本研究介绍了应用高强度聚焦超声阻断糖尿病神经病变神经动作电位的方法学。
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摘要
摘要
使用高强度聚焦超声（HIFU）换能器对正常及糖尿病动物模型进行神经传导阻滞的研究 recently 已有开展。在采用适当超声参数的条件下，HIFU 可在不损伤神经组织的前提下可逆地阻断外周神经的传导。神经动作电位的暂时性和部分性阻滞表明，HIFU 具有作为临床镇痛治疗手段的应用潜力。本研究展示了在糖尿病大鼠模型中抑制神经病理性神经动作电位的实验操作流程 体内 使用HIFU换能器。第一步是通过注射链脲佐菌素（STZ）建立成年雄性糖尿病神经病变大鼠模型。第二步是利用电子von Frey探针和热板仪评估STZ诱导的糖尿病大鼠的周围神经病变。最后一步是记录 体内 神经在经受HIFU照射时的细胞外动作电位。此处展示的方法可能有助于超声镇痛应用的研究。
引言
口服药物，针灸1，以及电刺激神经2 已用于治疗疼痛性糖尿病多发性神经病变。然而，口服药物的副作用、针灸的侵入性操作以及电刺激神经等方法限制了治疗效果及患者的依从性。在动物模型中，超声阻断外周神经的研究已持续数十年。3,4,5传导的 体外 大型绿蛙的坐骨神经在经受0.4 - 1.0秒、10 - 20次超声脉冲照射后，其功能可逆性地受到抑制6阻断神经传导的因素之一是超声引起的温度升高7对于患有多发性神经病的患者，在腓神经接受低强度超声照射2分钟后，进行了复合肌肉动作电位（CMAPs）的抑制。8完全恢复时间在5分钟内。
近期，美国食品药品监督管理局批准高强度聚焦超声（HIFU）作为子宫肌瘤肿瘤的非侵入性治疗手段9骨转移的疼痛缓解10以及前列腺癌11高强度聚焦超声（HIFU）换能器在体外发射声束，声束在不同组织介质中传播并汇聚于靶区肿瘤的焦点处。焦点区域随即形成，可在不损伤周围组织的情况下对靶向肿瘤产生局部效应。HIFU 还已被应用于抑制神经传导或导致神经去神经化 体内 正常Sprague-Dawley（SD）大鼠实验12此外，还研究了高强度聚焦超声（HIFU）对神经病理性神经的短期和长期作用13先前的研究结果表明，通过采用适当的参数，高强度聚焦超声（HIFU）可实现感觉神经传导的可逆性或永久性阻滞。除了镇痛应用外，HIFU还可作为研究工具，用于探究外周与中枢成分在神经传导阻滞中的相对作用，服务于神经科学基础研究及镇痛药物的开发。因此，有必要建立一种针对动物模型中外周神经的HIFU阻滞技术平台。本文旨在展示利用HIFU对糖尿病神经病变大鼠的外周神经动作电位进行部分或完全阻滞的操作流程。文中建立了糖尿病大鼠模型及外周神经病变症状的评估方法，并介绍了专用于大鼠坐骨神经治疗的HIFU平台及其实验操作流程。
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方案
中国台湾国家卫生研究院机构动物照护及使用委员会批准了所有动物实验方案。
1. 在雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠中诱导糖尿病模型
- 在STZ诱导前6小时，从笼中移除大鼠饲料颗粒，使雄性SD大鼠（300 - 350 g）禁食。
- 配制柠檬酸钠缓冲液（0.1 M，pH 4.5）。
- 将1.05 g一水柠檬酸（C6H8O7 · H2O；分子量210.14）溶于50 mL蒸馏水中，配制成0.1 M柠檬酸溶液。
- 将1.47 g二水合柠檬酸三钠（C8H5O7Na3 · 2H2O；分子量294.12）溶于50 mL蒸馏水中，配制成0.1 M柠檬酸钠溶液。
- 将25 mL柠檬酸溶液加入25 mL柠檬酸钠溶液中。使用pH计监测柠檬酸钠缓冲液的pH值（pH 4.5）。
注意：通过加入适量的0.1 M柠檬酸钠溶液使缓冲液达到等渗。
- 将STZ溶于0.1 M柠檬酸钠缓冲液中，配制成50 mg/mL的STZ溶液。
注意：STZ溶液对光敏感，因此需用铝箔包裹避光，并在15 - 20分钟内使用完毕。 - 用1 mL胰岛素注射器或结核菌素注射器（带26至28号针头）吸取50 mg/kg剂量的STZ溶液。 用乙醇棉片清洁注射部位，将STZ溶液经腹腔注射至腹部右下象限，以避免损伤腹腔器官。
- STZ注射后48小时内，为大鼠提供10%蔗糖水作为唯一水源，以预防低血糖。
2. 链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病的确认
- 使用血糖仪检测所有注射STZ后72小时大鼠的空腹血浆葡萄糖浓度。
- 在测定空腹血糖水平前，对STZ诱导的糖尿病大鼠进行15小时的禁食处理。
- 将大鼠置于固定袋中固定，并露出尾巴以便在血糖检测期间采集血液。
- 使用采血针刺破尾尖以获取少量血液。将血滴滴加到血糖试纸上，记录空腹血浆葡萄糖水平。
注意：血糖仪检测并显示单位为mg/dL的血糖浓度。在STZ诱导两周后，空腹血糖水平低于150 mg/dL的大鼠应予以剔除。
3. 糖尿病大鼠外周糖尿病神经病变的评估
- 使用电子 von Frey 仪评估机械性异常性疼痛。
- 在评估后肢足爪回缩反应前，将链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠置于底部为直径 1 cm 金属网的笼子中适应 30 分钟。
- 使用带有刚性尖端（直径 0.8 mm）的电子 von Frey 探针，手动对大鼠后肢足底施加压力，并逐渐增加压力，直至观察到足爪回缩反应。
- 记录仪器显示的压力值，每只大鼠重复测量 5 次，每次测量间隔 30 秒。
- 使用热板法评估热痛觉过敏。
- 在评估疼痛反应前，将链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠置于热板（24 ± 0.5 °C）上适应 10 分钟。
- 适应结束后将大鼠移出并放回笼中，随后加热热板，并将温度维持在 55 ± 0.5 °C。
- 将大鼠放置于加热后的热板上，同时启动计时器。
- 当大鼠出现明显行为反应，如舔舐后肢足爪或异常甩动后肢足爪时，停止计时并记录回缩潜伏期。
注意：若大鼠在 20 秒后仍未出现明显行为反应（20 秒为截止时间），则终止热板实验并将大鼠从热板上移开。
4. 在体 内 使用HIFU换能器实现神经传导阻滞
注意： 体内 实验在注射50 mg/kg STZ后的第5周开始。
- 在使用HIFU声照射阻断CMAPs之前，先进行动物实验操作。
- 手术前将手术器械（手术刀、剪刀、镊子和玻璃钩）在高压灭菌器中灭菌。
- 使用氯胺酮/唑拉西泮混合物（40 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，或 通过 通过异氟烷蒸发器吸入1.75%异氟烷。将大鼠置于加热垫上以维持体温。
- 将大鼠置于俯卧位进行手术。涂抹眼膏。伸展大鼠后肢，用指甲轻捏足底皮肤以评估麻醉深度。若大鼠出现回缩反应，需追加麻醉。
- 使用电动剃毛器去除大鼠大腿和下背部的毛发。用干净的纱布蘸取液碘，在手术部位涂抹，并以圆形方式从手术中心向外周擦拭。使用酒精棉片以相同的圆形方式擦去液碘。本实验在左侧和右侧手术部位进行。进行下一步操作时，需在另一手术部位重复上述步骤。
- 使用无菌手术剪或手术刀在大腿背侧皮肤做切口。用钝头手术剪仔细分离皮肤下方的组织，并用皮肤拉钩固定皮肤。 股骨可见于肌肉内。
- 使用剪刀小心地沿股骨方向分离肌肉，直至暴露出埋于肌肉中的大腿中部坐骨神经纤维。用玻璃钩小心地将大腿中部的坐骨神经与周围结缔组织和肌肉分离。
- 使用定制的神经固定器将坐骨神经置于HIFU焦点区域图1 和 图3).
注意：定制的神经固定器由3个部件组成（图3）。所有组件均由透明聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成。组件I顶部结构的外螺纹高度为2.5 mm，规格为M10XP0.7（图 4A）。中心孔是一个贯穿组件I的直径为4.0 mm的孔。孔的底部开口由一片胶带密封。槽的直径为1.2 mm，槽的中心平面与组件I顶面之间的距离为3.1 mm。组件II由主体、四条支腿和底部结构组成（图4B）。底部结构的内螺纹高度为2.5 mm，规格为M10XP0.7，用于与部件I的外螺纹配合。中心孔的直径与部件I的中心孔相同。主体部分直径为32 mm，厚度为5.4 mm。四个支脚呈对称分布，其中两个相同的短支脚用于对准定位，两个相同的长支脚用于钩挂部件III。部件III的外径和高度分别为41 mm和9.2 mm。其内螺纹规格为M36XP1.0，通孔直径为27.5 mm（图4C）。锥形漏斗为中空锥体，顶部开口直径为84 mm，底部开口直径为27.5 mm，高度为57.5 mm（图 5A).- 实验前，将定制的丙烯酸神经固定器浸泡于漂白液中30 - 60分钟，随后浸泡于无菌水中。
- 用玻璃钩小心提起神经，将其放入组件 I 的槽中。
- 将组件II旋入组件I。在组件I的中央孔中加入任氏液，用于超声传播及神经组织保存。
- 将部件III旋入HIFU外壳锥形部分。通过部件II的四条支腿将部件III与部件II对接。
注意：三个组件的几何中心与换能器对齐。神经与换能器之间的距离等于焦距，以确保神经位于高强度聚焦超声（HIFU）的焦点区域内。
- 将一对针灸针插入坐骨神经起点处，另一对针灸针插入腓肠肌。通过电同轴电缆将每对针灸针连接至电生理记录系统图1).
注意：电缆一端有两个鳄鱼夹，用于分别夹住两根针，另一端为BNC连接器，用于连接系统。成对的针灸针作为刺激电极作用于坐骨神经，并作为记录电极作用于腓肠肌。- 将电生理记录系统的采样率和带宽分别设置为 50 kHz 和 70 Hz–3 kHz。在坐骨神经起始处的刺激电极上施加脉宽为 0.1 ms 的超最大刺激。
- 从记录电极记录复合肌肉动作电位（CMAPs），并使用电生理采集系统内置放大器放大CMAPs。
注意：使用电生理记录系统内置的放大器来放大神经信号，并通过电生理记录系统记录来自记录电极的复合肌肉动作电位（CMAPs）。
- 使用商用2.68 MHz HIFU换能器抑制糖尿病神经病变大鼠的复合肌肉动作电位（CMAPs）。
注意：换能器的规格描述如下：单元素球形碗，孔径直径为6 cm，焦距为5 cm，在自由场中形成椭球形焦区，深度为4 mm，宽度为0.8 mm。- 将球形锥体、HIFU换能器和锥体盖浸入装有脱气水的水槽中。将HIFU换能器放入球形锥体内，并通过6个螺钉将锥体盖固定在球形锥体的顶部开口处图5B）。由于气泡密度低于水，可待球形锥体内的气泡自然排出后，用厚度为0.03 mm的透明胶带密封锥体前端开口。将组件III旋紧至球形锥体上。
- 从脱气水箱中取出带有球形圆锥和组件III的HIFU换能器。
注意：本研究中使用的反渗透水是通过反渗透工艺纯化的水。将反渗透水煮沸以去除气体，冷却后在独立的密闭容器中获得脱气水。
- 将组件 I 小心放入神经与肌肉之间的空隙中，并将神经置于组件 I 的间隙内。执行步骤 4.2.3 和 4.2.4，以确保神经位于 HIFU 的焦点区域内图3A).
- 连接函数发生器与射频功率放大器。将功率放大器连接至HIFU换能器，以产生HIFU声束。手动设置函数发生器输出至HIFU换能器的电压。 通过 功率放大器。HIFU照射时间结束后，手动关闭函数发生器。使用计时器观察时间。
注意：本研究中使用的HIFU束的强度和能量为2,810 W/cm²2 和 84 J/mm2分别。 - 同时通过电生理记录系统（步骤4.3）施加刺激，并通过HIFU系统（步骤4.6）将HIFU声束作用于坐骨神经，同时记录复合肌肉动作电位（CMAPs）。逐步增加HIFU对坐骨神经的照射时间，从3 s、5 s增至8 s，直至观察到CMAPs波幅下降或受到抑制。
- 以每秒一次的频率记录复合肌肉动作电位（CMAPs），直至高强度聚焦超声（HIFU）束照射结束。观察到CMAPs波幅变化后，关闭HIFU系统，并手动点击电生理采集软件中的记录图标，分别在最初的10分钟内每2分钟记录一次CMAPs，随后的30分钟内每5分钟记录一次，最后阶段每10分钟记录一次，直至总记录时间达到2小时。
- 分离神经固定器的组件 II 和 III图3) 将HIFU换能器从切口处移除。分离组件II和组件I，以释放固定的坐骨神经。记录CMAPs后，使用4-0铬制肠线缝合糖尿病大鼠的手术部位。在手术部位涂抹液态碘以预防感染。
- 将笼子放在加热垫上，让大鼠在返回动物房之前于笼中恢复。给予大鼠饮用水中添加布洛芬，持续3天，或腹腔注射布伦诺啡（0.05 - 0.1 mg/kg）。
- 在首次HIFU超声处理后的第7、14和28天，按照步骤4.1.2和4.3所述，将刺激电极和记录电极插入麻醉的糖尿病神经病变大鼠的坐骨神经起始部和腓肠肌中。重复步骤4.3.1至4.3.2。
- 将笼子放在加热垫上，让大鼠在笼中恢复后，再将笼子移至动物饲养设施。
- 实验结束后对大鼠实施安乐死。将大鼠放入二氧化碳安乐死舱内，等待约5分钟，直至大鼠停止呼吸。确认心脏已停止搏动。
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结果
的 体内 研究结果表明，在2,810 W/cm²的强度下进行3秒的HIFU照射，可实现预期效应2，CMAPs 被抑制至基线水平的 20%，但在 30 分钟后完全恢复（图2A，钻石）在28天期间几乎保持恒定（图2B，金刚石）。在相同强度下进行5秒HIFU暴露后，CMAPs在4分钟时降至基线的65.4%（9.5%），并在120分钟时恢复至基线的73.7%（12.6%）图 2A，方格）。CMAPs 直到第 14 天才恢复至基线水平（图2B，方格）。当在相同强度下将HIFU照射时间延长至8秒时，4分钟时的CMAPs降至基线的26.0%（14.1%）图 2A，三角形），但在120分钟时增加至基线的38.0%（12.0%），并在第28天逐渐增加至基线...
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讨论
糖尿病大鼠神经病理性神经动作电位的部分和暂时性抑制 体内 在HIFU治疗后立即观察到阻滞效应的发生。对CMAPs进行的28天随访研究表明，在适当的HIFU暴露条件下，可实现神经传导的安全性阻断。因此，上述HIFU治疗方案可为糖尿病大鼠坐骨神经的可逆性传导阻滞提供一种替代解决方案。
在该方法中，不存在神经变性，且在轻度神经损伤情况下，感觉神经可在数小时至数天内完全恢复14。对于重度损伤，感觉功能的恢复过程通常需要数月时间，甚至可能无法恢复。此外，当神经纤维受到挤压损伤后，若神经内膜管和施万细胞基底膜保持完整，则周围神经纤维的再生更为完全15。因此，我们推断高强度聚焦超声（HIFU）在此情况下导致的是轻度且可逆的神经损伤，因为HIFU治疗后被抑制的复合肌肉动作电位（CMAPs）随时间逐渐恢复至基线水平。而对于重度神经损伤，即使在28天后，CMAPs也仅能部分恢复。
本研究的技术为在临床研究之前开展高强度聚焦超声（HIF...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由科学技术部（项目编号 MOST 105-2221-E-400 -001）和国家卫生研究院（项目编号 BN-105-PP-10）资助，中国台湾。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 链脲佐菌素 | Sigma | 85882 | |
| 一水柠檬酸 | Sigma | C1909 | |
| 二水合柠檬酸三钠 | Sigma | W302600 | |
| 血糖仪 | Roche Accu-Check Active | GC | |
| 电子 von Frey 装置 | IITC Life Science | 2390 | |
| 热板仪 | IITC Life Science | ||
| Biopac MP36 数据采集系统 | Biopac Systems, Inc. | ||
| HIFU 换能器 | Sonic Concepts | H108 | |
| 函数发生器 | Agilent | 33250A | |
| 功率放大器 | Electronics & Innovation | 1040L | |
| 大鼠 | Biolasco 中国台湾 | Sprague-Dawley | |
| Puralube vet 软膏 | Dechra | ||
| 异氟烷蒸发器 | Parkland Scientific | V3000PS | |
| 异氟烷 | Attane | ||
| 固定袋（Decapicones） | Braintree Scientific | DC 200 |
参考文献
- Abuaisha, B. B., Costanzi, J. B., Boulton, A. J. Acupuncture for the treatment of chronic painful peripheral diabetic neuropathy: A long-term study. Diabetes Res Clin Pract. 39 (2), 115-121 (1998).
- Hamza, M. A., et al. Percutaneous electrical nerve stimulation: A novel analgesic therapy for diabetic neuropathic pain. Diabetes Care. 23 (3), 365-370 (2000).
- Ballantine, H. T. Jr, Bell, E., Manlapaz, J. Progress and problems in the neurologic applications of focused ultrasound. J Neurosurg. 17, 858-876 (1960).
- Foley, J. L., Little, J. W., Vaezy, S. Image-guided high-intensity focused ultrasound for conduction block of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 35 (1), 109-119 (2007).
- Lee, Y. F., Lin, C. C., Cheng, J. S., Chen, G. S. High-intensity focused ultrasound attenuates neural responses of sciatic nerves isolated from normal or neuropathic rats. Ultrasound Med Biol. 41 (1), 132-142 (2015).
- Young, R. R., Henneman, E. Reversible block of nerve conduction by ultrasound. Arch Neurol. 4, 83-89 (1961).
- Lele, P. P. Effects of focused ultrasonic radiation on peripheral nerve, with observations on local heating. Exp Neurol. 8 (1), 47-83 (1963).
- Hong, C. Z. Reversible nerve conduction block in patients with poly- neuropathy after ultrasound thermotherapy at therapeutic dosage. Arch Phys Med Rehabil. 72 (2), 132-137 (1991).
- Okada, A., Morita, Y., Fukunishi, H., Takeichi, K., Murakami, T. Non-invasive magnetic resonance-guided focused ultrasound treatment of uterine fibroids in a large Japanese population: impact of the learning curve on patient outcome. Ultrasound Obstet Gynecol. 34 (5), 579-583 (2009).
- Huisman, M., et al. International consensus on use of focused ultrasound for painful bone metastases: current status and future directions. Int J Hyperthermia. 31 (3), 251-259 (2015).
- Dickinson, L., et al. Medium-term Outcomes after Whole-gland High-intensity Focused Ultrasound for the Treatment of Nonmetastatic Prostate Cancer from a Multicentre Registry Cohort. Eur Urol. 70 (4), 668-674 (2016).
- Foley, J. L., Little, J. W., Vaezy, S. Effects of high-intensity focused ultrasound on nerve conduction. Muscle Nerve. 37 (2), 241-250 (2008).
- Lee, Y. F., Lin, C. C., Cheng, J. S., Chen, G. S. Nerve conduction block in diabetic rats using high-intensity focused ultrasound for analgesic applications. Br J Anaesth. 114 (5), 840-846 (2015).
- Donoff, R. B. Nerve regeneration: basic and applied aspects. Crit Rev Oral Biol Med. 6 (1), 18-24 (1995).
- Fawcett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral nerve regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Nightingale, S. The neuropathic pain market. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 101-102 (2012).
- Lipton, R. B., et al. Single-pulse transcranial magnetic stimulation for acute treatment of migraine with aura: a randomised, double-blind, parallel-group, sham-controlled trial. Lancet Neurol. 9 (4), 373-380 (2010).
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