从多个小鼠组织分离中间丝状蛋白以研究与老化相关的翻译后修饰

IF是一系列蛋白质，在人类中由73个基因编码并分为六种主要类型:I-IV型是细胞质（ 例如上皮和毛发角蛋白（K），肌细胞结蛋白，神经丝，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和别的）; V型是核脂肪;并且VI型是眼镜¹中的IF。在其分子组织方面，IF蛋白质具有三个共同的结构域:高度保守的螺旋线圈"棒"结构域，以及球状"头"和"尾"结构域。 IF蛋白质四聚体组装形成短丝前体，其最终并入成熟细丝中，其形成涉及机械保护的动态细胞骨架和核结构结构² ，应激感测^3,4 ，调节转录⁵和生长以及其他关键细胞功能"> ^1,6,7 。

由IF基因错义突变引起的许多人类疾病的存在突出了IF系统的功能重要性，包括神经病，肌病，皮肤脆性障碍，代谢功能障碍和早衰症候群⁸ 。一些IF基因突变不会引起疾病进展的倾向，如肝脏疾病中的简单上皮角蛋白⁹ 。后者是由于上皮中的IF的临界应力保护功能。一般来说，IF在基础条件下是最丰富的细胞蛋白，但在各种类型的应激¹⁰中进一步强烈诱导。例如，最近对线虫线虫的蛋白质组范围变化进行的研究表明，多个IF被高度上调并且易于聚集在有机体老化^11,12 。由于维持适当的IF结构对于细胞对各种形式的应力^10的抵抗是至关重要的，所以IF聚集也可能导致衰老过程中的功能下降。然而，缺乏在不同组织中进行压力检测多种哺乳动物IF蛋白的有机体水平的研究。

IF是高度动态的结构，可以适应蜂窝需求。例如，角蛋白经历可溶性（非丝状）和不溶性（丝状）蛋白质池¹³之间的生物合成非依赖性循环。在正常的生理条件下，约5％的K8 / K18总库可以在无洗涤剂的缓冲液中提取，相比之下可以溶解在非离子型洗涤剂Nonidet P-40中的约20％，这是与Triton- X100 ^{14 ，} 15 。在有丝分裂期间，简单型上皮K8和K1814的溶解度显着增加，这在表皮角蛋白中不太明显，但在波形蛋白和其他III型IF蛋白^{15,16 中}更为明显。 IF蛋白的溶解性质通过磷酸化来进行严格调控，磷酸化是针对灯丝重排和溶解度的关键的翻译后修饰（PTM）17,18,19,20。大多数IF受到保护地点的多个PTM的广泛监管，导致功能变化¹⁷ 。

这种方法的目的是引入新的IF领域的研究人员进行生物化学提取和多个小鼠组织中IF蛋白研究的分析方法。具体盟军，我们专注于使用高盐提取方法分离IF蛋白，并通过质谱法和PTM靶向抗体评估PTMs的变化。这些方法基于以前发布的程序^21，但包括用于提取不同IF蛋白类型的修饰，以揭示通过IF家族调节的常见机制。例如，特定赖氨酸残基处的K8乙酰化调节细丝组织，而超乙酰化促进K8不溶性和聚集体形成²² 。最近的全球蛋白质组学分析研究还发现，大多数组织特异性IF蛋白质也是乙酰化的靶标，大多数IF乙酰化位点被限制在高度保守的杆结构域。这突出表明需要适合IF系统的全局分析的方法。我们还介绍了使用Opti自动均质化从多组织分离IF蛋白的快速方法大小溶解基质。所得制剂适用于通过质谱法和其他方法进行下游PTM分析。

该协议是根据北卡罗来纳大学的机构动物保护和使用委员会（IACUC）批准和执行的。

准备工作

1. 制备Triton-X缓冲液（1％Triton X-100,5mM乙二胺四乙酸（EDTA）），在磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4中调高体积）。制成500mL:将Triton X-100和500mM EDTA各5mL搅拌至490mL PBS（pH7.4）中。在4℃下储存Triton-X缓冲溶液。
2. 制备高盐缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.6,140mM NaCl，1.5M KCl，5mM EDTA，0.5％Triton X-100，在双蒸馏（dd）H ₂ O中调出体积）。制成500毫升:搅拌10mL 0.5M Tris-HCl（pH7.6），14mL 5M NaCl，55.9克KCl，5毫升0.5M EDTA和2.5毫升Triton X-100，将体积调至500 mL，使用双蒸水）。在4°C储存高盐缓冲溶液。
3. 在使用前，补充适量的Triton-X和高盐缓冲液
4. 在1×PBS，pH 7.4中制备5mM EDTA。制成500mL:将5mL的0.5M EDTA搅拌到495mL的1×PBS，pH7.4中。
5. 使用符合兽医指南和机构标准的认可方案，分离不同的小鼠器官（脑，心脏，肺，肝，胰腺，结肠，肠，肾，脾） ²³ 。组织采集程序应不超过5分钟，以保持富含蛋白酶的组织的RNA和蛋白质完整性（ 例如胰腺应先处理）。
6. 切割少量组织（〜5-20mg）并置于RNA储存溶液中，用于随后的RNA提取，cDNA合成和IF基因表达的定量实时PCR分析。将RNA储存溶液管与组织放置在4℃过夜，并遵循制造商协议进一步的折叠和隔离步骤。
7. 将其余的组织切成更小的碎片（ 例如 0.5厘米），并置于低温条件下。快速冷冻并将样品瓶储存在-80°C或液氮下长期储存。

IF基因表达分析

1. 从保存在RNA储存溶液试剂中的组织中提取RNA。根据制造商的方案使用任何合适/优选的RNA提取方法。
2. 定量RNA浓度，并使用2μgRNA根据制造商的方案使用合适的逆转录试剂盒产生cDNA。
3. 使用生成的cDNA和小鼠IF基因特异性引物设置qPCR反应，包括每个样品的三个技术重复以及根据制造商的方案的空白对照。
4. 将IF基因表达定量为比较不同条件（ 例如年轻组织和老组织）的折叠变化。

3. P用于免疫印迹的总组织裂解物的修复

1. 在1mL的2x还原SDS样品缓冲液中均化25mg的组织。如果要进行比色蛋白测定以量化蛋白质浓度，则从样品缓冲液中除去溴酚蓝染料。
2. 加入5％（v / v）的2-巯基乙醇（2-ME）以制备还原样品。向200μL非还原样品中加入10μL2-ME。
3. 使用洗涤剂和还原剂相容的蛋白质测定法确定蛋白质浓度。如果染料已经包含在样品缓冲液中，蛋白质量可以通过许多技术运行凝胶之后估算，包括考马斯染色剂²⁴ 。
4. 涡旋所有样品并在95℃加热5分钟。
5. 在还原和非还原条件下进行Western印迹。短暂暴露膜（<1分钟）以显示单体物质，并且更长（> 1分钟）以显示高分子量复合物包含ng IF蛋白。如果监测聚集，检查整个凝胶/膜（包括凝胶孔的底部）。
6. 运行平行凝胶，并用蛋白质染色剂作为载体对照染色²⁴ 。在疾病模型或损伤实验中，总蛋白质染色应用作加载对照，而不是用于"内部"蛋白质（ 例如肌动蛋白，GAPDH）的免疫印迹，因为后者在不同应力条件下发生变化。

4.组织特异性IF的洗涤剂可溶性和高盐提取物的制备

1. 将1mL冰冷的Triton X-100缓冲液加入玻璃管匀浆器中并置于冰上。
2. 从液氮储存中取出一小块薄片（约25 mg），并直接放入玻璃均化器中。使用聚四氟乙烯杵匀浆（50冲程），避免产生气泡。始终保持匀浆器和裂解液冷。
3. 将裂解液转移至1.5 mL micr离心管在冰上并在预冷却的离心机（4℃）中以20,000×g离心10分钟。
4. 将上清液部分收集到单独的管中。这是Triton X-可溶性级分，可用于免疫沉淀（ip）和可洗涤剂溶解的IF蛋白库的分析。注意，步骤4.1-4.4可以重复以实现来自脑组织的更清洁的IF提取物。
5. 将1 mL高盐缓冲液加入组织沉淀中，转移至干净的匀浆器中，并行100次。将匀浆转移回微量离心管，并将管置于冷藏室中的旋转振荡器上1小时。
6. 在4℃下以20,000×g离心匀浆20分钟。丢弃上清液。
7. 将1mL冰冷的PBS / EDTA缓冲液加入到沉淀中，并将其在干净的均化器中匀浆（20次），作为最终的清理步骤*。转移到新管中，在4℃下以20,000×g离心10分钟，得到IF蛋白 -丰富的高盐提取物（HSE）。
   *任选地，在该步骤中涡旋而不是均质化。
8. 弃去上清液，并将丸粒溶解在300μL已预热的非还原性SDS样品缓冲液中。首先通过移液和涡旋破碎颗粒，然后在95℃下加热样品5分钟。
9. 涡流和移液管，以确保颗粒溶解。完全溶解颗粒可能需要几分钟的时间。
10. 将所有样品储存在-20°C直到分析。

5.大容量实验中IF蛋白提取的自动组织裂解

1. 对于RNA提取，将裂解缓冲液（每25mg组织600μL缓冲液）置于含有裂解基质D（使用小陶瓷球）的管中，并在组织溶液中脉冲两次25秒。通过以20,000×g离心分离裂解物与基质，并分离进行下一步骤。
2. 对于蛋白质提取，放置Trit在X-100（或SDS样品缓冲液，如果准备总裂解物）在裂解管与裂解基质SS（使用单个不锈钢珠）。在测试多个矩阵之后，选择它是因为它产生的IF蛋白质提取物质量与传统的去抖动方法相同。请注意，自动化方法对胰腺和脾脏不是最佳的，标准均质方案应用于这些组织。
3. 要进行高盐提取物的制备，使用磁铁从管中取出不锈钢珠，并在4℃下以20,000 xg离心管10分钟。
4. 继续执行手册中的步骤4.4（以上）。
5. 将所有样品储存在-20°C直到分析。

6.翻译后修饰的IF蛋白的免疫富集

1. 准备PBST缓冲液（0.02％Tween-20在PBS中）。加入10 mL Tween-20至50 mL PBS（pH 7.4）。
2. 制备PTM抗体溶液（200μLPBST中的1-10μg抗体）。一般来说，3μg抗体/反应是一个很好的起始条件，如果需要可进一步优化。
3. 对于每个反应，将50μL磁珠等分成微量离心管，置于磁体上并吸出珠子储存溶液。
4. 通过重新悬浮在抗体溶液中并在室温下孵育20分钟，将珠子与免疫沉淀抗体相结合，并在旋转器（端到端，确保小体积的混合物）上孵育20分钟。
5. 将管置于磁铁上并吸出抗体溶液。
6. 在200μLPBST中冲洗抗体缀合的珠粒一次，并清洗洗涤缓冲液。
7. 将0.6-1mL的组织裂解物加入珠中，通过温和移液混合并在冷室中在旋转器上孵育3小时。
8. 将管置于磁体上，除去溶胞产物，并用200μLPBST洗珠5次。最后洗涤步骤后，收集珠子在100 _6; L的PBS（不含Tween-20）并转移到干净的新管中。将管放在磁铁上。
9. 吸出PBS并加入100μL非还原样品缓冲液。取出50μL，加入2-ME（5％）以制备还原样品。将样品加热至95°C 5分钟。
10. 将ip分数与磁铁上的珠子分开，并将其收集到新的管中。
11. 将样品储存在-20°C直到分析。

7.制备用于质谱分析的IF蛋白质样品

1. 在开始研究之前安排与蛋白质组学专家的磋商，因为质谱分析涉及到大量时间和成本。
2. 采取特殊预防措施，避免污染。用干净的手套处理所有凝胶，并在干净的容器中孵育，仅使用ddH ₂ O（避免使用肥皂）洗涤。
3. 根据标准条件，在SDS-PAGE凝胶上运行20-50μL的HSE样品（来自第4和第5部分）。 用蛋白质污渍染色1小时。漂洗多次，并在ddH ₂ O中脱色过夜。去蛋白后，IF蛋白带应易于看到。
4. 将凝胶放置在塑料片保护膜之间，扫描并标记将被切除并发送用于分析的条带。
5. 使用新的干净剃须刀消除IF蛋白质条带。
6. 将凝胶带置于干净的微量离心管中并转移到质谱仪中。

一种使用裂解基质从多个小鼠组织中高度盐提取IF蛋白的新的快速方法。

在这里修饰了分离大部分中间丝蛋白部分与上皮组织的传统方法25,26以包括9种不同的器官和更快速的组织溶解过程。虽然传统方法需要3个手动均质步骤，但修改过程只有1个手动均质步骤，可以将程序缩短几个小时，特别是当处理6个以上样品时。 图1A显示了来自9只小鼠组织的HSE的典型结果，而组织中预期蛋白质的表和每种蛋白质的分子量如图1B所示

肝脏K8和K18被强烈上调，并在老鼠肝脏中经历增加的磷酸化和赖氨酸乙酰化。

图2显示了本协议中描述的几个分析的典型结果。图A描绘了肝脏中两个主要的IF基因的表达分析， 角蛋白8 （ KRT8 ）和角蛋白18 （ KRT18 ），其分别编码IF蛋白K8和K18。上皮角蛋白在各种应激条件下均强烈上调。在所显示的结果中，这在老化期间发生，因为与3m老鼠相比，在24m老鼠的肝脏中KRT8显着上调。蛋白质水平的结果更为引人注目，由于老年（24米）肝脏中K8单体以及高分子量复合物的急剧增加所观察到。基于考马斯蛋白质的蛋白质污渍在这里用作负载控制，以确保样品中蛋白质的相等负载。请注意，对于总组织裂解物，很容易在凝胶上过载蛋白质，就像在这种情况下一样。加载较小的体积或稀释样品进一步在十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液将缓解这个问题（特别是如果它看起来粘稠和难以移液）。图C描绘了使用自动化方案获得的肝脏高盐提取物的典型结果，在凝胶上强化角蛋白8和18的强烈富集。红线划分出切片并进行质谱分析的区域。在图D中，图C中样品的质谱分析结果表明，老肝脏中的K8和K18具有不存在于年轻肝脏中的多个磷酸化和乙酰化位点。

GFAP强烈上调，赖氨酸在老鼠大脑中乙酰化。

图3显示用于从上皮提取IF的方法也可用于非上皮组织。此外，结果揭示了IF基因和蛋白质的老化依赖性上调的一般模式。 图2A中的qPCR结果显示与3m老鼠相比，在24m老鼠的脑中GFAP mRNA的5倍诱导。 图2B显示Triton X-100级分中存在的总蛋白和富含IF的HSE。注意，在老脑中由箭头（对应于GFAP）标记的50kDa处的带强度的增加。 图2C中的蛋白质印迹分析进一步揭示了在Triton X-100级分中GFAP和GFAP单体和潜在的高分子量复合物的显着存在（均由箭头标记）的上调。用泛 - 乙酰赖氨酸抗体的相同样品的蛋白质印迹分析显示，抗体在老鼠脑的HSE中识别〜50kDa的条带，并且在Triton X-100级分中〜250kDa处识别（ 图2D ）。来自Triton X-100级分的乙酰化蛋白的免疫富集显示从旧脑获得的裂解物中GFAP蛋白的存在增加。减少和非还原条件显示突出GFAP单体和高分子量复合物。质谱分析（类似于图1

图1: 从多个小鼠组织中自动裂解和提取IF蛋白。 （ A ）来自指定小鼠组织的HSE的基于考马斯的凝胶染色。显示的组织从相同的成年（3米龄）雄性CBA小鼠获得。如第5部分所述处理样品。 脑 :注意，NFL，NFM和NFH分别在〜70,145和200 kDa下分别高度磷酸化并迁移速度比预期的慢。 心脏 :除了与结蛋白和波形蛋白相对应的53kDa条带之外），心脏样品还含有〜42kDa的条带，最有可能代表肌动蛋白，已知与结蛋白28共同纯化。 大号arge肠:与K8 / K18共同提取的超过25kDa的突出条带的身份未知，但如果使用传统的均质器方法处理组织，则不存在这些条带。 胰腺和脾脏 :请注意，自动均质不适合从胰腺和波形蛋白从脾脏中分离角蛋白，大概是因为裂解物对组织裂解液脉冲期间温度略有升高的敏感性。 （ B ）显示不同组织中存在的主要IF蛋白类型及其预测分子量作为面板A的参考的表。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2: 分子ar和老年小鼠肝角蛋白的生物化学差异。 （ A ）使用标准方法分析KRT8和KRT8 mRNA（方案1）揭示了来自老鼠的肝脏中KRT8转录物的显着诱导。每个病例n = 6（每组使用3只雄性和3只雌性CBA小鼠）。 ** p <0.01;单因素方差分析。 （ B ）使用方案2从3个年轻（3个月大）和3个老（24个月大）的雄性CBA小鼠获得总肝裂解物，并且在非还原条件下分析样品。 TS1抗体用于探测K8表达，使用基于考马斯的蛋白染色作为载体对照。 （ C ）来自年龄和老鼠肝脏的高盐提取物，分别对应于小鼠＃1和＃4。两个箭头指向凝胶上的K8和K18，红色框表示凝胶的部分切除并进行质谱分析。 （ D 强>）通过对C所示样品的质谱分析鉴定的PTM位点。 请点击此处查看此图的较大版本。

图3: 来自年轻和老年小鼠脑中GFAP的分子和生物化学差异。 （ A ）使用标准方法（方案1）的GFAP mRNA的分析揭示了来自老鼠的脑中的显着诱导。每个病例n = 6（每组使用3只雄性和3只雌性CBA小鼠）。 ** p <0.01;单因素方差分析。 （ B ）来自年轻（3个月大龄）和老（24个月大）小鼠脑组织的Triton X-100和HSE级分的考马斯蛋白染色。注意，老年脑中HSE中〜50kDa的GFAP带增加（箭头）。 （ C ）GF（ D ）与B组相同样品的乙酰赖氨酸免疫印迹（兔多克隆; Abcam ab80178）。（ E ）免疫沉淀后的乙酰基 - 赖氨酸免疫印迹（小鼠单克隆抗体，GA5克隆）赖氨酸抗体。在非还原（NR）和还原（R）条件下分析样品，箭头指示增加来自老脑的免疫沉淀物中GFAP的存在。 请点击此处查看此图的较大版本。

作者宣称他们没有竞争的经济利益。