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比较电子烟雾与香烟烟雾在一种新型模型中的效应 体内 暴露系统

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DOI：

10.3791/55672

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2017年5月24日

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1Jobst Vascular Research Laboratory, University of Michigan Medical School, 2Department of Engineering, Purdue University, 3Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, University of Michigan Health System

本文内容

摘要

本方案描述了一种使啮齿类动物暴露于电子烟雾（E-vapor）和香烟烟雾的方法。通过改造麻醉舱并配备自动抽气系统，构建暴露室，该系统可将电子烟雾或香烟烟雾递送至啮齿类动物。该系统可轻松调整，以适应多种实验终点。

摘要

电子烟（E-香烟) 正被广泛使用，且其流行程度不断上升。据估计，超过900万成年人 regularly 使用电子烟。电子烟雾（E-vapor）暴露可能带来的不良健康影响尚不明确。尽管已有多种动物模型用于 E-蒸气 暴露方法已被开发，但很少有模型能在同一暴露系统中使啮齿类动物接触临床相关剂量的尼古丁，并与香烟烟雾进行直接比较。本文介绍了一种构建和操作暴露系统的方法 E-蒸气 麻醉室和香烟烟雾室。这些室通过在麻醉室中配备计算机控制的泵送系统构建而成，该系统可输送稳定剂量的 E-蒸气 或香烟烟雾暴露于啮齿类动物。尼古丁暴露通过定量暴露前后血清可替宁水平进行间接测量。该暴露系统可进行调整，以适应多种类型的 E-香烟 以及烟草香烟，可用于比较其影响 E-蒸气 和香烟烟雾 体内.

引言

自2004年进入美国市场以来，电子烟（E-cigarettes）已发展成为一个价值数十亿美元的产业，据估计，近900万成年人经常使用电子烟1。在2014年和2015年，使用电子烟的高中生人数已超过使用传统香烟的人数2。电子烟使用者数量的不断增长，促使科研界开展大量研究，以评估其潜在的不良健康影响。

电子烟通过加热一种黏稠的溶液产生气溶胶（被称为"E-vapor"），该溶液通常含有水、聚乙二醇或植物甘油、尼古丁以及调味剂的混合物3,4。研究表明，E-vapor中含有多种有害化合物，包括活性氧（ROS）、尼古丁、多种醛类以及多环芳烃5,6。其中许多化合物是在吸入前电子烟液雾化过程中形成的7。值得注意的是，这些有害化合物中有不少也存在于传统香烟烟雾中，因此人们担忧电子烟的使用可能带来类似的不良健康后果7。

关于电子烟对健康的影响，目前尚无广泛共识。为解决这一问题，已开发出多种电子烟雾暴露的动物模型（表1）。这些模型采用了多种方法，如全身电子烟液暴露和机械通气。尽管现有模型已提供了有价值的实验数据，但在同一暴露系统中直接与传统香烟烟雾进行比较的研究仍然较少。表1）。此外，尽管一些人类研究表明电子烟 吸烟者和电子烟使用者的血清可替宁水平通常在30-200 ng/mL之间，但许多电子烟气溶胶和香烟烟雾暴露模型的暴露水平超出这一范围8,9,10,11,12.

本文介绍了一种用于比较香烟烟雾与电子烟雾暴露效应的方法 体内 可产生与人类研究相似的血清可替宁水平。

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方案

以下实验方案是在密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导和批准下进行的。

1. 电子烟雾暴露舱组装

注意：使用过程中，应将完整的实验舱置于通风橱内。本实验中的实验舱置于温度可控且经过过滤的实验室环境中。研究者可选择监测系统的这些方面，以确保室内空气质量的一致性。作为可选方案，可用金属笼覆盖监测设备，以防止啮齿类动物干扰，同时允许监测设备对实验舱内部环境进行采样。

  1. 获取一个带有气密可拆卸盖子、容积为20 L的麻醉室。
  2. 使用配备适合切割该材料锯片的曲线锯，在腔室盖子上距离腔室后边缘约7.6 cm处切割一个直径为10.2 cm的孔。
  3. 将可调节通风口插入孔中，并使用任何填缝胶粘剂固定到位。
    注意：确保啮齿类动物无法接触到舱室内的密封胶，因为它们可能会啃咬该材料。为防止出现这一问题，应将密封胶涂在舱室外壁上以安装通气口。
  4. 将硅胶管剪成两段，每段15 cm，将两端分别连接到T型接头的两侧。
    注意：硅胶管可能与电子烟雾或香烟烟雾中的某些成分发生反应。因此，研究人员可考虑使用非反应性管路。
  5. 将两根硅胶管穿过腔室盖前端附近的预制孔，使T型连接头位于腔室内。确保使用密封胶或电工胶带将管路固定在盖子上。
  6. 将硅胶管的自由端连接到两个微型空气泵的输出端。应使用双面胶带或密封胶将泵固定在培养室的盖子上。
    注意：连接至泵输出端的管路长度应尽可能短，以减少使用过程中管路内表面冷凝的蒸气量。
  7. 使用一根新的硅胶管，将一端连接至其中一个气泵的进气端（气泵A） 图1），并将该管子截成约4 cm长。此部分为使用腔室时插入电子烟的位置。确保管子的直径能够紧密贴合电子烟的末端。
  8. 使用一根新的硅胶管，将一端连接到另一台空气泵的进气端（泵B的进气端） 图1）。该泵会将室内空气引入腔室，因此必须将管子末端置于通风橱外。管子的长度并无严格要求，但应尽可能短，以减少气流阻力。
  9. 在腔室内，使用双面胶粘贴两个小钩子，用于固定氧气和一氧化碳气体监测仪。

电子烟空气混合示意图，包含泵、排气口以及用于排放分析的CO/O2气体监测器。
图1. 电子烟烟雾暴露腔室示意图。
腔室置于通风橱内（图中未显示）。室内空气泵（泵B）以2 L/min的流速持续将通风橱外的空气引入腔室。电子烟泵（泵A）以每4秒133 mL的量抽吸电子烟雾，两次抽吸之间有30秒的间隔。电子烟雾与室内空气在进入腔室前进行混合。气体监测器持续测量腔室内一氧化碳（CO）和氧气（O2）的浓度。电子烟雾通过排气口被动排入通风橱。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 香烟烟雾暴露舱组装

注意：几乎任何品牌的香烟均可用于此系统，但使用标准化科研香烟（例如肯塔基大学1R6F科研香烟）成本效益更高、结果更可靠，且最适用于本实验。

  1. 按照步骤 1.1 - 1.6 进行操作， & 步骤 1.9.
  2. 使用一根新的硅胶管，将一端连接至香烟点火装置，另一端连接至空气泵的进气侧（泵A） 图2). 使用时，香烟点火装置应置于通风橱内，但位于暴露室外。
    注意：香烟点火装置的构建需要具备金属加工和电气工程方面的知识。此处不提供详细的构建步骤，构造图纸请参见补充材料。
  3. 使用一根新的硅胶管，将一端连接到另一台空气泵（Pump B） 图2）。该泵会将室内空气引入腔室，因此必须将管路末端置于通风橱外。
  4. 在腔室前壁切割数个5 mm宽的垂直狭缝，并在腔室外侧安装一台计算机风扇，使其覆盖该开口。确保风扇正面朝向腔室，以便风扇能通过此开口将空气吹入腔室内部。

香烟烟雾分析装置示意图，配有用于检测一氧化碳和氧气的气体监测仪，并包含空气泵。
图 2. 香烟烟雾暴露室示意图。
室内空气泵（泵 B）以 2 L/min 的流速持续将通风橱外的室内空气通入暴露室。泵 A 以 2 L/min 的流速对点燃的香烟抽吸 40 秒，20 秒后，计算机风扇在 3 分钟内将暴露室内的气体排空。烟雾与室内空气在进入暴露室前进行混合。气体监测仪持续测量暴露室内一氧化碳（CO）和氧气（O2）的浓度。烟雾通过排气口排入通风橱。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 微控制器组装与软件

  1. 通过独立的微控制器分别控制电子烟雾室和香烟烟雾室的泵送系统。下载微控制器软件，并上传补充材料中提供的操作代码。电子烟雾代码将使室内空气泵持续运行，并每30秒启动一次电子烟泵，持续4秒。香烟烟雾代码将使室内空气泵持续运行，启动香烟泵40秒，并在香烟泵停止后20秒启动计算机风扇。风扇运行3分钟后自动关闭。
    注意：可根据需要调整泵和风扇的运行时序。请参考制造商说明，了解如何将相应代码上传至微控制器。
  2. 组装微控制器时，按照图3所示，将扎线、二极管、电阻和电容连接到面包板上，并将鳄鱼夹导线连接至相应的空气泵（香烟烟雾室还需连接计算机风扇）。如有可能，将微控制器置于通风橱外部。

基于 Arduino 的静态平衡示意图，包含电路组件；室内空气和电子烟泵装置。
图 3. 微控制器示意图。
微控制器与面包板的连接示意图，用于控制气泵和风扇的工作时序。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 动物

  1. 使用体重为 450 - 520 g 的成年大鼠。
  2. 根据暴露类型对大鼠进行分组（例如，电子烟、香烟烟雾、泵入暴露室的室内空气）。
  3. 在暴露前，使用注射器从尾静脉采集 500 µL 血液至 EDTA 涂层试管中，用于测定基线血清可替宁浓度。
  4. 在 4 ˚C 条件下，以 20,000 x g 离心 30 分钟，分离血样并收集血清。确保整个操作过程中样品始终置于冰上冷却。
  5. 按照试剂盒说明书检测所采集血清样品中的可替宁含量。样品也可储存于 -80 ˚C 以备后续使用。

5. 电子烟舱的操作

  1. 用70%乙醇清洁腔室内部，然后用去离子水清洁，静置风干直至腔室完全干燥（或约30分钟）。
  2. 校准气体监测仪，并将整个监测仪安装在腔室内的墙壁上。
  3. 将大鼠放入染毒室中。注意可同时暴露最多三只动物。
  4. 确保电子烟电量充足且烟油充足，将电子烟插入进样管中。在90分钟暴露期间，必须确保电子烟电池电量和烟油量始终充足。
  5. 打开空气泵，同时启动计时器。
  6. 暴露期间观察气体监测仪，以确保腔室内含有 >20% O2 和 0 ppm CO。
    注意：如果氧浓度下降，可能是由于舱体通风不良或氧浓度监测仪未正确校准所致。
  7. 当暴露时间达到90分钟时，移除电子烟并继续运行气体泵以排出残留蒸汽。此外，可抬起暴露室顶部以加快通风。
  8. 待蒸气散尽后，取出大鼠并清洁舱室。
  9. 收集 500 µL 实验方案结束时，暴露后约1小时，从每只大鼠尾静脉采集血液。
  10. 按照步骤 4.4 - 4.5 分离血清并检测可替宁。

6. 烟草香烟暴露舱的操作

  1. 按照步骤 5.1 - 5.3 操作。
  2. 将香烟插入香烟点燃装置中，使香烟末端紧贴加热元件。
  3. 开启香烟点燃装置，直至香烟末端开始阴燃（约 5 秒）。
  4. 香烟点燃后，启动泵吸系统，开始计时，并观察香烟完全燃烧的过程（约 40 秒）。
  5. 香烟燃尽后，用镊子小心地从香烟点燃装置中取出用过的香烟。
  6. 确保 CO 浓度不超过 1000 ppm，O2 浓度不低于 20%。计算机风扇的启停时序和持续时间对于防止一氧化碳积聚至关重要。
  7. 4 分钟后关闭泵吸系统，然后返回步骤 6.2，重复操作，直至大鼠暴露于烟草烟雾达 90 分钟（或约 23 支香烟）。
    注意：香烟燃烧后 4 分钟，一氧化碳浓度应降至 400 ppm 以下，否则可能导致一氧化碳在暴露舱内积聚。
  8. 暴露结束后，继续保持泵吸系统运行，以排出残留烟雾。当一氧化碳浓度降至 100 ppm 以下时，将大鼠从暴露舱中取出。此过程通常需要 5 - 10 分钟。
  9. 取出大鼠并清洁暴露舱。
  10. 在实验方案结束、暴露后约 1 小时，从尾静脉采集 500 µL 血液，方法与电子烟处理组相同。
  11. 按照步骤 4.4 - 4.5 操作，分离血清并检测可替宁含量。

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结果

一氧化碳和氧气监测

暴露于电子烟雾期间，氧气浓度未降至20%以下，一氧化碳浓度在整个暴露过程中均未检出。香烟烟雾暴露期间的气体监测显示，氧气浓度保持在20%以上，一氧化碳浓度未超过1,000 ppm。图4).

一氧化碳浓度（ppm）随时间（分钟）变化的曲线图，显示在1分钟时出现峰值。
图4：香烟烟雾室中的一氧化碳浓度 在引入1R6F香烟烟雾的过程中，每30秒记录一次一氧化碳浓度。所示结果为3个连续4分钟循环的平均值。一氧化碳浓度未超过1,000 ppm。香烟在...

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讨论

本文介绍一种可对啮齿类动物进行受控暴露于电子烟雾和香烟烟雾的暴露舱构建方法（图6）。与商用暴露系统相比，电子烟暴露舱的构建相对简单且成本较低14,15,16。构建暴露舱所需的零部件和工具均可通过网络从商业供应商处轻松获取。类似地，香烟烟雾暴露舱的构建也相对简便，唯一需要自行加工的是香烟点火装置（参见 补充材料 中的设计图纸）。

一旦构建好暴露舱，暴露系统的一个关键步骤是校准暴露舱，使啮齿类动物暴露于所需剂量的尼古丁。在电子烟暴露舱和香烟暴露舱中，调节总暴露时间可能是增加或减少尼古丁暴露量的最简便方法。延长电子烟暴露系统中的抽吸时间...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得益于伊莱森博士获得的主动脉研究基金（密歇根大学）。作者还感谢密歇根大学校园运营标识与图形部门的Nick Scott在香烟点火装置的设计与组装过程中提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
blu PLUS 可充电套装blu eCigsN/A
1R6F 参考香烟英国烟草制品研究中心 N/A
Lexan 麻醉室 20 LJorgensen 实验室JOR265
Arduino UNOArduino2877
二极管整流器 - 1 A；50 VSpark FunCOM-08589
10 KOhm 1/6 W 插孔电阻 - 20 个装Spark FunCOM-11508
电解去耦电容 - 100 µF/25 VSpark FunCOM-00096
无焊插接面包板 BusBoard 原型系统公司BB400
鳄鱼夹导线BusBoard 原型系统公司CA-M-20
ZipWireBusBoard 原型系统公司ZW-MM-10
标准风扇 80 ST2酷冷至尊（Cooler Master）R4-S8R-20AK-GP
ARIC 4" 可调通风口BestlouverN/A
ToxiPro  一氧化碳（CO）监测仪霍尼韦尔分析仪器公司（Honeywell Analytics）54-00-10316
ToxiPro 氧气（O2）监测仪霍尼韦尔分析仪器公司（Honeywell Analytics）54-45-90-VD
ToxiPro IQ Express 通讯底座霍尼韦尔/斯佩里安生物系统公司（Honeywell/Sperian Biosystems ）54-46-9100
Command 小型金属线墙钩 6 个装3MN/A
微型水/气泵厦门康劲电子有限公司（Xiamen Conjoin Electronics）CJWP40-A12A1
1/4" 硅胶管NewAge2801470-100
T 型接头Bel-Art SciencewareF196060000
含喷雾涂层 K2EDTA 的塑料全血采血管贝克顿·迪金森公司（Becton, Dickinson and Company）367841
可替宁 ELISA 试剂盒CalbiotechCO096D

参考文献

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