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方法文章

活细胞成像技术在流动条件下观察血小板脱颗粒与分泌过程

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DOI：

10.3791/55658

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2017年7月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical Center Utrecht, 2Department of Pharmaceutics, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种基于荧光显微镜的方法，用于在流动条件下研究血小板的黏附、铺展和分泌。这一多功能平台可用于血小板功能的研究，为血栓形成和止血机制的探索提供支持。

摘要

血小板在止血过程中起着至关重要的作用，即通过形成血栓来封闭血管损伤部位。它们也参与血栓形成过程，即血栓堵塞血管并导致器官损伤，可能产生危及生命的后果。这推动了针对血小板功能的科学研究，以及开发在流动条件下实时追踪细胞生物学过程的方法。

可用于研究血小板黏附与聚集（血小板生物学中的两个关键现象）的流动模型种类繁多。本文描述了一种在流动条件下实时研究血小板脱颗粒激活过程的方法。该方法采用与注射泵系统连接的流动腔室装置，并将其置于基于LED光源的倒置宽场荧光显微镜下。此处所述的装置可实现由荧光标记抗体或荧光染料提供的多种荧光团的同步激发。活细胞成像实验完成后，盖玻片可进一步用于静态显微镜分析即， 共聚焦显微镜或扫描电镜

引言

血小板是无细胞核的血细胞，可在血液循环中流动。其主要功能是在损伤部位封闭血管破裂口，防止血液流失。在这些损伤部位，内皮下胶原纤维暴露，并随后被多聚体蛋白血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）覆盖。VWF通过与血小板表面的糖蛋白Ibα-IX-V复合物相互作用，以依赖该复合物的机制捕获循环中的血小板1，从而减缓血小板的流动速度。这一过程在高剪切力条件下尤为重要。随后，血小板在接收到胶原提供的活化信号后发生形态学改变，导致不可逆的铺展，并最终引发血小板聚集。这两个过程均依赖于颗粒内容物的释放，以促进血小板之间的相互通讯。其中，血小板α颗粒含有纤维蛋白原和VWF，可通过整合素依赖的方式协助血小板黏附并连接血小板。血小板致密颗粒则含有无机化合物2，包括钙离子和二磷酸腺苷（ADP），有助于增强血小板的活化。此外，血小板还含有（过敏性）炎症介质3、补体调控蛋白4以及血管生成因子5,6，这引发了一个问题：在不同条件下，这些内容物是否以及如何被差异性释放。

自20世纪80年代以来，流动模型中血小板功能的研究对血栓形成机制的探讨具有重要价值7自那时以来，已取得大量技术进步，目前已有包含纤维蛋白形成的流体模型被开发出来，用于检测治疗用血小板浓缩物的止血潜力 离体8 或研究剪切速率扰动对血栓形态的影响9稳定黏附和生理性血栓形成（止血）与病理性血栓形成（血栓症）背后的分子和细胞生物学机制之间的差异可能极为细微，这促使研究人员开发出可在实时条件下可视化这些亚细胞过程的流动模型。

一个可从该装置中获益的示例过程是细胞内多聚磷酸盐的（重新）分布以及凝血因子的募集，以揭示其对纤维蛋白超微结构随时间变化的影响10。目前的研究通常局限于终点分析。本方法的主要目的是实现在流动条件下血小板活化过程中动态亚细胞事件的实时可视化观察。

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方案

乌得勒支大学医学中心的当地医学伦理委员会已批准采集血液用于 离体 研究目的，包括本研究的目的。

1. 溶液配制

  1. 通过将10 mM HEPES、0.5 mM Na2HPO4、145 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO4 和 5.55 mM D-葡萄糖溶解于蒸馏水中，制备4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）Tyrode缓冲液。
    1. 制备两种缓冲液变体：分别将pH值调节至6.5和7.4。每次实验当天新鲜配制缓冲液。根据需要添加10 ng/mL前列环素。
  2. 通过将50 mM Tris和150 mM NaCl溶解于蒸馏水中，并将pH值调节至9.0，制备Tris缓冲盐水（TBS）。
  3. 通过将85 mM三钠柠檬酸盐、71 mM柠檬酸和111 mM D-葡萄糖溶解于蒸馏水中，制备酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）溶液。
  4. 将2%（v/v）多聚甲醛（PFA）加入pH为7.4的HEPES Tyrode缓冲液中，配制固定液。加热溶解（50–70 °C），并将pH调至7.4。分装后于-20 °C保存。使用前在37 °C解冻。
  5. 将1%（m/v）人血清白蛋白（HSA）溶解于pH为7.4的HEPES Tyrode缓冲液中，制备封闭缓冲液。
  6. 将4.8 g聚乙烯醇加入12 g甘油中，充分混合。再加入12 mL蒸馏水，室温下旋转过夜。
    1. 加入24 mL 0.2 M Tris-HCl（pH 8.5），边搅拌边加热至50 °C，持续30分钟。加入1.25 g 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO），充分混匀。以1,500 × g离心5分钟。将上清液分装（每1 mL可满足15–20张载玻片的用量），于-20 °C保存。分装液仅限使用一次。

2. 盖玻片准备

  1. 将盖玻片（25 × 50 mm2）在未稀释的铬硫酸中浸泡过夜以去除油脂。用蒸馏水冲洗盖玻片，并在60 °C的烘箱中干燥过夜。
  2. 用一滴水将一段石蜡膜（10 × 15 cm2）粘附在实验台面上，通过抚平石蜡膜排除其中的空气。用移液器将80 µL浓度为10 µg/mL的VWF或100 µg/mL的纤维蛋白原液滴加到石蜡膜上。将盖玻片放置于液滴上，蛋白溶液将在两表面之间铺展，覆盖盖玻片整个背面。室温（RT）孵育1.5小时。
  3. 移除石蜡膜，将盖玻片（涂层面向上）放入4孔板中，加入封闭缓冲液进行封闭。37 °C孵育1小时，或4 °C孵育过夜。作为对照，对未包被VWF或纤维蛋白原的盖玻片进行同样封闭处理。

3. 富血小板血浆（PRP）的制备

  1. 通过静脉穿刺采集枸橼酸盐抗凝全血（终浓度：0.32% 柠檬酸钠（M/V））。
  2. 将血液在室温下以160 × g离心15分钟，不启用刹车。收集上清液（即， 用塑料巴斯德吸管将PRP转移。
    注意：离心后可观察到三层（从上到下依次为）：富血小板血浆（PRP）、白细胞和红细胞。确保不要收集白细胞和红细胞部分。通常，离心一支9 mL血液采血管后可获得约3 mL PRP。
  3. 如果实验将使用洗涤后的血小板，请继续进行第4部分。如需富血小板血浆（PRP），请继续下一步操作。
  4. 采集PRP后，将剩余血液（含红细胞沉淀）再次以2,000 × g离心10分钟，不启用刹车。收集上清液，其中含有乏血小板血浆（PPP）。
    注意：通常在此第二次离心步骤后可收集到 2 mL。
  5. 使用细胞分析仪对PRP中的血小板数量进行计数，并用PPP（步骤3.4）将其稀释至浓度为150,000个血小板/µL。
    注意：稀释后PRP的总体积取决于供体的血小板计数。不同供体之间的血小板计数差异较大，因此PRP的稀释需根据个体情况进行评估。血小板计数在150,000至450,000个/µL范围内被视为正常。
  6. 继续至第5节。

4. 洗涤血小板的制备

  1. 使用细胞分析仪测定PRP中的平均血小板体积（MPV）。
    注意：这是血小板预激活的指标11。静息状态血小板的正常MPV为7.5–11.5 fL11。在血小板洗涤过程中，MPV的增加不应超过1.5 fL。
  2. 向PRP中加入1/10体积的ACD以防止血小板预激活，并在室温下以400 × g离心15分钟（不启用刹车）。弃去上清液，将沉淀物小心地重悬于HEPES Tyrode缓冲液（pH 6.5）中，体积与原始PRP相同。
  3. 通过加入TBS将前列环素分装液解冻至浓度为10 µg/mL，并置于冰上保存。
  4. 为防止血小板激活，向重悬的血小板中加入前列环素至终浓度为10 ng/mL，并立即在室温下以400 × g离心15分钟（不启用刹车）。弃去上清液，将沉淀物小心地重悬于HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4）中。
  5. 计数血小板数量（步骤3.5），并测定MPV的变化（步骤4.1）（MPV变化不应超过1.5 fL）。
  6. 用HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4）将血小板数量调整至150,000个/µL。实验前在室温下静置30分钟使其恢复。分离后4小时内使用洗涤后的血小板进行实验。

5. 流动腔室组装

注意：这些实验使用了一种实验室自制的流动腔室12。也可使用多种市售的流动腔室，只要其能够容纳盖玻片，并且最好可将盖玻片取出以进行后续分析。本实验所用的流动腔室由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成，可精确适配显微镜载物台插件。腔室包含一个进液口和一个出液口（图1A-C；1, 2），以及一个真空连接口（图1A 和 C；3）。在其顶部放置一个定制的硅胶垫片（图1A 和 D；4）。两个切口形成真空通道（图1A 和 D；5），用于将盖玻片（图1A；6）紧密固定在腔室上。中央的切口构成流动通道（图1A 和 D；7；宽度为 2.0 mm，高度为 0.125 mm）。进液口和出液口与流动通道相连，真空接口则与真空通道相连。

  1. 用蒸馏水覆盖流室顶部，并将定制的硅胶片光滑面朝下放置于水面上。通过去除多余的水，使硅胶片漂浮至正确位置，同时保持其位置不变。
    注意：该硅胶片可重复使用（硅胶以其惰性著称）；通常未观察到血小板在其表面黏附。硅胶片可用洗涤剂清洗后重复使用，直至材料损坏（即撕裂，尤其是通道之间的区域）。一般情况下，一张硅胶片可在每天进行多次实验的情况下使用20天。
  2. 将流室在60 °C下孵育1小时，以蒸发残留水分，使硅胶片牢固地黏附于流室上。
  3. 使用塑料巴斯德吸管，向流道中加入一滴pH 7.4的HEPES-Tyrode缓冲液。将盖玻片（见第2节）有涂层的一面朝下放置于流道上。将真空泵连接至真空接口（图1A 和 C；3），施加约10 kPa的压力。

6. 血小板的预染色及抗体的制备

  1. 血小板染色
    1. 将洗涤后的血小板与10 µg/mL DAPI在37 °C避光孵育30分钟。为去除未结合的DAPI并防止血小板活化，加入前列环素至终浓度为10 ng/mL，并立即在室温下以400 × g离心15分钟，不启用刹车。
    2. 用HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4）重悬血小板沉淀，调整血小板浓度至150,000个血小板/µL。
  2. 抗体的制备
    1. 将生物素标记的抗体与Alexa标记的链霉亲和素按1:1的摩尔比混合。使用前在室温下孵育至少10分钟（步骤7.6）。
      注意：不同批次的生物素标记效率可能存在差异。若目标分子的可视化出现问题，应进行对照实验，以确认生物素标记是否成功，以及特定生物素化抗体的目标结合特性。

7. 灌注

  1. 启动荧光显微镜及显微镜软件。使用表1中列出的显微镜设置。
    注意：通过在显微镜软件中加载适当的实验，启动用于活细胞可视化和记录血小板以及所选荧光标记抗体和/或染料的显微镜和记录设置。流动实验在室温（RT）下进行。
  2. 通过将10 mL注射器连接至进样管路，并将1% HSA封闭缓冲液吸入进样管路，以封闭进样管路。在室温下孵育15分钟。通过将HEPES Tyrode's缓冲液（pH 7.4）吸入进样管路，冲洗进样管路。
  3. 将已封闭的进样管路和未经处理的出样管路（直径均为1.02 mm，长度约20–30 cm）分别连接至腔室的进样口和出样口。将一个10 mL注射器（或更小体积以提高精度）连接至出样管路。开启注射泵。
    注意：注射器的直径与泵上设定的流速共同决定了体积流速。结合流动通道的表面积，可根据下方公式13 计算剪切速率。因此，可通过改变注射泵的流速或调整流动通道的尺寸来调控剪切速率。剪切速率800–1,600 s-1通常用于模拟动脉血流，而25–100s-1用于模拟静脉血流。在此装置中，7.5 µL/min的流速对应25 s-1的剪切速率。
    剪切速率 = 6Q / h2w，单位为s-1
    其中：Q = 体积流速（mL/s），h = 通道高度（cm）（0.0125 cm；即硅胶片厚度），w = 通道宽度（cm）（本腔室为0.2 cm）。
  4. 在100倍物镜（总放大倍数1,000倍）上滴加一滴浸油，并将腔室安装到显微镜上，使玻璃面朝下。
  5. 将进样管路插入盛有HEPES Tyrode's缓冲液（pH 7.4）的试管中。手动拉动连接在出样管路上的注射器活塞，使溶液流经腔室，以排除系统中的空气。将注射器放入注射泵（图1B 和C；8），短暂运行泵以压紧活塞并确保流动稳定。
  6. 将抗体和/或染料加入血小板悬液或PRP中，用塑料移液器小心混匀，并将混合物转移至1.5 mL离心管中。
    注意：对于在剪切速率25s-1（7.5 µL/min）下进行的典型30分钟灌注实验，至少需要225 µL血小板悬液。代表性结果中所用抗体见表2。
  7. 在挤压管路（排出空气）的同时，将进样管路从HEPES Tyrode's缓冲液（pH 7.4）转移至含有PRP或洗涤后血小板及抗体和/或染料的1.5 mL离心管中（图1B 和C；9）。
    注意：转移管路时必须挤压管路以防止空气进入。后续可通过类似方式将进样管路转移至另一试管，从而用多种试剂处理已黏附的血小板。潜在有用试剂列表见表3。
  8. 在软件中选择"实时可视化"选项，将显微镜聚焦于包被盖玻片表面，并以1,600s-1（484 µL/min）的剪切速率启动泵，直至血小板到达流动腔室。此时，通过将注射泵设置调整为7.5 µL/min的流速，将剪切速率降至25s-1。
  9. 监测包被盖玻片表面，待首个血小板开始黏附时，将显微镜聚焦于该血小板，并在软件中启动实验开始记录。本实验所用记录设置见表1。
  10. 目视观察实时记录过程。30分钟后，停止注射泵。
    注意：确保实验过程中血小板始终处于焦点范围内。通常在1,000倍放大倍数下视野中约有20–30个血小板黏附；整个流动通道中约有2,000–3,000个血小板。
  11. 使用流动腔室进行固定（可选）。
    1. 在注射泵停止、流动终止后，将进样管路（无气泡）转移至固定液中。重新启动泵，并以与步骤7.8相同的流速使固定缓冲液流经通道至少10分钟。
  12. 从显微镜上取下腔室，清除玻璃上的浸油，断开真空，用18 G针头小心地将盖玻片从腔室中取出。
    注意：防止盖玻片破裂或损坏硅胶片。
  13. 将盖玻片（细胞面朝上）放置于4孔板中的组织上，该组织已用蒸馏水预先润湿。
    注意：此举可防止盖玻片黏附于孔底表面并避免干燥。
  14. 在盖玻片上加入750 µL固定液，在室温下孵育1小时。若样品无法立即分析，可将其保存于0.5% PFA（用HEPES Tyrode's缓冲液pH 7.4稀释）中，4 °C保存以确保固定稳定。随后进入第8节，对盖玻片进行成像前处理。
  15. 使用后，用蒸馏水冲洗腔室、管路和硅胶片，并在洗涤剂溶液中过夜孵育。再次使用前，用蒸馏水冲洗。
  16. 保存包含所有元数据的显微镜原始数据文件。如需导出，可将视频导出为.MOV（h.264压缩）或.AVI（无压缩）格式。单独帧可保存为JPEG或TIF文件。

8. 共聚焦荧光显微镜样品制备

  1. 将盖玻片转移至新的4孔板中，用3 mL HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4）清洗5次。每孔加入3 mL封闭缓冲液，室温孵育1小时。
  2. 移除封闭缓冲液；每孔加入3 mL含0.15%甘氨酸（质量/体积）的HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4），室温孵育15分钟。
  3. 移除甘氨酸溶液，用每孔3 mL封闭缓冲液清洗5次。可选：在封闭缓冲液中稀释荧光标记抗体，进行额外染色，室温避光孵育1小时。
  4. 用封闭缓冲液清洗5次，再用蒸馏水清洗2次。用纸巾从边缘向内轻轻吸去多余液体以干燥盖玻片，注意不要触碰细胞。
  5. 用移液器吸取60 µL聚乙烯醇溶液滴加到显微镜载玻片上。将细胞面向下的盖玻片置于液滴上，使聚乙烯醇在两表面间均匀铺展。室温避光孵育过夜。
  6. 通过共聚焦显微镜分析细胞14。
  7. 保存包含所有元数据的原始图像序列数据文件。根据需要，将原始数据文件处理为MOV、h.264压缩或未压缩的.AVI格式文件。将独立的图像序列另存为JPEG或TIF文件。

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结果

图1展示了流室和实验装置的图像、硅胶片的位置与尺寸以及管路连接方式。图2提供了流室尺寸的详细信息。图3和视频1展示了血小板在固定化的血管性血友病因子（VWF）上黏附和铺展过程的时间序列图像。CD63是一种跨膜蛋白，存在于静息血小板胞内致密颗粒的膜中15。其随时间依赖性地向血小板表面动员的过程以绿色显示。类似地，P-选择素（Psel）是一种插入静息血小板胞内α颗粒膜中的跨膜蛋白。其随时间依赖性地向血小板表面动员的过程以橙色显示。图3B显示了通过共聚焦荧光显微镜在流动实验后以45°角获取的代表性图像。视频2展示了同一实验的倾斜系列图像。请注意，CD63主要位于中央颗粒区，而P-选择素则分布在整个细胞体上，并在边缘区域呈现集中分...

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讨论

血栓形成是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因，而血小板在其发生过程中起着核心作用。本文描述了一种在流动条件下对血小板脱颗粒进行活细胞成像的方法。通常认为，血小板一旦被激活，其颗粒内的所有内容物会直接释放到溶液中。然而，本研究结果表明，情况并非总是如此。在黏附和脱颗粒过程中，血小板仍保留了大量多聚磷酸盐（图4）。此外，脱颗粒后，多聚体蛋白VWF仍与血小板表面相关联（图5）。这表明调控血小板颗粒脱颗粒的分子机制比通常认为的更为精细复杂。

为了在流动条件下实现血小板脱颗粒的活细胞成像，实验条件被设定为尽量减少血小板聚集。实验中使用的血小板计数为150,000个血小板/µL，处于正常范围的下限（150,000–450,000个血小板/µL）。此外，血小板黏附和铺展的研究是在固定的VWF或纤维蛋白原上进行的，这仅引起轻微的血小板活化（与例如胶原蛋白相比）。在使用洗涤血小板的研究中，较高的剪切速率会使这些细胞向流体中心移动，从而干扰黏附和后续的铺展过程，并使脱颗粒的观察变得复杂。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

CM 承认获得了国际C1抑制剂缺乏症患者组织（HAEi）、乌得勒支大学医学中心之友基金会以及兰茨泰纳输血研究基金会（LSBR）的经济支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES) VWR441476L
Na2HPO4SigmaS-0876
NaClSigma31434
KClSigma31248
MgSO4Merck KGaA1.05886
D-葡萄糖Merck KGaA1.04074
前列环素 Cayman Chemical18220
柠檬酸三钠Merck KGaA1.06448
柠檬酸 Merck KGaA1.00244
盖玻片Menzel-GläserBBAD02400500#A24 × 50 mm，No. 1 = 0.13 - 0.16 mm 厚度。
铬酸（2% CrO3）Riedel de Haen07404CAS [65272-70-0]。
血管性血友病因子 (VWF)实验室自制纯化
纤维蛋白原Enzyme Research LaboratoriesFIB3L
4孔培养皿，未处理Thermo Scientific267061
人血清白蛋白 V 级Haem Technologies Inc.823022
采血管，9 mL，9NC 凝血用 3.2% 枸橼酸钠Greiner Bio-One455322
细胞分析仪 Abbott DiagnosticsCELL-DYN 血液分析仪
多聚甲醛Sigma30525-89-4 
注射泵Harvard Apparatus, Holliston, MAHarvard apparatus 22
10 mL 注射器，直径 14.5 mmBD biosciences305959Luer-Lok 注射器
抗 CD63-生物素 Abcam AB134331
抗 CD62P-生物素 R&D SystemsDy137
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI)Polysciences Inc. 9224
链霉亲和素-Alexa Fluor 488 偶联物Thermo ScientificS11223 
浸油Zeiss444963-0000-000
洗涤剂溶液Unilever, Biotex
甘氨酸Sigma56-40-6 
聚乙烯醇Sigma9002-89-5Mowiol 40-88。
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Sigma1185-53-1 
1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷 (DABCO)Sigma280-57-9
羊抗人 VWF 多克隆抗体Abcam AB9378
Alexa Fluor 488-NHSThermo ScientificA20000
甘油Sigma-Aldrich15523-1L-R
石蜡膜BemisPM-9964 英寸 × 125 英尺卷。
非增强型硅胶片NagorNA 500-1200 mm × 150 mm × 0.125 mm。
定制切割带灌注和真空通道的硅胶片实验室自制由非增强型硅胶片 (Nagor, NA 500-1) 制成
1.5 mL 离心管Eppendorf AGT9661-1000AE
荧光显微镜Zeiss Observer Z1 配备 LED 激发光源。
显微镜软件Zeiss ZEN 2蓝色版
18 G 针头 (18 G × 1 1/2")BD biosciences305196
NaClRiedel de Haen31248375
TrisRoche10708976
塑料巴斯德吸管VWR612-1681 7 mL，非无菌，刻度至 3 mL。
硅胶管VWR228-0656内径 × 外径 × 壁厚 = 1.02 × 2.16 × 0.57 mm。
显微镜载玻片Thermo ScientificABAA000001##12E76 × 26 × 1 mm，45 ° 磨边，带磨砂端。

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P CD63
活细胞成像技术在流动条件下观察血小板脱颗粒与分泌过程
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