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方法文章

从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰

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DOI：

10.3791/55655

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2017年5月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

本方法中，我们介绍了从多种小鼠组织中快速高效分离中间丝（IF）蛋白的生化操作流程。分离得到的中间丝可用于通过质谱及其他生化实验研究翻译后修饰的变化。

摘要

中间纤维（IFs）与肌动蛋白纤维和微管共同构成细胞骨架——这是每个细胞的关键结构组分。正常功能的中间纤维为细胞提供机械强度和抗应激能力，而功能异常的中间纤维细胞骨架会损害细胞健康，并与多种人类疾病相关。翻译后修饰（PTMs）在生理变化和应激条件下对中间纤维的动态行为起关键调控作用。因此，监测中间纤维PTM特征变化的能力有助于更深入地理解其功能，最终阐明中间纤维系统在细胞损伤过程中作为应激响应者的调控机制。然而，中间纤维蛋白种类繁多，由超过70个独立基因编码，并以组织依赖性方式表达，这为厘清不同PTM的相对重要性带来了重大挑战。为此，能够在整个生物体水平上而非仅针对家族中个别成员监测中间纤维蛋白PTM的方法，可加速该领域的研究进展。本文介绍了从9种不同小鼠组织（脑、心脏、肺、肝、小肠、大肠、胰腺、肾脏和脾脏）中分离总中间纤维蛋白、去垢剂可溶性及去垢剂不溶性组分的生化方法。我们进一步展示了一种利用裂解矩阵和自动化匀浆技术快速分离不同小鼠组织中间纤维蛋白的优化方案。该自动化方案适用于高样本量实验（如涉及多只动物和多个实验组的疾病模型）中的中间纤维蛋白分析。所获得的样品可用于多种下游分析，包括基于质谱的PTM谱型分析。利用这些方法，我们提供了新的数据，表明在衰老过程中，不同小鼠组织（脑和肝）中的中间纤维蛋白在其表达水平和翻译后修饰方面均发生平行变化。

引言

中间纤维（IF）是一类蛋白质家族，在人类中由73个基因编码，并分为六大主要类型：I至IV型为胞质中间纤维（例如上皮和毛发角蛋白（K）、肌细胞结蛋白、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等）；V型为核纤层蛋白（lamins）；VI型为晶状体中的中间纤维1。从分子结构来看，IF蛋白具有三个共同的结构域：一个高度保守的卷曲螺旋"杆状"结构域，以及球状的"头部"和"尾部"结构域。IF蛋白四聚体组装形成短的纤维前体，最终整合为成熟的纤维，构成动态的细胞骨架和核骨架结构，参与机械保护2、应力感知3,4、转录与生长调控5以及其他关键的细胞功能1,6,7。

中间纤维（IF）系统的重要功能体现在由IF基因错义突变引起的多种人类疾病中，包括神经病变、肌病、皮肤脆性障碍、代谢功能障碍以及早衰综合征8。某些IF基因突变虽不直接致病，但会使携带者更易发生疾病进展，例如简单上皮角蛋白在肝病中的作用9。这归因于中间纤维在上皮组织中关键的应激保护功能。在基础状态下，IF通常是细胞中最丰富的蛋白质之一，但在多种应激条件下其表达会进一步显著上调10。例如，近期针对线虫C. elegans全蛋白质组变化的研究表明，多种IF在机体衰老过程中表达显著升高，并易于形成聚集体11,12。由于维持正常的IF结构对于细胞抵抗各种应激至关重要10，因此IF的聚集也可能导致衰老过程中的功能衰退。然而，目前尚缺乏在机体水平上针对不同组织中多种哺乳动物IF蛋白在应激条件下变化的系统性研究。

中间纤维（IFs）是高度动态的结构，能够适应细胞的需求。例如，角蛋白在可溶性（非纤维状）和不溶性（纤维状）蛋白池之间进行不依赖生物合成的循环13。在正常的生理条件下，约5%的总K8/K18蛋白池可在无去垢剂的缓冲液中被提取，相比之下，约20%的蛋白可在非离子型去垢剂Nonidet P-40中溶解，其生化性质与Triton-X100相当14,15。在有丝分裂期间，简单型上皮角蛋白K8和K18的溶解度显著增加14，这种现象在表皮角蛋白中较不明显，但在波形蛋白（vimentin）和其他III型中间纤维蛋白中更为显著15,16。中间纤维蛋白的溶解特性受到磷酸化的严格调控，磷酸化是一种关键的翻译后修饰（PTM），对纤维的重排和溶解性至关重要17,18,19,20。大多数中间纤维蛋白在保守位点受到多种翻译后修饰的广泛调控，从而导致功能上的改变17。

本方法旨在向初次接触中间纤维（IF）领域的研究人员介绍一种跨多种小鼠组织的IF蛋白生化提取及分析技术。具体而言，我们重点介绍采用高盐提取法分离IF蛋白，并通过质谱分析以及针对特定翻译后修饰（PTM）的抗体来评估PTMs的变化。这些方法在先前已发表的方案基础上进行了改进21，增加了适用于提取不同类型IF蛋白的优化步骤，以揭示IF蛋白家族中共同的调控机制。例如，K8蛋白在特定赖氨酸残基上的乙酰化可调控中间纤维的结构组织，而过度乙酰化则会导致K8溶解度降低并促进聚集体形成22。近期的全蛋白质组分析研究进一步发现，大多数组织特异性IF蛋白同样是乙酰化的靶标，且大多数IF蛋白的乙酰化位点集中于高度保守的杆状结构域。这凸显了建立适用于IF系统全局分析方法的必要性。此外，我们还介绍了一种利用优化裂解基质进行自动化匀浆处理，从而快速从多种组织中分离IF蛋白的方法。所获得的蛋白样品适用于后续通过质谱及其他方法进行翻译后修饰分析。

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方案

该实验方案经北卡罗来纳大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照其规定执行。

1. 准备工作

  1. 配制Triton-X缓冲液（1% Triton X-100，5 mM乙二胺四乙酸（EDTA），用磷酸盐缓冲液（PBS）定容至所需体积，pH 7.4）。配制500 mL：将5 mL Triton X-100和5 mL 500 mM EDTA加入490 mL pH 7.4的PBS中，搅拌混匀。Triton-X缓冲液储存于4 °C。
  2. 制备高盐缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.6，140 mM NaCl，1.5 M KCl，5 mM EDTA，0.5% Triton X-100，用双蒸水（ddH₂O）定容）2O)。配制500 mL：加入10 mL 0.5 M Tris-HCl（pH 7.6）、14 mL 5 M NaCl、55.9 g KCl、5 mL 0.5 M EDTA 和 2.5 mL Triton X-100，用双蒸水定容至500 mL。高盐缓冲液于4 °C保存。
  3. 使用前，向适量的Triton-X和高盐缓冲液中补充例如 每25 mg组织样本加入1 mL含有蛋白酶或蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的裂解液，弃去剩余含抑制剂的缓冲液。
  4. 在1×PBS（pH 7.4）中配制5 mM EDTA溶液。配制500 mL：将5 mL 0.5 M EDTA加入495 mL 1×PBS（pH 7.4）中，搅拌混匀。
  5. 采用符合兽医指南和机构标准的批准方案，分离不同小鼠器官（脑、心脏、肺、肝、胰腺、结肠、肠、肾、脾）23组织采集过程不应超过5分钟，以保持富含蛋白酶组织中RNA和蛋白质的完整性例如 胰腺应首先处理。
  6. 剪取少量组织（约5-20 mg），置于RNA保存液中，用于后续RNA提取、cDNA合成及IF基因表达的定量实时PCR分析。将含有组织的RNA保存液管于4 °C过夜放置，随后按照试剂盒说明书进行进一步的保存与RNA提取操作。
  7. 将剩余组织切成更小的碎片（例如 0.5 cm）并放入冻存管中。速冻后于 -80 °C 或液氮中长期保存。

2. IF 基因表达分析

  1. 从保存在RNA保存液试剂中的组织中提取RNA。根据制造商说明书，采用任何合适的/偏好的RNA提取方法。
  2. 定量RNA浓度，并使用2 μg RNA，根据制造商说明书，利用合适的反转录试剂盒合成cDNA。
  3. 使用所获得的cDNA和小鼠IF基因特异性引物进行qPCR反应，每个样本设置三个技术重复，并包括空白对照，具体操作依据制造商说明书。
  4. 通过比较不同条件（例如年轻组织与老年组织）下的表达水平，以倍数变化（fold change）形式量化IF基因的表达。

3. 免疫印迹用全组织裂解液的制备

  1. 将25 mg组织在1 mL 2×非还原型SDS样品缓冲液中匀浆。若需进行比色法蛋白质定量测定以确定蛋白质浓度，则样品缓冲液中应 omit 溴酚蓝染料。
  2. 向非还原样品中加入2-巯基乙醇（2-ME），使其终体积比为5%（v/v），以制备还原样品。向200 μL的非还原样品中加入10 μL的2-ME。
  3. 使用兼容去垢剂和还原剂的蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。如果样品缓冲液中已含有染料，可通过多种技术在跑胶后估算蛋白质含量，包括基于考马斯亮蓝的染色方法24.
  4. 将所有样品涡旋混匀，并在95 °C下加热5分钟。
  5. 在还原和非还原条件下进行蛋白质印迹实验。短暂暴露膜<1 分钟）以显示单体物种，更长时间（>1 分钟）以显示含有中间纤维蛋白的高分子质量复合物。若监测聚集情况，应检查整个凝胶/膜（包括凝胶加样孔底部）。
  6. 运行一块平行凝胶，并使用蛋白质染色作为上样对照24在疾病模型或损伤实验中，应使用总蛋白染色作为上样对照，而非针对“看家”蛋白的免疫印迹例如 肌动蛋白、GAPDH）因为后者在不同应激条件下会发生变化。

4. 组织特异性中间丝的去垢剂可溶性提取物和高盐提取物的制备

  1. 将1 mL预冷的Triton X-100缓冲液加入玻璃匀浆器中，并置于冰上。
  2. 从液氮中取出一小块组织（约25 mg），直接放入玻璃匀浆器中。使用聚四氟乙烯研杵匀浆（50次），避免产生气泡。始终确保匀浆器和裂解物保持低温。
  3. 将裂解物转移至冰上的1.5 mL微量离心管中，在预冷的离心机（4 °C）中以20,000 × g离心10分钟。
  4. 收集上清液至另一管中。此为Triton X-100可溶性组分，可用于免疫沉淀（i.p.）及中间纤维蛋白（IF蛋白）的去垢剂可溶性池分析。注意：步骤4.1–4.4可重复进行，以从脑组织中获得更纯净的IF提取物。
  5. 向组织沉淀中加入1 mL高盐缓冲液，转移至洁净的匀浆器中，研磨100次。将匀浆液重新转移至微量离心管中，置于4 °C冷室内的旋转摇床上孵育1小时。
  6. 在4 °C条件下，以20,000 × g离心20分钟。弃去上清液。
  7. 向沉淀中加入1 mL预冷的PBS/EDTA缓冲液，在洁净的匀浆器中匀浆（20次），作为最终的清洗步骤*。转移至新管中，在4 °C下以20,000 × g离心10分钟，获得富含IF蛋白的高盐提取物（HSE）。
    * 可选：此步骤可用涡旋振荡代替匀浆。
  8. 弃去上清液，将沉淀溶解于300 μL预热的非还原性SDS样品缓冲液中。先通过移液和涡旋振荡初步打散沉淀，然后在95 °C加热5分钟。
  9. 根据需要进行涡旋和移液，确保沉淀完全溶解。完全溶解可能需要数分钟。
  10. 将所有样品储存于-20 °C，直至分析。

5. 高通量实验中用于免疫荧光蛋白提取的自动化组织裂解

  1. 进行RNA提取时，将裂解缓冲液（每25 mg组织加入600 μL缓冲液）加入含有溶菌矩阵D（含小型陶瓷珠）的离心管中，在组织破碎仪中脉冲振荡两次，每次25秒。以20,000 × g离心分离裂解液与矩阵，随后进入纯化步骤的下一步。
  2. 进行蛋白质提取时，将Triton X-100（若制备全裂解液则使用SDS上样缓冲液）加入含有溶菌矩阵SS（使用单个不锈钢珠）的裂解管中。经测试多种矩阵后，选择该条件因其所得中间纤维蛋白提取物的质量与传统Dounce匀浆法相当。需注意，该自动化方法不适用于胰腺和脾脏，这些组织应采用标准匀浆方案。
  3. 如需制备高盐提取物，使用磁铁从管中移除不锈钢珠，并在4 °C下以20,000 × g离心10分钟。
  4. 继续执行手动方案中的第4.4步（上文）。
  5. 所有样品在分析前均应储存于-20 °C。

6. 翻译后修饰的中间纤维蛋白的免疫富集

  1. 配制 PBST 缓冲液（含 0.02% Tween-20 的 PBS）。配制 50 mL 时，将 10 μL Tween-20 加入 50 mL PBS（pH 7.4）中。
  2. 配制 PTM 抗体溶液（将 1–10 μg 抗体溶于 200 μL PBST 中）。通常，每反应使用 3 μg 抗体是一个良好的起始条件，可根据需要进一步优化。
  3. 每个反应中，将 50 μL 磁珠分装至微量离心管中，置于磁力架上，吸除磁珠储存液。
  4. 用抗体溶液重悬磁珠，使磁珠与免疫沉淀抗体偶联，并在室温下置于旋转仪（翻转混合，以确保小体积充分混匀）上孵育 20 分钟。
  5. 将离心管置于磁力架上，吸除抗体溶液。
  6. 用 200 μL PBST 将偶联抗体的磁珠洗涤一次，去除洗涤液。
  7. 向磁珠中加入 0.6–1 mL 组织裂解液，轻轻吹打混匀，于 4°C 冷室中在旋转仪上孵育 3 小时。
  8. 将离心管置于磁力架上，吸除裂解液，并用 200 μL PBST 洗涤磁珠五次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于 100 μL PBS（不含 Tween-20）中，转移至新的洁净离心管，再将离心管置于磁力架上。
  9. 吸除 PBS，加入 100 μL 非还原性上样缓冲液。取出 50 μL 样品，加入 2-ME（终浓度 5%），制备还原性样品。将样品在 95 °C 加热 5 分钟。
  10. 将磁力架上的磁珠与免疫沉淀组分分离，将上清液收集至新的离心管中。
  11. 将样品储存于 -20 °C，待后续分析。

7. 质谱分析用中间纤维蛋白样品的制备

  1. 在启动研究之前，请安排与蛋白质组学专家进行咨询，因为质谱分析涉及大量时间和成本。
  2. 采取特殊预防措施以避免污染。使用洁净手套操作所有凝胶，并在洁净容器中孵育，容器仅用ddH2O清洗（避免使用皂类）。
  3. 根据标准条件，将20–50 μL HSE样品（来自第4和第5节）上样至SDS-PAGE凝胶进行电泳。
  4. 用蛋白质染色剂染色1小时。多次漂洗后，在ddH2O中脱色过夜。脱色后，IF蛋白条带应清晰可见。
  5. 将凝胶置于塑料文件保护膜之间，扫描并标记将被切取并送检的条带。
  6. 使用新的洁净剃刀切取IF蛋白条带。
  7. 将凝胶条带放入洁净的微量离心管中，并送至质谱分析机构。

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结果

一种利用裂解基质从多种小鼠组织中快速提取高盐可溶性IF蛋白的新方法。

从上皮组织中分离大部分中间丝蛋白组分的传统方法25,26在本研究中进行了改进，以涵盖9种不同器官，并采用更快速的组织裂解流程。传统方法需要3次手动匀浆步骤，而改进后的方法仅需1次手动匀浆，显著缩短了操作时间，尤其是在处理超过6个样本时更为高效。图1A展示了来自9种小鼠组织的HSEs的典型结果，而图1B的表格则列出了各组织中预期的蛋白质及其分子量，供比较参考。需要注意的是，新的自动化方法在胰腺和脾脏组织上的效果不佳；对于这些组织，仍以传统匀浆方法为佳。该方法可用于在多种组织中以统一方式分析中间...

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讨论

能够实现对中间纤维（IF）蛋白进行生化表征的方法，有助于理解哺乳动物系统中的多种病理生理现象，因为IF蛋白既是细胞和组织应激的标志物，也是其调节因子29。本方法的原理基于20世纪70年代和80年代建立的早期实验流程，这些流程通常使用低盐和高盐溶液以及Triton-X100去污剂，用于从细胞和组织中分离、纯化并重建IF蛋白25,30,31,32,33,34,35。有关支持IF蛋白生化分离研究的历史背景，请参阅近期的综述文章36,...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NIH R01 DK110355、 DK093776 [N.T.S.]、DK102450 [N.T.S.] 以及 P30 DK034987 [资助给北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC-Chapel Hill）] 的支持。作者感谢 Deekshita Ramanarayanan 在 qPCR 和蛋白质印迹实验中提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009免疫沉淀珠
PBSThermoFisher Scientific10010049用于缓冲液配制
Purelink RNA mini kitThermoFisher Scientific12183018从组织中提取RNA
Purelink DNAse setThermoFisher Scientific12185010A柱上DNA消化
Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321D用于Dynabeads的磁力架
GelCode Blue Stain ReagentThermoFisher Scientific24592适用于质谱分析的凝胶染色剂
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher Scientific32106用于Western blot检测
High Capacity cDNA reverse transcription kitThermoFisher Scientific4368813用于基因表达分析
Proflex 3 x 32-well PCR SystemThermoFisher Scientific4484073PCR系统
PVDF转移膜 ThermoFisher Scientific88520用于Western blot
Power Up SYBR master mixThermoFisher ScientificA25778用于qPCR分析
RNA保存液（RNAlater）ThermoFisher ScientificAM7020RNA提取前组织保存用溶液
Novex 4-20% Tris Glycine GelThermoFisher ScientificXP04205BOX预制蛋白凝胶
抗角蛋白8抗体（TS1）ThermoFisher ScientificMA514428用于Western blot检测K8
抗波形蛋白抗体（Anti-Vimentin）ThermoFisher ScientificMA511883用于Western blot检测波形蛋白
Tris Glycine转移缓冲液（25倍浓缩液）ThermoFisher ScientificLC3675用于蛋白凝胶湿法转膜
2x SDS上样缓冲液ThermoFisher ScientificLC2676用于蛋白凝胶样品制备
Tris Glycine SDS电泳缓冲液（10倍浓缩液）ThermoFisher ScientificLC26755用于蛋白凝胶电泳
裂解珠 - Matrix DMP Biomedicals116913100用于组织破碎及RNA提取的裂解珠和基质管
裂解珠 - Matrix SSMP Biomedicals116921100用于组织破碎及蛋白提取的裂解珠和基质管
NanoDrop Lite分光光度计ThermoFisher ScientificND-LITE用于蛋白质和核酸的定量检测
Precellys 24组织匀浆仪Bertin InstrumentsEQ03119自动化组织匀浆设备

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从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰
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