从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰

摘要

本方法中，我们介绍了从多种小鼠组织中快速高效分离中间丝（IF）蛋白的生化操作流程。分离得到的中间丝可用于通过质谱及其他生化实验研究翻译后修饰的变化。

摘要

中间纤维（IFs）与肌动蛋白纤维和微管共同构成细胞骨架——这是每个细胞的关键结构组分。正常功能的中间纤维为细胞提供机械强度和抗应激能力，而功能异常的中间纤维细胞骨架会损害细胞健康，并与多种人类疾病相关。翻译后修饰（PTMs）在生理变化和应激条件下对中间纤维的动态行为起关键调控作用。因此，监测中间纤维PTM特征变化的能力有助于更深入地理解其功能，最终阐明中间纤维系统在细胞损伤过程中作为应激响应者的调控机制。然而，中间纤维蛋白种类繁多，由超过70个独立基因编码，并以组织依赖性方式表达，这为厘清不同PTM的相对重要性带来了重大挑战。为此，能够在整个生物体水平上而非仅针对家族中个别成员监测中间纤维蛋白PTM的方法，可加速该领域的研究进展。本文介绍了从9种不同小鼠组织（脑、心脏、肺、肝、小肠、大肠、胰腺、肾脏和脾脏）中分离总中间纤维蛋白、去垢剂可溶性及去垢剂不溶性组分的生化方法。我们进一步展示了一种利用裂解矩阵和自动化匀浆技术快速分离不同小鼠组织中间纤维蛋白的优化方案。该自动化方案适用于高样本量实验（如涉及多只动物和多个实验组的疾病模型）中的中间纤维蛋白分析。所获得的样品可用于多种下游分析，包括基于质谱的PTM谱型分析。利用这些方法，我们提供了新的数据，表明在衰老过程中，不同小鼠组织（脑和肝）中的中间纤维蛋白在其表达水平和翻译后修饰方面均发生平行变化。

引言

中间纤维（IF）是一类蛋白质家族，在人类中由73个基因编码，并分为六大主要类型：I至IV型为胞质中间纤维（例如上皮和毛发角蛋白（K）、肌细胞结蛋白、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等）；V型为核纤层蛋白（lamins）；VI型为晶状体中的中间纤维¹。从分子结构来看，IF蛋白具有三个共同的结构域：一个高度保守的卷曲螺旋"杆状"结构域，以及球状的"头部"和"尾部"结构域。IF蛋白四聚体组装形成短的纤维前体，最终整合为成熟的纤维，构成动态的细胞骨架和核骨架结构，参与机械保护²、应力感知^3,4、转录与生长调控⁵以及其他关键的细胞功能^1,6,7。

中间纤维（IF）系统的重要功能体现在由IF基因错义突变引起的多种人类疾病中，包括神经病变、肌病、皮肤脆性障碍、代谢功能障碍以及早衰综合征⁸。某些IF基因突变虽不直接致病，但会使携带者更易发生疾病进展，例如简....

方案

该实验方案经北卡罗来纳大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照其规定执行。

1. 准备工作

1. 配制Triton-X缓冲液（1% Triton X-100，5 mM乙二胺四乙酸（EDTA），用磷酸盐缓冲液（PBS）定容至所需体积，pH 7.4）。配制500 mL：将5 mL Triton X-100和5 mL 500 mM EDTA加入490 mL pH 7.4的PBS中，搅拌混匀。Triton-X缓冲液储存于4 °C。
2. 制备高盐缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.6，140 mM NaCl，1.5 M KCl，5 mM EDTA，0.5% Triton X-100，用双蒸水（ddH₂O）定容）₂O)。配制500 mL：加入10 mL 0.5 M Tris-HCl（pH 7.6）、14 mL 5 M NaCl、55.9 g KCl、5 mL 0.5 M EDTA 和 2.5 mL Triton X-100，用双蒸水定容至500 mL。高盐缓冲液于4 °C保存。
3. 使用前，向适量的Triton-X和高盐缓冲液中补充例如 每25 mg组织样本加入1 mL含有蛋白酶或蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的裂解液，弃去剩余含抑制剂的缓冲液。
4. 在1×PBS（pH 7.4）中配制5 mM EDTA溶液。配制500 mL：将5 mL 0.5 M EDTA加入495 mL 1×PBS（pH 7.4）中....

结果

一种利用裂解矩阵从多种小鼠组织中快速提取高盐可溶性IF蛋白的新方法。

从上皮组织中分离大部分中间丝蛋白组分的传统方法^25,26在本研究中进行了改进，以适用于9种不同器官，并采用更快速的组织裂解流程。传统方法需要进行3次手动匀浆步骤，而改进后的方法仅需1次手动匀浆，显著缩短了操作时间，尤其在处理超过6个样本时更为高效。图1A展示了从小鼠9种组织中提取的HSE的典型结果，而图1B则列出了各组织中预期的蛋白质及其分子量，以供比较。需要注意的是，新的自动化方法在胰腺和脾脏组织上的效果不佳；对于这些组织，仍推荐使用传统的匀浆程序。该方法可用于在多种组织中以统一的方式分析.......

讨论

能够实现对中间纤维（IF）蛋白进行生化表征的方法，有助于理解哺乳动物系统中的多种病理生理现象，因为IF蛋白既是细胞和组织应激的标志物，也是其调节因子²⁹。本方法的原理基于20世纪70年代和80年代建立的早期实验流程，这些流程通常使用低盐和高盐溶液以及Triton-X100去污剂，用于从细胞和组织中分离、纯化并重建IF蛋白^{25,30,31,32,33,34,35}。有关支持IF蛋白生化分离研究的历史背景，请参阅近期的综述文章^36,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	免疫沉淀珠
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	用于缓冲液配制
Purelink RNA mini kit	ThermoFisher Scientific	12183018	从组织中提取RNA
Purelink DNAse set	ThermoFisher Scientific	12185010A	柱上DNA消化
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	用于Dynabeads的磁力架
GelCode Blue Stain Reagent	ThermoFisher Scientific	24592	适用于质谱分析的凝胶染色剂
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher Scientific	32106	用于Western blot检测
High Capacity cDNA reverse transcription kit	ThermoFisher Scientific	4368813	用于基因表达分析
Proflex 3 x 32-well PCR System	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR系统
PVDF转移膜	ThermoFisher Scientific	88520	用于Western blot
Power Up SYBR master mix	ThermoFisher Scientific	A25778	用于qPCR分析
RNA保存液（RNAlater）	ThermoFisher Scientific	AM7020	RNA提取前组织保存用溶液
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	预制蛋白凝胶
抗角蛋白8抗体（TS1）	ThermoFisher Scientific	MA514428	用于Western blot检测K8
抗波形蛋白抗体（Anti-Vimentin）	ThermoFisher Scientific	MA511883	用于Western blot检测波形蛋白
Tris Glycine转移缓冲液（25倍浓缩液）	ThermoFisher Scientific	LC3675	用于蛋白凝胶湿法转膜
2x SDS上样缓冲液	ThermoFisher Scientific	LC2676	用于蛋白凝胶样品制备
Tris Glycine SDS电泳缓冲液（10倍浓缩液）	ThermoFisher Scientific	LC26755	用于蛋白凝胶电泳
裂解珠 - Matrix D	MP Biomedicals	116913100	用于组织破碎及RNA提取的裂解珠和基质管
裂解珠 - Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	用于组织破碎及蛋白提取的裂解珠和基质管
NanoDrop Lite分光光度计	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	用于蛋白质和核酸的定量检测
Precellys 24组织匀浆仪	Bertin Instruments	EQ03119	自动化组织匀浆设备