
    2. 计算每只大鼠应用的 EXD 体积（即， V = (0.111 EXD/kg•天) * (0.15 kg/大鼠) * (50 mL/EXD) = 0.83 mL/大鼠•天。
  2. 浸泡
    1. 将1份EXD的原料放入带盖容器中。用蒸馏水浸泡生药材1小时，水量以高出药材约2.5厘米为宜，确保所有药材充分浸透。
  3. 首次水煎
    1. 使用电磁炉高火加热药材，直至水沸腾（约5 - 10分钟；具体时间取决于加热功率、容器以及药材和水的用量）。随后调至小火慢煮2小时。
  4. 初次过滤
    1. 用普通滤纸或纱布和棉花覆盖一个500 mL玻璃烧杯。将煎液通过滤材小心倒入烧杯中，药渣留在容器内。
    2. 将滤纸上的药渣放回容器中。
  5. 第二次水煎
    1. 向盛有草药的容器中加入蒸馏水，水量以高出草药约一英寸为宜。
    2. 重复步骤 2.4。
  6. 第二次过滤
    1. 重复步骤 2.5.1 和 2.5.2。
    2. 将第二次煎煮液倒入与2.4.1步骤相同的烧杯中，并与第一次煎煮液混合。
  7. 浓度
    1. 将烧杯置于燃气灶上，中间垫上无石棉的金属网，用小火加热煎液，并用玻璃棒缓慢持续搅拌。
    2. 当药液浓缩至100 mL时，将其转移至100 mL烧杯中。
    3. 重复步骤 2.7.1，直至药液浓缩至 50 mL。
  8. 储存与给药
    1. 将浓缩药液转移至无菌玻璃瓶中，冷却至室温。若一周内使用，则于4 °C保存；若需长期保存，则置于-70 °C。
    2. 每天每只大鼠经口胃内给予 0.83 mL，连续给药 3 天。
  9. 含EXD血清制备
    1. 在给予EXD最后一次给药1小时后，通过腹腔注射每100克体重300 mL、80 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪对大鼠进行麻醉。通过夹趾反应确认麻醉效果。
    2. 使用手术刀（或直剪）从大鼠腹部至胸腔底部切开皮肤和腹膜，切口长度约5 cm，深度约0.5 cm。用拭子纸将腹腔内脏向左侧推移。
    3. 用滤纸去除腹主动脉周围的结缔组织，以清晰暴露血管。
    4. 使用10 mL、22号针头的注射器从腹主动脉缓慢抽取血液。取下针头后将血液转移至15 mL无菌管中；一只大鼠可采集8–10 mL血液。
      注意：大鼠应保持存活（即， 开始采血时腹主动脉仍在搏动，采血完成时动物已死亡。
    5. 将血液在室温下直立静置 30 - 60 min 以促使其凝固。在 500-600 x g 条件下离心 20 min。小心地将所有上清液（血清）转移至一个 50-mL 无菌离心管中，并将来自不同动物的血清充分混合。
    6. 在56 °C水浴中孵育血清30分钟以进行热灭活。使用带有0.22 µm孔径亲水性聚醚砜膜的注射器滤器过滤血清。新鲜使用或于-20 °C保存。
  10. 对照组含药血清制备（用于对照组）
    1. 每天对每只大鼠给予相同体积的生理盐水（0.83 mL），持续3天。其余步骤与步骤2.9相同。
  11. 应用
    1. 向每 100 mL 培养基中加入含 EXD 的血清或含药血清 10 mL，以及 1% 青霉素-链霉素（PS）23.

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结果

EXD 对 OVX 小鼠骨密度的影响

苏木精和伊红（H&E) 腰椎切片染色显示，经EXD处理后骨小梁增加 体内 (图1A，右侧面板）与OVX组相比图1A，左侧面板）。 图1B 显示代表性结果 µCT 4 的图像th OVX 小鼠的腰椎图1B，左图）以及接受 EXD 治疗 12 周的 OVX 小鼠（图1B，右侧面板）。与对照组OVX小鼠相比，EXD处理小鼠腰椎椎体内部可见更多小梁骨。来自的數據 µCT 成像结果显示，4组的骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb. N）和骨小梁厚度（Tb. Th）增加，骨小梁间距（Tb. Sp）减小th EXD 小鼠的腰椎图1C).

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讨论

近年来，人们越来越关注草药，这是一种在东方世界临床应用已有数千年历史的替代医学。与西药不同， "从实验室到临床" 现代医学模式下，传统草药医学首先需要 "从病床到实验室" 模式以解释其作用机制。随后可在实验台阶段进行验证，并推进新优化药物的开发。迄今为止，已有多种提取方法被报道用于从完整方剂或草药中释放活性成分。其中，水提法应用最为广泛。

中药水提法包含四个基本步骤。第一步是浸泡。将复方中药在水中浸泡一段时间，通常为0.5至1小时。浸泡时间的长短取决于药材的用量和性质。为确保药材充分浸透，每一块或每一片药材的中心部分都应被浸透。加水量取决于药材的总体积。有时也使用药材的重量来确定浸泡所需的水量。然而，药材的密度差异较大。由于浸泡的目的是使所有药材充分润湿，以便在后续步骤中促进有效成分的释放，因此更推荐以药材体积作为加水量的参考标准。第二步是煎煮。煎煮和文火慢煮的过程已有数千年的历史。煎煮时间的差异主要取决于药材的种类，因其具有不同的物理、化学和药理特性12。解表药建议煎煮时间较短，通常少于20分钟；芳香...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（81573992）的资助。感谢 Emily K. Lo 和 Kathleen DiNapoli 在语言编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仙茅（Curculigo orchioides Gaertn） g)，淫羊藿（9 ，巴戟天（9 g)，当归（9 g)，黄柏（6 ，以及知母（6 g)康美药业饮片有限公司（上海，中国）160922EXD 组件
滤纸GElifesciences99-103-952浓缩前过滤EXD汤剂
印记控制区（ICR）小鼠上海实验动物中心SCXK 2007-0005体内研究
Sprague Dawley 大鼠上海实验动物中心SCXK 2007-0005含EXD血清制备
注射器滤器默克密理博SLGP033RB0.22 µm
灌胃针（10 ml）上海博格贸易销售部59104274EXD的给药
氯胺酮（80 mg/kg） 福建古田药业有限公司H35020148麻醉
赛拉嗪（10 mg/kg）Sunway Pharma Co. LtdCB07591麻醉
杜尔贝科’s 改良的伊格尔培养基’s 培养基 Dulbecco 改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco12800-116含2 mM L-谷氨酰胺且不含核糖核苷和核糖核苷酸的DMEM
链霉素Sigma1277100 µg / ml
青霉素Sigma4687100 µg / ml

参考文献

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