从多个小鼠组织分离中间丝状蛋白以研究与老化相关的翻译后修饰

摘要

在这种方法中，我们提出了从多个小鼠组织快速高效地分离中间丝（IF）蛋白质的生物化学方法。分离的IF可用于通过质谱法和其他生化测定法研究翻译后修饰的变化。

摘要

中间丝（IFs）与肌动蛋白丝和微管一起形成细胞骨架 - 每个细胞的关键结构元件。正常功能的IF为细胞提供机械和应激弹性，而功能失调的IF细胞骨架损害细胞健康，并与许多人类疾病相关。翻译后修饰（PTM）对生理变化和应激条件下的IF动力学进行了严格的调节。因此，监测IFM的PTM签名变化的能力可以有助于在细胞损伤期间作为应激反应者的IF系统的更好的功能理解和最终调节。然而，由超过70个个体基因编码并以组织依赖性方式表达的大量IF蛋白质是排除不同PTM相对重要性的主要挑战。为此，可以监测IF蛋白上的PTMs的方法在生物体层面上，而不是孤立的家庭成员，可以加速这一领域的研究进展。在这里，我们提出生物化学方法，从9种不同的小鼠组织（脑，心脏，肺，肝，小肠，大肠，胰腺，肾脏和）分离IF蛋白的总，洗涤剂可溶性和去污剂抗性分数脾）。我们进一步展示了通过使用裂解基质和不同小鼠组织的自动均质化来快速分离IF蛋白的优化方案。自动化方案对于在具有高样品体积的实验中（例如涉及多个动物和实验组的疾病模型）中的IF进行分析是有用的。所得样品可用于各种下游分析，包括基于质谱的PTM分析。利用这些方法，我们提供新的数据，显示不同小鼠组织（脑和肝）中的IF蛋白在其表达方面发生平行变化老龄化期间的PTMs。

引言

IF是一系列蛋白质，在人类中由73个基因编码并分为六种主要类型:I-IV型是细胞质（ 例如上皮和毛发角蛋白（K），肌细胞结蛋白，神经丝，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和别的）; V型是核脂肪;并且VI型是眼镜¹中的IF。在其分子组织方面，IF蛋白质具有三个共同的结构域:高度保守的螺旋线圈"棒"结构域，以及球状"头"和"尾"结构域。 IF蛋白质四聚体组装形成短丝前体，其最终并入成熟细丝中，其形成涉及机械保护的动态细胞骨架和核结构结构² ，应激感测^3,4 ，调节转录⁵和生长以及其他关键细胞功能"> ^1,6,7 。

由IF基因错义突变引起的许多人类疾病的存在突出了IF系统的功能重要性，包括神经病，肌病，皮肤脆性障碍，代谢功能障碍和早衰症候群⁸ 。一些IF基因突变不会引起疾病进展的倾向，如肝脏疾病中的简单上皮角蛋白⁹ 。后者是由于上皮中的IF的临界应力保护功能。一般来说，IF在基础条件下是最丰富的细胞蛋白，但在各种类型的应激¹⁰中进一步强烈诱导。例如，最近对线虫线虫的蛋白质组范围变化进行的研究表明，多个IF被高度上调并且易于聚集在有机体老化^11,12 。由于维持适当的IF结构对于细胞对各种形式的应力^10的抵抗是至关重要的，所以IF聚集也可能导致衰老过程中的功能下降。然而，缺乏在不同组织中进行压力检测多种哺乳动物IF蛋白的有机体水平的研究。

IF是高度动态的结构，可以适应蜂窝需求。例如，角蛋白经历可溶性（非丝状）和不溶性（丝状）蛋白质池¹³之间的生物合成非依赖性循环。在正常的生理条件下，约5％的K8 / K18总库可以在无洗涤剂的缓冲液中提取，相比之下可以溶解在非离子型洗涤剂Nonidet P-40中的约20％，这是与Triton- X100 ^{14 ， 15} 。在有丝分裂期间，简单型上皮K8和K1814的溶解度显着增加，这在表皮角蛋白中不太明显，但在波形蛋白和其他III型IF蛋白^{15,16 中}更为明显。 IF蛋白的溶解性质通过磷酸化来进行严格调控，磷酸化是针对灯丝重排和溶解度的关键的翻译后修饰（PTM）17,18,19,20。大多数IF受到保护地点的多个PTM的广泛监管，导致功能变化¹⁷ 。

这种方法的目的是引入新的IF领域的研究人员进行生物化学提取和多个小鼠组织中IF蛋白研究的分析方法。具体盟军，我们专注于使用高盐提取方法分离IF蛋白，并通过质谱法和PTM靶向抗体评估PTMs的变化。这些方法基于以前发布的程序^21，但包括用于提取不同IF蛋白类型的修饰，以揭示通过IF家族调节的常见机制。例如，特定赖氨酸残基处的K8乙酰化调节细丝组织，而超乙酰化促进K8不溶性和聚集体形成²² 。最近的全球蛋白质组学分析研究还发现，大多数组织特异性IF蛋白质也是乙酰化的靶标，大多数IF乙酰化位点被限制在高度保守的杆结构域。这突出表明需要适合IF系统的全局分析的方法。我们还介绍了使用Opti自动均质化从多组织分离IF蛋白的快速方法大小溶解基质。所得制剂适用于通过质谱法和其他方法进行下游PTM分析。

方案

该协议是根据北卡罗来纳大学的机构动物保护和使用委员会（IACUC）批准和执行的。

准备工作

1. 制备Triton-X缓冲液（1％Triton X-100,5mM乙二胺四乙酸（EDTA）），在磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4中调高体积）。制成500mL:将Triton X-100和500mM EDTA各5mL搅拌至490mL PBS（pH7.4）中。在4℃下储存Triton-X缓冲溶液。
2. 制备高盐缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.6,140mM NaCl，1.5M KCl，5mM EDTA，0.5％Triton X-100，在双蒸馏（dd）H ₂ O中调出体积）。制成500毫升:搅拌10mL 0.5M Tris-HCl（pH7.6），14mL 5M NaCl，55.9克KCl，5毫升0.5M EDTA和2.5毫升Triton X-100，将体积调至500 mL，使用双蒸水）。在4°C储存高盐缓冲溶液。
3. 在使用前，补充适量的Triton-X和高盐缓冲液例如，每25mg组织样品1mL）与蛋白酶或蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合，并丢弃任何不含有抑制剂的缓冲液。
4. 在1×PBS，pH 7.4中制备5mM EDTA。制成500mL:将5mL的0.5M EDTA搅拌到495mL的1×PBS，pH7.4中。
5. 使用符合兽医指南和机构标准的认可方案，分离不同的小鼠器官（脑，心脏，肺，肝，胰腺，结肠，肠，肾，脾） ²³ 。组织采集程序应不超过5分钟，以保持富含蛋白酶的组织的RNA和蛋白质完整性（ 例如胰腺应先处理）。
6. 切割少量组织（〜5-20mg）并置于RNA储存溶液中，用于随后的RNA提取，cDNA合成和IF基因表达的定量实时PCR分析。将RNA储存溶液管与组织放置在4℃过夜，并遵循制造商协议进一步的折叠和隔离步骤。
7. 将其余的组织切成更小的碎片（ 例如 0.5厘米），并置于低温条件下。快速冷冻并将样品瓶储存在-80°C或液氮下长期储存。

IF基因表达分析

1. 从保存在RNA储存溶液试剂中的组织中提取RNA。根据制造商的方案使用任何合适/优选的RNA提取方法。
2. 定量RNA浓度，并使用2μgRNA根据制造商的方案使用合适的逆转录试剂盒产生cDNA。
3. 使用生成的cDNA和小鼠IF基因特异性引物设置qPCR反应，包括每个样品的三个技术重复以及根据制造商的方案的空白对照。
4. 将IF基因表达定量为比较不同条件（ 例如年轻组织和老组织）的折叠变化。

3. P用于免疫印迹的总组织裂解物的修复

1. 在1mL的2x还原SDS样品缓冲液中均化25mg的组织。如果要进行比色蛋白测定以量化蛋白质浓度，则从样品缓冲液中除去溴酚蓝染料。
2. 加入5％（v / v）的2-巯基乙醇（2-ME）以制备还原样品。向200μL非还原样品中加入10μL2-ME。
3. 使用洗涤剂和还原剂相容的蛋白质测定法确定蛋白质浓度。如果染料已经包含在样品缓冲液中，蛋白质量可以通过许多技术运行凝胶之后估算，包括考马斯染色剂²⁴ 。
4. 涡旋所有样品并在95℃加热5分钟。
5. 在还原和非还原条件下进行Western印迹。短暂暴露膜（<1分钟）以显示单体物质，并且更长（> 1分钟）以显示高分子量复合物包含ng IF蛋白。如果监测聚集，检查整个凝胶/膜（包括凝胶孔的底部）。
6. 运行平行凝胶，并用蛋白质染色剂作为载体对照染色²⁴ 。在疾病模型或损伤实验中，总蛋白质染色应用作加载对照，而不是用于"内部"蛋白质（ 例如肌动蛋白，GAPDH）的免疫印迹，因为后者在不同应力条件下发生变化。

4.组织特异性IF的洗涤剂可溶性和高盐提取物的制备

1. 将1mL冰冷的Triton X-100缓冲液加入玻璃管匀浆器中并置于冰上。
2. 从液氮储存中取出一小块薄片（约25 mg），并直接放入玻璃均化器中。使用聚四氟乙烯杵匀浆（50冲程），避免产生气泡。始终保持匀浆器和裂解液冷。
3. 将裂解液转移至1.5 mL micr离心管在冰上并在预冷却的离心机（4℃）中以20,000×g离心10分钟。
4. 将上清液部分收集到单独的管中。这是Triton X-可溶性级分，可用于免疫沉淀（ip）和可洗涤剂溶解的IF蛋白库的分析。注意，步骤4.1-4.4可以重复以实现来自脑组织的更清洁的IF提取物。
5. 将1 mL高盐缓冲液加入组织沉淀中，转移至干净的匀浆器中，并行100次。将匀浆转移回微量离心管，并将管置于冷藏室中的旋转振荡器上1小时。
6. 在4℃下以20,000×g离心匀浆20分钟。丢弃上清液。
7. 将1mL冰冷的PBS / EDTA缓冲液加入到沉淀中，并将其在干净的均化器中匀浆（20次），作为最终的清理步骤*。转移到新管中，在4℃下以20,000×g离心10分钟，得到IF蛋白 -丰富的高盐提取物（HSE）。
   *任选地，在该步骤中涡旋而不是均质化。
8. 弃去上清液，并将丸粒溶解在300μL已预热的非还原性SDS样品缓冲液中。首先通过移液和涡旋破碎颗粒，然后在95℃下加热样品5分钟。
9. 涡流和移液管，以确保颗粒溶解。完全溶解颗粒可能需要几分钟的时间。
10. 将所有样品储存在-20°C直到分析。

5.大容量实验中IF蛋白提取的自动组织裂解

1. 对于RNA提取，将裂解缓冲液（每25mg组织600μL缓冲液）置于含有裂解基质D（使用小陶瓷球）的管中，并在组织溶液中脉冲两次25秒。通过以20,000×g离心分离裂解物与基质，并分离进行下一步骤。
2. 对于蛋白质提取，放置Trit在X-100（或SDS样品缓冲液，如果准备总裂解物）在裂解管与裂解基质SS（使用单个不锈钢珠）。在测试多个矩阵之后，选择它是因为它产生的IF蛋白质提取物质量与传统的去抖动方法相同。请注意，自动化方法对胰腺和脾脏不是最佳的，标准均质方案应用于这些组织。
3. 要进行高盐提取物的制备，使用磁铁从管中取出不锈钢珠，并在4℃下以20,000 xg离心管10分钟。
4. 继续执行手册中的步骤4.4（以上）。
5. 将所有样品储存在-20°C直到分析。

6.翻译后修饰的IF蛋白的免疫富集

1. 准备PBST缓冲液（0.02％Tween-20在PBS中）。加入10 mL Tween-20至50 mL PBS（pH 7.4）。
2. 制备PTM抗体溶液（200μLPBST中的1-10μg抗体）。一般来说，3μg抗体/反应是一个很好的起始条件，如果需要可进一步优化。
3. 对于每个反应，将50μL磁珠等分成微量离心管，置于磁体上并吸出珠子储存溶液。
4. 通过重新悬浮在抗体溶液中并在室温下孵育20分钟，将珠子与免疫沉淀抗体相结合，并在旋转器（端到端，确保小体积的混合物）上孵育20分钟。
5. 将管置于磁铁上并吸出抗体溶液。
6. 在200μLPBST中冲洗抗体缀合的珠粒一次，并清洗洗涤缓冲液。
7. 将0.6-1mL的组织裂解物加入珠中，通过温和移液混合并在冷室中在旋转器上孵育3小时。
8. 将管置于磁体上，除去溶胞产物，并用200μLPBST洗珠5次。最后洗涤步骤后，收集珠子在100 _6; L的PBS（不含Tween-20）并转移到干净的新管中。将管放在磁铁上。
9. 吸出PBS并加入100μL非还原样品缓冲液。取出50μL，加入2-ME（5％）以制备还原样品。将样品加热至95°C 5分钟。
10. 将ip分数与磁铁上的珠子分开，并将其收集到新的管中。
11. 将样品储存在-20°C直到分析。

7.制备用于质谱分析的IF蛋白质样品

1. 在开始研究之前安排与蛋白质组学专家的磋商，因为质谱分析涉及到大量时间和成本。
2. 采取特殊预防措施，避免污染。用干净的手套处理所有凝胶，并在干净的容器中孵育，仅使用ddH ₂ O（避免使用肥皂）洗涤。
3. 根据标准条件，在SDS-PAGE凝胶上运行20-50μL的HSE样品（来自第4和第5部分）。
4. 用蛋白质污渍染色1小时。漂洗多次，并在ddH ₂ O中脱色过夜。去蛋白后，IF蛋白带应易于看到。
5. 将凝胶放置在塑料片保护膜之间，扫描并标记将被切除并发送用于分析的条带。
6. 使用新的干净剃须刀消除IF蛋白质条带。
7. 将凝胶带置于干净的微量离心管中并转移到质谱仪中。

结果

一种使用裂解基质从多个小鼠组织中高度盐提取IF蛋白的新的快速方法。

在这里修饰了分离大部分中间丝蛋白部分与上皮组织的传统方法^25,26以包括9种不同的器官和更快速的组织溶解过程。虽然传统方法需要3个手动均质步骤，但修改过程只有1个手动均质步骤，可以将程序缩短几个小时，特别是当处理6个以上样品时。 图1A显示了来自9只小鼠组织的HSE的典型结果，而组织中预期蛋白质的表和每种蛋白质的分子量如图1B所示

肝脏K8和K18被强烈上调，并在老鼠肝脏中经历增加的磷酸化和赖氨酸乙酰化。...

讨论

使IF蛋白的生物化学表征的方法可用于了解哺乳动物系统中的许多病理生理现象，因为IF蛋白既是细胞和组织应激的标志物和调节剂。目前的方法背后的原理是基于20世纪70年代和80年代开发的初步程序，从细胞和组织中分离，分离和重建IF蛋白，一般采用低盐和高盐溶液和Triton-X100洗涤剂25,30,31,32 ^{， 33,34,35} 。对于支持IF蛋白生化分离的研究的历史见解，请参见最近的评论^36,37 。目前的方法是基于为研究简单上皮角蛋白^{26开发的更新的方案} 。该方法的优点在于它可以作为初步步骤，使得新进IF领域的研究人员可以有效地从大多数哺乳动物组织中分离IF蛋白。它代表了现场研究人员广泛使用的相关程序的视觉指南，以研究IF蛋白质调节21,38。

这种技术可用于研究哺乳动物组织^39,40之间应激通信机制中IF的调节和功能。在一个组织中的压力可以影响其他组织的功能，例如在营养...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dynabeads 蛋白 G	ThermoFisher Scientific	10009	免疫沉淀微珠
缓冲液	PBS	ThermoFisher Scientific	10010049
Purelink RNA 小量提取试剂盒	ThermoFisher	12183018	从组织中提取
Purelink DNA 酶套装	Thermo Fisher Scientific	12185010A	色谱柱 DNA 消化
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	磁力架，用于 dynabeads
GelCode Blue 染色试剂	、ThermoFisher Scientific	24592	质谱兼容凝胶染色
Pierce ECL 蛋白质印迹底物	ThermoFisher Scientific	32106	用于蛋白质印迹
、高容量 cDNA 逆转录试剂盒、	ThermoFisher Scientific	4368813	用于基因表达分析
Proflex 3 x 32 孔 PCR 系统	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR 系统
PVDF 转移膜	用于蛋白质印迹	ThermoFisher Scientific	88520
用于 Power Up SYBR 预混液	用于 qPCR 分析	ThermoFisher Scientific	A25778
RNA分离	ThermoFisher Scientific	AM7020	溶液 用于 RNA 分离前的组织储存
Novex 4-20% Tris 甘氨酸凝胶	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	预制蛋白凝胶
抗角蛋白 8抗体 （TS1）	K8 抗波形蛋白蛋白质印迹检测	ThermoFisher Scientific
	MA511883 MA514428	波形蛋白
Tris 甘氨酸转印缓冲液 （25x）	ThermoFisher Scientific	LC3675	蛋白质凝胶湿转印
2x SDS 样品缓冲液	ThermoFisher Scientific	LC2676	用于制备蛋白质凝胶样品
Tris 甘氨酸 SDS 电泳缓冲液 （10x）	电泳蛋白凝胶的	ThermoFisher Scientific	LC26755
解微珠 - Matrix D	MP Biomedicals	116913100	用于组织破碎和 RNA 提取的裂解微珠和基质管
裂解微珠 - Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	用于组织破碎和蛋白质提取的裂解微珠和基质管
NanoDrop Lite 分光光度计	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	蛋白质和核酸测量
Precellys 24 匀浆仪	Bertin Instruments	EQ03119	自动组织匀浆仪