活细胞成像技术在流动条件下观察血小板脱颗粒与分泌过程

摘要

本研究介绍了一种基于荧光显微镜的方法，用于在流动条件下研究血小板的黏附、铺展和分泌。这一多功能平台可用于血小板功能的研究，为血栓形成和止血机制的探索提供支持。

摘要

血小板在止血过程中起着至关重要的作用，即通过形成血栓来封闭血管损伤部位。它们也参与血栓形成过程，即血栓堵塞血管并导致器官损伤，可能产生危及生命的后果。这推动了针对血小板功能的科学研究，以及开发在流动条件下实时追踪细胞生物学过程的方法。

可用于研究血小板黏附与聚集（血小板生物学中的两个关键现象）的流动模型种类繁多。本文描述了一种在流动条件下实时研究血小板脱颗粒激活过程的方法。该方法采用与注射泵系统连接的流动腔室装置，并将其置于基于LED光源的倒置宽场荧光显微镜下。此处所述的装置可实现由荧光标记抗体或荧光染料提供的多种荧光团的同步激发。活细胞成像实验完成后，盖玻片可进一步用于静态显微镜分析即， 共聚焦显微镜或扫描电镜

引言

血小板是无细胞核的血细胞，可在血液循环中流动。其主要功能是在损伤部位封闭血管破裂口，防止血液流失。在这些损伤部位，内皮下胶原纤维暴露，并随后被多聚体蛋白血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）覆盖。VWF通过与血小板表面的糖蛋白Ibα-IX-V复合物相互作用，以依赖该复合物的机制捕获循环中的血小板¹，从而减缓血小板的流动速度。这一过程在高剪切力条件下尤为重要。随后，血小板在接收到胶原提供的活化信号后发生形态学改变，导致不可逆的铺展，并最终引发血小板聚集。这两个过程均依赖于颗粒内容物的释放，以促进血小板之间的相互通讯。其中，血小板α颗粒含有纤维蛋白原和VWF，可通过整合素依赖的方式协助血小板黏附并连接血小板。血小板致密颗粒则含有无机化合物²，包括钙离子和二磷酸腺苷（ADP），有助于增强血小板的活化。此外，血小板还含有（过敏性）炎症介质³、补体调控蛋白⁴以及血管生成因子^5,6，这引发了一个问题：在不同条件下，这些内容物是否以及如何被差异性释放。

自20世纪80年代以来，流动模型中血小板功能的研究对血栓形成机制的探讨具有重要价值

方案

乌得勒支大学医学中心的当地医学伦理委员会已批准采集血液用于 离体 研究目的，包括本研究的目的。

1. 溶液配制

1. 通过将10 mM HEPES、0.5 mM Na₂HPO₄、145 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO₄ 和 5.55 mM D-葡萄糖溶解于蒸馏水中，制备4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）Tyrode缓冲液。
   1. 制备两种缓冲液变体：分别将pH值调节至6.5和7.4。每次实验当天新鲜配制缓冲液。根据需要添加10 ng/mL前列环素。
2. 通过将50 mM Tris和150 mM NaCl溶解于蒸馏水中，并将pH值调节至9.0，制备Tris缓冲盐水（TBS）。
3. 通过将85 mM三钠柠檬酸盐、71 mM柠檬酸和111 mM D-葡萄糖溶解于蒸馏水中，制备酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）溶液。
4. 将2%（v/v）多聚甲醛（PFA）加入pH为7.4的HEPES Tyrode缓冲液中，配制固定液。加热溶解（50–70 °C），并将pH调至7.4。分装后于-20 °C保存。使用前在37 °C解冻。
5. 将1%（m/v）人血清白蛋白（HSA）溶解于pH为7.4的HEPES Tyrode缓冲液中，制....

结果

图1展示了流室装置和实验设置的图像、硅胶片的位置与尺寸以及管路连接方式。图2提供了流室尺寸的详细信息。图3和视频1展示了血小板在固定化VWF上黏附和铺展过程的时间序列图像。CD63是一种跨膜蛋白，存在于静息血小板胞内致密颗粒的膜中¹⁵。其在血小板表面的时间依赖性动员以绿色显示。类似地，P-选择素（Psel）是一种插入静息血小板胞内α颗粒膜中的跨膜蛋白。其在血小板表面的时间依赖性动员以橙色显示。图3B展示了通过共聚焦荧光显微镜在流动实验后以45°角获取的代表性图像。视频2展示了同一实验的倾斜系列图像。请注意，CD63主要位于中央颗粒区，而P-选择素则分布在整个细胞体上，并在细胞边缘处呈现富集。

讨论

血栓形成是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因，而血小板在其发生过程中起着核心作用。本文描述了一种在流动条件下对血小板脱颗粒进行活细胞成像的方法。通常认为，血小板一旦被激活，其颗粒内的所有内容物会直接释放到溶液中。然而，本研究结果表明，情况并非总是如此。在黏附和脱颗粒过程中，血小板仍保留了大量多聚磷酸盐（图4）。此外，脱颗粒后，多聚体蛋白VWF仍与血小板表面相关联（图5）。这表明调控血小板颗粒脱颗粒的分子机制比通常认为的更为精细复杂。

为了在流动条件下实现血小板脱颗粒的活细胞成像，实验条件被设定为尽量减少血小板聚集。实验中使用的血小板计数为150,000个血小板/µL，处于正常范围的下限（150,000–450,000个血小板/µL）。此外，血小板黏附和铺展的研究是在固定的VWF或纤维蛋白原上进行的，这仅引起轻微的血小板活化（与例如胶原蛋白相比）。在使用洗涤血小板的研究中，较高的剪切速率会使这些细胞向流体中心移动，从而干扰黏附和后续的铺展过程，并使脱颗粒的观察变得复杂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)	VWR	441476L
Na2HPO4	Sigma	S-0876
NaCl	Sigma	31434
KCl	Sigma	31248
MgSO4	Merck KGaA	1.05886
D-葡萄糖	Merck KGaA	1.04074
前列环素	Cayman Chemical	18220
柠檬酸三钠	Merck KGaA	1.06448
柠檬酸	Merck KGaA	1.00244
盖玻片	Menzel-Gläser	BBAD02400500#A	24 × 50 mm，No. 1 = 0.13 - 0.16 mm 厚度。
铬酸（2% CrO3）	Riedel de Haen	07404	CAS [65272-70-0]。
血管性血友病因子 (VWF)	实验室自制纯化
纤维蛋白原	Enzyme Research Laboratories	FIB3L
4孔培养皿，未处理	Thermo Scientific	267061
人血清白蛋白 V 级	Haem Technologies Inc.	823022
采血管，9 mL，9NC 凝血用 3.2% 枸橼酸钠	Greiner Bio-One	455322
细胞分析仪	Abbott Diagnostics	CELL-DYN 血液分析仪
多聚甲醛	Sigma	30525-89-4
注射泵	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Harvard apparatus 22
10 mL 注射器，直径 14.5 mm	BD biosciences	305959	Luer-Lok 注射器
抗 CD63-生物素	Abcam	AB134331
抗 CD62P-生物素	R&D Systems	Dy137
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI)	Polysciences Inc.	9224
链霉亲和素-Alexa Fluor 488 偶联物	Thermo Scientific	S11223
浸油	Zeiss	444963-0000-000
洗涤剂溶液	Unilever, Biotex
甘氨酸	Sigma	56-40-6
聚乙烯醇	Sigma	9002-89-5	Mowiol 40-88。
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐	Sigma	1185-53-1
1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷 (DABCO)	Sigma	280-57-9
羊抗人 VWF 多克隆抗体	Abcam	AB9378
Alexa Fluor 488-NHS	Thermo Scientific	A20000
甘油	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
石蜡膜	Bemis	PM-996	4 英寸 × 125 英尺卷。
非增强型硅胶片	Nagor	NA 500-1	200 mm × 150 mm × 0.125 mm。
定制切割带灌注和真空通道的硅胶片	实验室自制		由非增强型硅胶片 (Nagor, NA 500-1) 制成
1.5 mL 离心管	Eppendorf AG	T9661-1000AE
荧光显微镜	Zeiss Observer Z1		配备 LED 激发光源。
显微镜软件	Zeiss ZEN 2	蓝色版
18 G 针头 (18 G × 1 1/2")	BD biosciences	305196
NaCl	Riedel de Haen	31248375
Tris	Roche	10708976
塑料巴斯德吸管	VWR	612-1681	7 mL，非无菌，刻度至 3 mL。
硅胶管	VWR	228-0656	内径 × 外径 × 壁厚 = 1.02 × 2.16 × 0.57 mm。
显微镜载玻片	Thermo Scientific	ABAA000001##12E	76 × 26 × 1 mm，45 ° 磨边，带磨砂端。