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利用四种生物传感器平台测定高亲和力抗体-抗原结合动力学

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DOI：

10.3791/55659

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2017年4月17日

 ,  ,  , 
1Department of Biotherapeutics Discovery, Immune Modulation and Biotherapeutics Discovery, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., 2The Fu Foundation School of Engineering and Applied Science, Columbia University

本文内容

摘要

本文介绍了使用四种常用生物传感器平台测定抗体-抗原结合亲和力和动力学的实验方案。

摘要

无标记光学生物传感器在药物发现中是表征生物分子相互作用的有力工具。本研究中，我们描述了实验室常规使用的四种生物传感器平台，用于评估十种高亲和力单克隆抗体（mAbs）与人前蛋白转化酶枯草溶菌素9型（PCSK9）之间的结合亲和力和动力学特性。Biacore T100 和 ProteOn XPR36 均基于成熟的表面等离子体共振（SPR）技术，但前者采用串联流路配置连接四个流路池，而后者则通过改进的6×6交叉微流控通道结构实现36个反应位点的并行检测。IBIS MX96 同样基于SPR传感器技术，并额外具备成像功能，可提供空间取向上的检测能力。该检测技术结合连续流动点样仪（CFM），能够同时进行96个反应位点的多重阵列点样与检测，显著提高了通量。相比之下，Octet RED384 基于生物膜干涉（BLI）光学原理，其光纤探针作为生物传感器，通过检测结合相互作用引起探针尖端表面干涉图样的变化来实现检测。与基于SPR的平台不同，BLI系统不依赖连续流动的流体系统，而是将传感器探针浸入384孔微孔板中的分析物溶液中，在轨道振荡条件下直接采集读数。

这些生物传感器平台各有优缺点。为了直接比较这些仪器获取高质量动力学数据的能力，所述方案通过采用相同的检测模式和相同高质量的试剂，来表征符合简单1:1分子相互作用模型的抗体-抗原动力学。

引言

获得可靠的动力学参数以表征抗体-抗原相互作用，是药物发现与开发过程中的关键环节1。光学表面等离子共振（SPR）生物传感器作为实时检测此类相互作用的“金标准”，已应用约二十年，可用于早期筛选符合标准的治疗性抗体候选分子2,3。除了可通过粗制上清液的快速结合筛选对抗体候选分子进行亲和力排序4，以及对纯化样品进行严格的动力学常数测定5外，生物传感器还可通过表位分组研究进一步区分先导候选分子的功能活性6,7。

为了满足针对多种治疗适应症的抗体类产品的日益增长的需求8，近年来已开发出多种创新的生物传感器仪器，以提高候选分子的筛选与表征效率9,10。这些仪器在微流控通道结构设计和/或检测生物分子相互作用所采用的光学原理方面有所不同。具体而言，Octet RED38411、ProteOn XPR3612 和 IBIS MX967 已将单个结合循环中可测量的相互作用数量分别提升至16、36和96，相较于传统的Biacore平台，通量显著提高。尽管这些不同的生物传感器平台均能提供用于表征抗体-抗原相互作用的关键动力学数据，但由于仪器配置的差异，它们在实验设置和操作流程上各不相同。例如，在IBIS MX96的表面等离子共振成像阵列平台中，多重配体固定步骤需在独立于检测器的外部打印设备中以离线模式完成7,13；相比之下，其余三种生物传感器平台采用“一体化”设计，所有组分（无论是活化试剂、配体还是分析物）添加至传感器表面的过程均通过预设程序按顺序实时记录。在Octet RED384中，这一基于生物膜干涉技术（BLI）的平台具有一个独特优势：提供预包被的光纤生物传感器，可直接用于“浸入即读”操作14，从而无需进行配体表面准备以及启动/平衡等步骤——而这些步骤在基于SPR的平台中通常必不可少。该仪器无流路的设计也简化了机械结构，并在处理粗样品时避免了堵塞和污染问题。ProteOn XPR36采用了新颖的6×6交叉流路设计，可通过切换流道方向（横向与纵向交替）实现“单次注射”动力学方法，生成36个相互作用位点15。与传统串联流路的Biacore T100平台一次仅评估单一配体或分析物浓度的结合动力学不同，该方法可在单个结合循环中同时监测多达36种不同的相互作用。

尽管这四种生物传感器平台存在差异，但它们在全球范围内的许多实验室中均被广泛使用。对于缺乏实际生物传感器操作经验的新用户而言，由于仪器设计上的差异，选择使用哪种仪器可能是一项具有挑战性的任务。为了确定最适合其研究目的的仪器，需要综合考虑数据质量、性能稳定性、通量、操作便捷性以及材料消耗等因素。尽管已有若干基准研究探讨了从多个实验室和生物传感器获得的结合动力学速率常数的变异性5,16，但最近发表的一项直接比较研究进一步从仪器性能的角度，深入分析了影响数据可靠性的系统性因素17,18。本视频提供的实验方案详细聚焦于实验设置与操作流程，并与题为《高亲和力抗体-抗原结合动力学评估中生物传感器平台的比较》的研究论文相配套17。这些方案不仅旨在帮助新的生物传感器用户将其应用于自身研究，同时也为现有用户在设计评估高亲和力抗体-抗原相互作用的实验时，提供有关技术挑战与注意事项的进一步见解。

方案

1. 蛋白质与抗体

  1. 按照先前所述方法17，制备并纯化人前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）以及十种来源于小鼠的抗PCSK9单克隆抗体（mAbs）。
  2. 使用超高效液相色谱（UPLC）系统19，将每种样品各10 µg依次注入分析型尺寸排阻（SEC）色谱柱，以评估纯化产物的纯度。

2. Biacore T100 中的动力学测量

  1. 仪器与试剂准备
    1. 将 CM5 传感器芯片在室温下平衡 15 分钟。
    2. 在室温下解冻两份 200 µL 的 200 mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液和两份 200 µL 的 50 mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液。
    3. 通过将 10x HBS-EP+ 储存液用水稀释，配制 1 L 的 1x HBS-EP 运行缓冲液（含 10 mM HEPES [pH 7.4]、150 mM NaCl、3 mM EDTA 和 0.005% v/v 吐温 P20）。
    4. 在 10 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中配制 1 mL 浓度为 30 µg/mL 的蛋白 A/G 溶液，并在 HBS-EP 运行缓冲液中配制每种 mAb 样品各 500 µL，浓度为 0.063 µg/mL。将一管冷冻的人源 PCSK9 置于冰上解冻。
    5. 在控制软件中，点击 "Tools | Eject Chip"，将传感器芯片放入卡匣并关闭。点击 "Tools | Set Temperature"，输入分析温度为 "25" °C，腔室温度为 "10" °C。
  2. 表面固定化
    1. 在控制软件中，点击 "File | Open/New Wizard Template"，在左侧面板的列表中选择 "Immobilization"。
    2. 点击 "New" 进入固定化设置界面。选择 "CM5" 作为芯片类型，并选择每个循环使用 "1" 个流路通道。
    3. 勾选每个 "Immobilize flow cell 1/2/3/4" 旁的复选框以激活选项。为所有流路通道选择 "Aim for immobilized level" 和 "Amine" 作为固定化方法。
    4. 输入 "30 µg/mL ProA/G" 作为配体，确保所有流路通道的目标固定化水平设定为 "10000" 响应单位（RU）。
    5. 勾选 "Prime before run"，点击 "Next"。选择 "Reagent Rack 2"，定义试剂位置，并将试剂分别移液至相应的样品瓶中。将试剂架重新插入仪器，然后点击 "Start"，输入实验名称并保存以启动运行。
  3. 分析物结合与再生循环
    1. 点击 "File | Open/New Method"，选择 "20140812 hu anti-PCSK9 IgGs binding to hu PCSK9" 并打开该方法。检查方法中的各项参数。
    2. 在 "Assay Steps" 中，确认共有 10 个循环，其中 "hu PCSK9" 为样品名称，且在 "Purpose" 中选择 "Sample"。重复次数设定为 "1"。
    3. 在 "Cycle Types" 中，设定 Capture 1 在流路 "2" 上的接触时间为 "220" 秒，Capture 2 在流路 "3" 上的接触时间为 "110" 秒，Capture 3 在流路 "4" 上的接触时间为 "55" 秒。所有捕获循环的流速均为 "10" µL/min。
    4. 选择 "Sample 1"，勾选 "Sample solution" 作为变量。设定在流路 "1, 2, 3, 4" 上的接触时间为 "600" 秒，解离时间为 "2700" 秒。流速设定为 "30" µL/min。
    5. 选择 "Regeneration 1"，在溶液字段中输入 "Glycine-HCl pH 1.5"，并设定在流路 "1, 2, 3, 4" 上的接触时间为 "20" 秒。
    6. 在 "Variable Settings" 中，为循环 1–3 输入 2 倍稀释的浓度梯度 "100 nM - 6.25 nM"，为循环 4–8 输入 "50 nM - 3.12 nM"，为循环 9–10 输入 "5 nM - 0.323 nM"。
    7. 在 "Setup Run" 中，选择检测流路 "2-1, 3-1, 4-1"，点击 "Next"，勾选 "Prime before run"，然后点击 "Next"。
    8. 选择 "Sample and Reagent Rack 1"，定义试剂位置，并将试剂分别移液至相应的样品瓶中。将试剂架插入仪器，然后点击 "Start"，输入实验名称并保存以启动运行。
  4. 使用 BiaEvaluation 进行数据分析
    1. 点击 "Kinetics/Affinity | Surface bound"，分别选择 Fc "2-1"、"3-1" 或 "4-1"，并勾选来自不同分析物浓度的所有显示曲线以及 "zero" 浓度的空白对照曲线。
    2. 点击 "Next" 获得扣除缓冲液空白后的曲线。然后点击 "Kinetics,"，选择 "1:1 Binding" 模型，点击 "Fit" 以获得拟合的动力学参数。
    3. 对于多个 mAb 表面的全局拟合，点击底部的 "Multiple Rmax"，并将同一 mAb 的其他 Fc 的结合曲线添加到列表中。
    4. 点击 "Next" 获得所有扣除缓冲液空白后的结合曲线。然后点击 "Kinetics,"，选择 "1:1 Binding" 模型，并在参数中为每个 Rmax 选择 "fit local"，以获得全局拟合的动力学参数。

3. 在 ProteOn XPR36 中进行动力学测量

  1. 仪器与试剂准备
    1. 将GLM传感器芯片和2升PBS-T-EDTA（PBS [pH 7.4]，0.005% Tween-20，3 mM EDTA）流动缓冲液于室温平衡15分钟。
    2. 在控制软件中，单击 "推出" 然后插入GLM芯片。将芯片温度设置为 "25" °C，并将自动进样器温度设为 "10" °C。点击 "甘油初始化" 并按照提示说明初始化芯片。
    3. 点击 "文件 | 打开" 从列表中选择一种预处理方案，将溶液配制到96孔板中，然后点击 "运行"，选择方案并点击 "开始".
    4. 室温下解冻一份1 mL的400 mM EDC溶液和一份1 mL的100 mM N-羟基琥珀酰亚磺酸钠（sulfo-NHS）溶液。
    5. 在10 mM醋酸钠（pH 4.5）中配制2 mL浓度为60 µg/mL的蛋白A/G，并在PBS-T-EDTA运行缓冲液中分别配制每种mAb样品500 µL，浓度分别为0.25 µg/mL、0.125 µg/mL和0.063 µg/mL。将一管冷冻保存的人源PCSK9置于冰上解冻。
  2. 固定、分析物结合与再生
    1. 点击 "文件 | 新建 | 新建方案"在 "配置"，输入实验名称，选择 "广义线性模型" 芯片，选择 "微孔板"，然后输入 "2.2" 毫升体积
    2. 选择 "实验方案 | 样本"，定义 "EDC/sulfo-NHS" 作为 "激活剂" 在 H1-H6 孔中 "蛋白A/G" 作为 "配体" 在 G1-G6 中， "乙醇胺" 作为 "失活剂" 在 F1-F6 中， "甘氨酸" 作为 "再生器" 在 E1-E6 中，使用 PBS-T-EDTA" 作为 "空白" 在 D1-D6 中， "mAb X 样品" 作为 "配体" 在 C1-C6 中，以及 "人PCSK9" 作为 "第二个96孔板中H1-H6孔的分析物。
    3. 选择 "步骤"，双击 "固定化" 在 "方案编辑"，步骤包括依次进行三次水平注射，分别为 EDC/sulfo-NHS、蛋白 A/G 和 1 M 乙醇胺，每步注射的流速均为 "30" µL/min，接触时间为 "300" s.
    4. 点击 "再生"，注射三 "18"-s 的甘氨酸脉冲（pH 1.5）于 "100" µL/min，在水平和垂直方向上进行，随后进行两次 "60"- 用 PBS-T-EDTA 脉冲冲洗 "25" µL/min，两个方向均如此。
    5. 点击 "配体"，使用流速为的垂直方向注射单克隆抗体1和单克隆抗体2 "25" µL/min，接触时间为 "160" s.
    6. 点击 "分析物"，同时在6个水平通道上依次注入5个浓度的人PCSK9（100 nM至6.25 nM，2倍系列稀释）及空白缓冲液，流速为 "40" µL/min 用于 "600" 关联时间的秒数，随后 "2700" 解离时间的秒数。
    7. 点击 "再生"，注射两 "18"- 以甘氨酸（pH 1.5）脉冲洗脱 "100" µL/min，在水平和垂直方向上均如此。
    8. 对剩余的单克隆抗体，每次结合循环后重复上述步骤。
      注意：除100 nM - 6.25 nM人PCSK9浓度系列外，还使用了25 nM - 1.56 nM和5 nM - 0.313 nM浓度系列。
    9. 根据步骤3.2.2中定义的试剂位置，将样品和试剂分别加入两个96孔板中，然后点击 "运行" 标签页中，选择方案/实验并点击 "开始".
  3. 使用 ProteOn Manager 进行数据分析
    1. 点击 "面板类型" 并选择 "分析物"然后点击 "实验步骤" 并从列表中选择所有结合曲线。
    2. 点击 "自动处理"，然后单击 "过程 | 通道参考 | 间隔点"然后点击 "步骤 | 双重对照 | 行 | A6".
    3. 点击 "创建数据集" 以保存每种单克隆抗体在三种不同表面上的独立数据集，用于动力学分析。
    4. 点击 "分析数据集"，高亮每个 mAb 数据集并点击 "分析 | 动力学"选择 "朗缪尔" 模型和 "同时测定 ka/kd" 并单击 "下一步".
    5. 同时高亮显示关联和解离的拟合范围，选择 "局部" R最大，然后单击 "下一步" 拟合以获得拟合的动力学参数。
    6. 重复上述步骤，但选择 "分组" R最大 用于拟合以获得实验R值最大值 用于计算配体表面活性的数值。

4. 在 Octet RED384 中进行动力学测量

  1. 试剂与样品板制备
    1. 通过将10倍浓度的储存液用PBS稀释，配制50 mL的1×KB（动力学缓冲液，含PBS pH [7.4]、0.02% Tween-20、0.1%白蛋白和0.05%叠氮化钠）。
    2. 将1×KB以每孔200 µL的量加入96孔板中。将48个抗人捕获（AHC）生物传感器探头置于各孔中水化，时间不少于10分钟。
    3. 用1×KB将每种单克隆抗体（mAb）样品分别配制成20 µg/mL、10 µg/mL和5 µg/mL的浓度；同时将人PCSK9以2倍系列稀释法配制成从100 nM到1.56 nM共7个梯度浓度。
    4. 将mAb样品以每孔90 µL的量加入384孔斜底微孔板（称为试剂板），并将人PCSK9溶液以相同体积加入另一块384孔微孔板（称为样品板）。
    5. 在样品板中加载一系列1×KB和甘氨酸（pH 1.5）溶液。
      注：这些1×KB孔用于芯片预处理、基线稳定和分析物解离。甘氨酸溶液用于再生步骤。
  2. 实验方法设置
    1. 在数据采集软件中，点击 "Experiment | New Experiment Wizard | New Kinetics Experiment | Basic Kinetics"。
    2. 在 "Plate Definition" 中，按以下步骤定义样品类型和位置：
      1. 选择 "16" 个通道和 "384-well" 格式。
      2. 在板图中，按住Shift键并左键点击孔位，一次高亮16个孔，以定义样品和试剂的位置。
      3. 右键点击含有mAb样品的孔，选择 "Load"，表示mAb加载（或捕获）到AHC传感器上的步骤。在右侧表格中输入mAb名称和浓度。
      4. 右键点击含有人PCSK9的孔，选择 "Sample"，表示将已捕获mAb的传感器浸入孔中以测量结合相互作用的步骤。在右侧表格中输入相应的摩尔浓度。
      5. 将含有1×KB的孔定义为 "Buffer" 或 "Neutralization"，将含有甘氨酸的孔定义为 "Regeneration"。
    3. 在 "Assay Definition" 中，按以下步骤定义实验设置：
      1. 点击 "Add"，依次添加 "Baseline"、"Regeneration"、"Equilibration"、"Loading"、"Association" 和 "Dissociation" 步骤至列表中，对应时间分别为 "30" s、"30" s、"18" s、"200" s、"500" s 和 "1800" s。振荡速度为 "1000" rpm。
      2. 要将步骤添加至 "Assay Steps List"，首先点击某一步骤，然后点击位于样品板或试剂板中的相应孔。具体步骤如下：
        1. 平衡-再生：通过在甘氨酸（pH 1.5）中进行 "15" 秒浸入，交替在1×KB中进行 "15" 秒浸入，共循环三次，对AHC传感器进行预处理。
        2. 加载：将mAb样品捕获到AHC传感器上，持续 "200" 秒。
        3. 基线：在结合步骤前，建立 "60" 秒的BLI信号基线。
        4. 结合：将传感器浸入含不同浓度人PCSK9的孔中，进行 "500" 秒的结合期。
        5. 解离：将结合了PCSK9的传感器浸入新的1×KB孔中，进行 "1,800" 秒的解离期。
        6. 再生：将结合了mAb-PCSK9的传感器浸入甘氨酸（pH 1.5）孔中，在每个结合循环之间施加两次 "18" 秒的脉冲。
    4. 在 "Review Experiments" 中，浏览各步骤，如有必要可返回前几个标签页进行修改。
    5. 在 "Run Experiments" 中，输入 "60" 秒的延迟时间，并在等待期间振荡样品板。将板温设置为 "25" °C，然后点击 "GO."
  3. 使用ForteBio数据分析软件进行数据分析
    1. 点击 "Data Selection | Loaded Data | Kinetics | PCSK9 antibodies binding to PCSK9 7.23.14"
    2. 在 "Processing" 中，按以下方式处理数据：
      1. 步骤1：点击 "Sensor Selection"，高亮H1-H6通道的传感器，右键点击并选择 "Change Sensor Type | Reference Sensor."
      2. 步骤2：勾选 "Subtraction"，并选择 "Average Reference Sensors"，以从每个活性样品传感器信号中减去6个空白缓冲液传感器的平均值。
      3. 步骤3：点击 "Align Y Axis"，选择 "Baseline"，将所有结合曲线对齐至结合前的基线步骤。
      4. 步骤5：勾选 "Savitsky-Golay Filtering"，通过提高信噪比来平滑结合曲线，并点击 "Process Data!"。
      5. 步骤6：点击 "Processed Results"，查看处理后的结合曲线。
      6. 步骤7：查看右侧显示各处理步骤后结合曲线的四个面板，点击 "Save Processed Data" 保存处理后的数据。
    3. 在 "Analysis" 中，勾选 "Association and Dissociation"，并选择 "1:1" 模型。
    4. 高亮 "Global (full)" 拟合的结合曲线，并按 "color" 分组。使用 "Rmax linked" 对相同mAb浓度包被的传感器进行分组拟合，以获得实验Rmax值，用于计算配体表面活性；使用 "Rmax unlinked by sensor" 对多个mAb浓度包被的传感器进行全局拟合。
    5. 点击 "Fit Curves" 以获得拟合的动力学参数。每次拟合分析结束后保存结果。

5. 在 IBIS MX96 中进行动力学测量

  1. 仪器与试剂准备
    1. 将 COOH-G 芯片在室温下平衡 15 分钟。
    2. 准备1升系统运行缓冲液（PBS [pH 7.4]，0.01% Tween-20）和固定化缓冲液（10 mM 醋酸钠 [pH 5.0]，0.01% Tween-20）。
    3. 在系统运行缓冲液和乙酸钠（pH 5.0）固定化缓冲液中，将每种单克隆抗体从 20 µg/mL 至 0.16 µg/mL 进行2倍系列稀释。
    4. 将单克隆抗体样品分装至两块独立的96孔板中，每种单克隆抗体在每孔200 µL的体积下，以滴定浓度占据8个纵向排列的孔。
    5. 室温下解冻 400 mM EDC 和 100 mM sulfo-NHS 的等分试样。
    6. 在醋酸钠（pH 5.0）固定缓冲液中配制300 µL浓度为50 µg/mL的蛋白A/G溶液，并用移液器将其转移至小瓶中。
    7. 在系统运行缓冲液中，将人PCSK9通过2倍系列稀释法配制为体积200 µL、浓度从100 nM至0.39 nM的溶液。用移液器将其分装至不同的小瓶中。
  2. 多循环动力学与胺偶联抗体阵列
    1. 将 EDC/sulfo-NHS（400 mM/100 mM）等分混合物加入新的96孔板的上方48个孔中，每孔200 µL。
    2. 将单克隆抗体来源板（用乙酸钠溶液 [pH 5.0] 稀释）置于打印机的2号位置，EDC/sulfo-NHS 试剂板置于1号位置。
    3. 将传感器芯片安装到CFM中。打开 "CFM 2.0" 软件，然后单击 "加载设置 | 96 孔胺偶联"10 × 8 抗体芯片阵列的制备方法如下：
      1. 使用48个微通道将试剂板上半部分的EDC/sulfo-NHS输送至传感器，并在传感器表面循环流动 "5" 最小
      2. 将源板上半部分的单克隆抗体样本递送至传感器，并使其循环通过活化表面 "10" 最小
      3. 从50 mL锥形管中将固定缓冲液流经抗体表面 "5" 最小
      4. 对源板下半部分剩余的单克隆抗体样品重复上述步骤。
    4. 将打印好的传感器芯片装入仪器中。在控制软件中，点击 "文件 | 连接 | 打开测量 | 现有测量" 并选择 "2014-08-15".
    5. 在 "通用"，选择 "G - 系统预充" 在……下方 "完整系统脚本"然后选择 "G - 猝灭" 通过注入 150 µL 1 M 乙醇胺使单克隆抗体表面失活。
    6. 点击 "相机" 可视化单克隆抗体阵列，并在必要时调整对比度。移动红色方框以包围单克隆抗体斑点，将绿色方框移至活性单克隆抗体斑点之间的空白区域，作为参考位置。
    7. 在 "分析周期"，选择 "A - 前后标准运行" 在……下方 "IBIS 脚本"设定基线时间为1.0分钟，结合时间为10.0分钟，解离步数为90步，流速为8 µL/s。
    8. 内部的 "循环"，每次结合循环中，在五次缓冲液注射之后，依次注射一种浓度的人源PCSK9。每次结合循环之间，使用pH 2.0的甘氨酸缓冲液再生单克隆抗体表面。
  3. 单周期动力学结合Fc捕获抗体阵列
    1. 将新的传感器芯片安装到CFM中。重复上述步骤5.2.3至5.2.5，将mAb样品替换为蛋白A/G。
    2. 将传感器芯片从MX96上取下，并重新插入CFM打印机中。
    3. 使用48个微通道将mAb输送至孔板上半部分的蛋白A/G传感器表面，并通过双向流循环作用10分钟。
    4. 对板子下半部分剩余的单克隆抗体样品重复上述步骤。
    5. 将打印好的传感器芯片安装到 MX96 仪器中。在数据采集软件中，点击 "文件 | 连接 | 打开测量 | 现有测量 | 下一步" 并选择 "蛋白A+G结合动力学7.30.14".
    6. 点击 "相机" 可视化单克隆抗体阵列，并在必要时调整对比度。移动红色方框以圈定单克隆抗体斑点，将绿色方框移至活性单克隆抗体斑点之间的空白区域，作为参考位置。
    7. 在 "分析周期"，选择 "A - 前后标准运行" 在……下方 "IBIS 脚本"设置 "1.0 分钟" 作为基线， "10.0 分钟" 用于关联，以及 "10" 解离步骤 "8 µL/秒" 速度
    8. 内部 "循环"，每次分析物注射前，先进行五次缓冲液注射，然后依次注射一个浓度的人源PCSK9。每次分析物注射之间不进行再生步骤。
  4. 使用 SPRint 和 Scrubber 进行数据分析
    1. 在 SprintX 软件中，点击 "文件 | 打开三角形文件"，选择列表中的所有样品进样，并检查 "保存 SprintX 文件，" "校准"，以及 "RLL 测定" 点击之前 "分析。"
      注意：RLL 值表示传感器表面固定/捕获的单克隆抗体（mAb）水平。
    2. 检查 "参考文献" 并选择 "局部" 使用相邻的参考点。同时检查 "对齐" 首次注射时点击 "开始自动化。"
    3. 在“序列”选项卡中，选择 "在工具栏中显示标尺，" 调整以选择在第一次样品注入前紧邻的基线小区域，并进行选择 "零"
    4. 在 Scrubber 中通过选择生成用于分析的 .IBMX 文件 "导出为 ibmx 文件" 然后点击 "开始自动化。"
    5. 启动 Scrubber 并加载 .IBMX 文件。输入 "100 n" 作为 "储备浓度" 和 "2" 作为 "稀释倍数".
    6. 裁剪数据，去除注射开始前的所有基线，并在结合期开始时对齐结合曲线。
      注意：在单周期动力学实验中，不要对曲线进行叠合。
    7. 前往 "动力学" 标签，调整标尺以设定注射结束时间，选择 "kd" 并拟合，然后 "固定 kd." 选择 "kakd" 并再次安装。
    8. 漂浮的 kd 柱并再次拟合，以进一步优化拟合效果。
      注意：如需拟合单周期结合曲线，请单击 "光学镊子" 并取消选择 "减去，" 然后选择 "分离" 并漂浮 "开始损伤" 将色谱柱拟合以使关联谱图回归至理论基线原点。
    9. 在“结果”选项卡中查看拟合的动力学参数。

结果

图1展示了来自CFM的抗体阵列图像以及两种固定方法下 spotted mAb 的水平，图2展示了在MX96上对这些mAb阵列进行多循环动力学和单循环动力学测量所生成的相应结合传感图。在四种生物传感器平台上，由多个抗体包被表面生成的实时结合曲线及动力学拟合曲线如图3-6所示。图7展示了通过对这些结合曲线进行全局分析所获得的最终动力学速率和平衡结合常数的比较结果。各个关联（ka）、解离（kd）和平衡（KD）结合常数列于表1中。为展示在同一仪器内生成数据集的变异性，图8展示了在不同mAb表面密度下ka、kd和KD的分布图，图9进一步比较了不同生物传感器平台间mAb表面计算结合活性的结果。

SPR检测；显示单克隆抗体浓度-反应关系的曲线图；带有标记孔位的微阵列图像。
图1. 通过IBIS MX96中的CFM打印制备的胺偶联（A）和Fc捕获（B）抗体表面的多重配体阵列。 打印阵列的图像如图所示 左侧 面板中，红色方框包围的灰色区域表示抗体的存在。位于活性抗体斑点之间的较暗的间隔区域用于参考减除。每列包含以图像下方和左侧所示滴定浓度打印的抗体。通过计算活性位点与参考位点之间整体位移的差异，得出打印抗体的量，结果如图所示。 右侧 面板 请点击此处以查看此图的放大版本。

表面等离子共振图，显示蛋白质相互作用分析中响应值随时间的变化。
图 2. IBIS MX96 系统中多循环（A）与单循环（B）动力学实验实时结合传感图的比较。在每段相应传感图上方标注了在 10 × 8 抗体阵列上依次注入的递增浓度人源 PCSK9。 请点击此处查看该图的放大版本。

Biacore T100 传感器图谱，单克隆抗体结合动力学，表面等离子体共振分析。
图 3. Biacore T100 中捕获抗体与人 PCSK9 结合的传感图谱及 1:1 动力学模型拟合叠加图。 相互作用在高密度（上图）、中等密度（中图）和低密度（下图）表面条件下进行评估。叠加的平滑黑线表示在不同人 PCSK9 浓度（彩色线条）下，结合响应信号按 1:1 相互作用模型进行的动力学拟合结果。请点击此处查看此图的放大版本。

蛋白质相互作用分析、单克隆抗体结合亲和力的传感图谱、ProteOn XPR36 结果。
图 4. 捕获抗体与人 PCSK9 结合的传感图谱及 ProteOn XPR36 上 1:1 动力学模型拟合叠加图。 相互作用在高密度（上图）、中密度（中图）和低密度（下图）表面条件下进行评估。叠加的平滑黑线表示在不同人 PCSK9 浓度（彩色线）下的结合响应信号，按照 1:1 相互作用模型进行的动力学拟合结果。请点击此处查看该图的放大版本。

Octet RED384 结合曲线、单抗动力学、传感器图数据、免疫分析结果、图表结果。
图 5. Octet RED384 中捕获抗体与人 PCSK9 相互作用的结合传感器图及 1:1 动力学模型拟合叠加图。该相互作用在高密度（上图）、中密度（中图）和低密度（下图）表面条件下进行评估。叠加的红色曲线表示在不同人 PCSK9 浓度下的结合响应信号（彩色曲线）按 1:1 相互作用模型进行的动力学拟合结果。请点击此处查看该图的放大版本。

IBIS MX96 结合实验结果，伯胺偶联和 Fc 捕获的微阵列传感器图谱。
图 6. 在 IBIS MX96 上，伯胺偶联（A）和 Fc 捕获（B）抗体与人 PCSK9 结合的传感器图谱及 1:1 动力学模型拟合叠加图。 结合曲线按照 图 1 中的阵列板图排列为 10 × 8 的图示面板。黑色线条表示在不同浓度人 PCSK9 条件下记录的结合响应信号，叠加的红色线条表示拟合曲线。请点击此处查看该图的高清版本。

动力学分析图，显示10种单克隆抗体的结合速率（ka、kd）和亲和力（KD）；数据比较。
图7. 四种生物传感器平台测得的结合动力学参数——关联速率常数 ka（A）、解离速率常数 kd（B）和平衡解离常数 KD（C）的比较。 动力学参数来源于对图3至图6中结合曲线的全局分析。各仪器表示如下：Biacore T100（蓝色）、ProteOn XPR36（绿色）、Octet RED384（红色）、IBIS MX96，胺偶联（紫色）和IBIS MX96，Fc捕获（橙色）。请点击此处查看该图的放大版本。

表面等离子体共振（SPR）中抗体捕获密度与动力学常数（kon, koff, KD）关系的动力学分析图
图 8. Biacore T100（A）、ProteOn XPR36（B）、Octet RED384（C）、IBIS MX96 胺偶联（D）和 IBIS MX96 Fc 捕获（E）系统中，多种抗体表面密度下动力学速率常数一致性的比较。动力学参数 ka（上子图）、kd（中子图）和 KD（下子图）均通过单个抗体表面密度的群体分析获得。请点击此处查看该图的放大版本。

四种生物传感器系统中单克隆抗体表面活性的百分比柱状图比较：Biacore、ProteOn、Octet、IBIS。
图9. 四种生物传感器平台中抗体表面的结合活性及其标准差（误差线）。 数值根据相关研究文献中描述的公式计算得出17。请点击此处查看该图的高清版本。

kakdKD
(M-1s-1)(s-1)(nM)
mAb 111.7 (7.8) x 1054.89 (4.18) x 10-50.052 (0.05)
mAb 21.53 (0.28) x 1051.30 (1.54) x 10-50.092 (0.12)
mAb 311.4 (8.3) x 10527.6 (11.0) x 10-50.333 (0.20)
mAb 43.61 (1.6) x 10520.1 (12.3) x 10-50.659 (0.54)
mAb 50.59 (0.21) x 1053.46 (2.50) x 10-50.663 (0.46)
mAb 61.19 (0.78) x 1057.21 (3.83) x 10-50.894 (0.64)
mAb 71.29 (0.53) x 10516.4 (5.63) x 10-51.57 (1.02)
mAb 84.02 (2.23) x 10522.8 (10.7) x 10-50.768 (0.68)
mAb 94.20 (2.13) x 1056.67 (4.3) x 10-50.197 (0.16)
mAb 101.20 (0.49) x 10512.5 (7.64) x 10-51.27 (0.80)

表1： 通过四种生物传感器仪器获得的结合曲线，采用1:1相互作用模型进行全局拟合，得到10种单克隆抗体的动力学速率和平衡结合常数。

讨论

我们的直接对比研究表明，每种生物传感器平台都有其各自的优势与局限性。尽管通过肉眼比较可见抗体的结合谱相似（图3 - 6），且在不同仪器间获得的动力学速率常数的排序高度一致图7），我们的结果表明，采用连续流动流体系统的 SPR 仪器在解析具有慢解离速率的高亲和力相互作用方面更具优势。在解离相期间，数据集中观察到向上的漂移例如单克隆抗体2、单克隆抗体5和单克隆抗体9； 图5由BLI无流体系统生成。这一发现在很大程度上可归因于微孔板中样品随时间发生的蒸发，这是该系统的主要局限性。由于这一固有缺陷，实验时间也被限制在12小时以内；因此，该平台的实验程序设置的时间较短（500秒结合期和30分钟解离期），而其他平台的实验时间较长（10分钟结合期和45分钟解离期）。然而，缩短实验时间似乎并未减轻蒸发对数据质量/一致性的不利影响，因为基于BLI的仪器所获得的速率常数由于部分解离速率的波动而表现出较低的线性度。图8C）。除了样品蒸发因素外，所用捕获试剂的差异也可能导致了实验结果的不同。尽管三种基于微流控的SPR平台均使用了蛋白A/G，但非微流控的BLI平台则采用了AHC传感器。由于蛋白A/G对单克隆抗体（mAbs）的亲和力可能弱于AHC这种基于抗体的生物传感器表面，因此mAb-抗原复合物在蛋白A/G表面的解离速率可能被人为地表现为比在AHC表面更快。这一推测得到了实验数据的支持：BLI平台测得的解离速率值 consistently 低于其他仪器获得的结果。图7, 红线然而，BLI平台相较于其他平台具有多种优势。例如，由于提供多种预包被传感器可供直接使用，该平台在传感器选择和检测配置方面具有高度灵活性。在我们的实验中，使用AHC传感器省去了配体固定化步骤，从而缩短了准备时间。此外，与采用复杂管路和阀切换装置的流体SPR平台相比，BLI平台所需的维护工作显著减少。这一特性在处理可能引起堵塞和污染问题的粗样品实验中具有明显优势。

随着对高效、快速且准确鉴定治疗候选分子的需求不断增长，生物传感器通量的需求也在上升。在四种生物传感器平台中，能够进行96配体阵列打印的生物传感器通量最高，其次是采用交叉式36配体格式的生物传感器以及基于BLI、具有16通道同步检测功能的生物传感器，这三种平台将单个结合循环中可测量的相互作用数量分别提升至96、36和16。这些通量能力显著高于传统SPR平台，后者受限于仅通过单一串联流路连接的四个流动池。由于我们的实验涉及的样本量相对较小（即在多种表面密度下评估10种单克隆抗体，并采用较长的解离时间），仪器通量在决定实验效率方面仅起到中等作用。三种高通量平台的实验时间没有显著差异，且在所有情况下实验均在一天内完成。相比之下，尽管传统串联流路SPR在实验设置完成后可实现无人值守的自动化数据采集，但仍需3天才能完成实验。在其他涉及大量样本（i.e. 数百至数千个）的研究中，例如用于解离速率排序/动力学筛选或表位分组分析，通量则成为关键因素。

尽管IBIS MX96的通量远高于其他生物传感器，因此是此类应用的理想选择，但它仍存在一些不足之处。特别是，CFM阵列打印显示出较大的表面不均一性（图1）以及数据重复性降低（图8D和8E）。对于精确的动力学测量，生物传感器表面配体的量是一个关键参数，必须加以控制，以确保结合响应不会受到质量传递或空间位阻等次要因素的干扰。对于Biacore T100和ProteOn XPR36，最优RL水平是基于标准Rmax值计算方法确定的，如研究论文17所述。而对于Octet RED384和IBIS MX96平台，则通过一系列在恒定时间内连续两倍稀释的抗体经验性地获得单克隆抗体（mAb）捕获水平。由于对捕获步骤缺乏了解或控制，导致表面抗体密度较高，结合响应信号较强（图2），这可能影响了动力学速率常数的准确性。此外，打印机与SPR检测器分离的设计在进行涉及再生步骤的多循环结合测量时也带来了挑战。唯一可行的多循环动力学实验方案是通过直接胺偶联将mAb固定在芯片表面，而不是像其他三种生物传感器平台那样利用固定化的蛋白A/G表面捕获mAb的Fc段。因此，必须额外进行再生条件筛选实验以确定最佳再生条件。该方案的结果导致观察到的表面活性比Fc捕获法低约90%（图9），同时实验耗时更长。为了实施Fc捕获方法，采用了另一种单循环动力学策略。该策略包括依次注入浓度递增的分析物，且每次注入之间不进行再生（图2）。这种极为便捷但较少使用的方法不仅缩短了实验时间并减少了试剂消耗，而且获得的动力学速率常数与其他生物传感器的结果高度一致（图7）。因此，采用这种单循环动力学方法克服了仪器固有的结构限制，为高通量获取高分辨率动力学速率常数提供了可能。

尽管Biacore T100在通量方面存在主要局限性，但我们的结果总体表明，其产生的数据一致性最高，质量最优。紧随其后的是通量约高10倍的ProteOn XPR36。当表征高亲和力抗体-抗原相互作用时，若接近仪器检测极限，此类技术挑战较大，而这些仪器生成高质量数据的能力便成为显著优势。然而，Octet RED384仪器在系统层面存在局限性，阻碍了对解离速率常数的准确测定即，无法达到检测慢解离速率所需信号衰减的灵敏度），Biacore T100 和 ProteOn XPR36 均可提供灵敏且可靠的检测以实现区分。

披露

本视频文章的出版费用由 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals 支付。

致谢

作者感谢 Noah Ditto 和 Adam Miles 在 IBIS MX96 上提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Biacore T100 系统GE Healthcare28975001T100 系统已升级至 T200
CM5 传感芯片 GE HealthcareBR100012
BIAevaluation GE Healthcare版本 4.1
Biacore T100 控制软件GE HealthcareT100 控制软件已升级至 T200
胺偶联试剂盒GE HealthcareBR100050 包含：750 mg 盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC），115 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），10.5 mL 1.0 M 盐酸乙醇胺，pH 8.5 
HBS-EP+ 缓冲液 10×GE HealthcareBR100669浓缩储备液 
塑料小瓶，外径 7 mmGE HealthcareBR100212 
橡胶盖，3 型GE HealthcareBR100502
塑料小瓶和盖，外径 11 mmGE HealthcareBR100214 
ProteOn XPR36 蛋白质相互作用阵列系统Bio-Rad1760100
ProteOn Manager 软件 Bio-Rad1760200版本 3.1.0.6
GLM 传感芯片Bio-Rad1765012
胺偶联试剂盒Bio-Rad1762410包含 EDAC（EDC）、sulfo-NHS、盐酸乙醇胺 
再生与平衡试剂盒及缓冲液Bio-Rad1762210包含甘氨酸缓冲液（pH 1.5、2.0、2.5、3.0）各 1 份，以及 NaOH、SDS、HCl、磷酸、NaCl；每种溶液 50 mL 
2 L PBS/Tween/EDTA 缓冲液Bio-Rad1762730包含磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4，0.005% Tween 20，3 mM EDTA 
Octet RED384 系统FortéBio
数据分析软件FortéBio版本 9.0.0.4
Dip and Read 抗人 IgG Fc 捕获（AHC）生物传感器FortéBio18-5060每盘 96 个生物传感器 
384 孔斜底板 FortéBio18-5080
生物传感器分配器FortéBio18-5016
动力学缓冲液 10xFortéBio18-109210 倍浓度，含 ProClin 300。 
IBIS MX96 SPRi 系统Wasatch Microfluidics
微流控连续流动微点样（CFM）打印机Wasatch Microfluidics版本 2.0
SensEye COOH-G 芯片Wasatch Microfluidics1-09-04-004
数据分析软件Wasatch Microfluidics版本 6.19.3.17
SPRint 数据分析软件Wasatch Microfluidics版本 6.15.2.1
Scrubber 2BioLogic Software版本 2
Pierce 重组蛋白 A/GThermoFisher Scientific21186

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