本方案描述了一种通过定量分析NLS-NES-GFP蛋白核输入的实时变化，来灵敏检测运动神经元样NSC-34细胞内核质运输速率的方法。
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摘要
摘要
核质运输是指大分子物质在细胞核与细胞质之间的进出过程。近年来，多项研究表明肌萎缩侧索硬化症（ALS）与核质运输通路的功能障碍之间存在关联。ALS 是一种影响运动神经元的神经退行性疾病，导致患者瘫痪，并通常在发病后平均2至5年内死亡。大多数 ALS 病例为散发性，无明显遗传联系，但约有10%的病例以常染色体显性方式遗传。近期研究发现，9号染色体开放阅读框72（C9orf72）基因中的六核苷酸重复扩增（HREs）是导致 ALS 及额颞叶痴呆（FTD）的遗传因素。重要的是，多个研究团队近期提出，这些突变体会影响核质运输。然而，这些研究主要揭示了 HREs 对核质运输所造成的最终结果和表型表现，却未能实时展示核转运功能障碍的过程。因此，目前仅能确定严重的核质运输缺陷，且多数情况依赖于外源蛋白的高表达或人为插入。
本方案描述了一种新型且极为灵敏的实时评估与定量核质转运功能障碍的检测方法。通过荧光显微镜，可实时定量含有核定位信号与核输出信号的GFP融合蛋白（穿梭GFP）进入细胞核的速率。该方法通过使用输出蛋白抑制剂，使穿梭GFP只能进入细胞核而无法输出，从而实现对入核速率的精确测量。为验证该检测方法的有效性，实验中采用了C9orf72基因六核苷酸重复扩增（HRE）所翻译产生的二肽重复蛋白poly(GR)和poly(PR)，这两种蛋白已被先前研究证实可破坏核质转运。利用本方案所述检测方法，观察到与对照组相比，核输入速率下降了50%。通过该系统，可检测核质转运中的细微变化，并评估不同因素对核质转运缺陷的挽救能力（即使为部分挽救）。
引言
核孔复合体（NPC）控制大分子进入和离开细胞核的输入与输出。与小分子不同，小分子可以不受调控地进入细胞核1，而大分子的转运则受到NPC的严格调控。这些大分子（如蛋白质和RNA）通过与转运因子（包括importin和exportin）结合，实现从细胞核的输入和输出2。为了被输入细胞核，蛋白质必须包含一段短肽序列，通常称为核定位信号（NLS），该序列可被importin识别并结合2。这些氨基酸序列作为分子标签，其组成具有多样性3,4。蛋白质能够从细胞核输出至细胞质，是由于其与exportin结合，而exportin可识别一段信号序列，通常称为核输出信号（NES）2。importin和exportin均依赖小GTP酶Ran（Ras相关核蛋白）的调控来实现其货物的转运2。研究表明，Ran可因结合GTP或GDP而处于不同的构象状态。当结合GTP时，Ran能够与importin或exportin结合。RanGTP与importin结合后，会导致importin释放其携带的货物；而exportin则必须与RanGTP结合，才能与其输出货物形成复合物。Ran主要结合的核苷酸状态取决于其所在位置：在细胞核内为RanGTP，在细胞质中为RanGDP。
最近，多项研究表明，核质运输通路的损伤与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆症（FTD）均有关联5,6,7,8,9,10,11,12。ALS 是一种进行性且致命的神经退行性疾病，影响上、下运动神经元（MNs）13，导致瘫痪，并通常在 2 至 5 年内死亡。大多数 ALS 病例被归类为散发性（SALS），无明显遗传关联，但约有 10% 的病例以常染色体显性方式遗传（家族性 ALS；FALS）。最近研究发现，9 号染色体开放阅读框 72（C9orf72）基因中的六核苷酸重复扩增（HREs）是 ALS 和 FTD 的遗传病因14,15。这些突变占 FALS 病例的 30–40%16，不同研究认为其通过干扰核质运输引发毒性作用5,6,7,8,9,10,11,12。
这些研究大多仅展示了HREs对核质运输的最终结果和表现，但并未实时呈现核质运输障碍的动态过程。因此，目前仅对严重的核质运输缺陷进行了评估11，17，18。
本方案描述了一种新型且极为灵敏的实时评估与定量核质转运功能障碍的检测方法。利用荧光显微镜，可实时定量核定位信号-核输出信号-绿色荧光蛋白（NLS-NES-GFP）融合蛋白（穿梭-GFP）的入核速率。该方法采用一种输出蛋白抑制剂（如先前所述18），从而仅允许穿梭-GFP进入细胞核。通过使用荧光显微镜及具备实时定量荧光变化能力的软件，可定量测定位于细胞核内的穿梭-GFP荧光强度的渐进性变化。由此可绘制出一条类似米氏动力学（Michaelis-Menten）的荧光强度-时间饱和曲线，该曲线表示在任意给定时间点细胞核内穿梭-GFP的含量。通过分析曲线的初始线性阶段，可获得一条斜率，该斜率代表在荧光饱和前穿梭-GFP进入细胞核的速率。
为验证该检测方法，采用了此前已有报道的C9orf72翻译产生的二肽重复蛋白poly(GR)和poly(PR)，这些蛋白已被证实可破坏核质运输5,7,8,10,12。使用该检测方法时，与对照组相比，核输入速率下降了50%。利用该系统，可检测核质运输中的微小变化。此外，还可评估不同因素对核质运输缺陷的挽救能力。
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方案
1. 细胞系制备
- 从液氮容器中取出约 1,000,000 个冻存的小鼠神经母细胞瘤脊髓细胞（NSC-34 细胞），放入 37 °C 水浴孵育器中，直至细胞完全解冻。
- 加入新鲜的预温培养基（含 10% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素抗生素的 DMEM 培养基）。
- 将解冻后的细胞（SL16R）在 500 × g 条件下离心 5 分钟，形成细胞沉淀。弃去上清液，加入 1 mL 新鲜培养基重悬细胞。
- 将重悬的细胞接种至 15 mL 培养瓶中，并额外加入 5 mL 培养基。将细胞置于含 5% CO2 的 37 °C 无菌孵育箱中过夜培养。
- 同时，将 8 个未包被的盖玻片（直径 12 mm，厚度 0.13–0.17 mm）放入 60 mm 培养皿中，使用 70% 乙醇处理并暴露于紫外光下 30 分钟进行灭菌，待其完全干燥。向每个培养皿中加入培养基并更换一次，以去除残留的乙醇。
- 当细胞融合度达到约 90%（每瓶约 600 万个细胞）时，向培养瓶中加入胰蛋白酶缓冲液（2.5 g 胰蛋白酶和 0.2 g EDTA 溶于 1 L 的 Hanks 平衡盐溶液中），使贴壁细胞解离。
注意：NSC-34 细胞较为敏感，仅需胰蛋白酶缓冲液孵育 15 秒，随后在不含胰蛋白酶的条件下继续孵育 1 分钟，再用培养基进行解离操作。 - 将细胞以每皿约 350,000 个的密度接种至已放置盖玻片的 60 mm 培养皿中，每皿加入 3 mL 培养基。将培养皿放入孵育箱中培养 24 小时，使细胞充分贴附于盖玻片表面。
2. 细胞转染
注意：培养约 24 小时后，NSC-34 细胞将达到约 40% 的汇合度（约 800,000 个细胞），可进行转染。
- 在无菌微量离心管中准备纯DMEM培养基（每个60 mm培养皿需300 µL DMEM培养基）。
- 将转染所需的各种质粒各2 µg加入含有DMEM的微量离心管中。
注意：所有细胞转染均必须包含shuttle-GFP质粒。 - 向所有含有所需质粒的微量离心管中加入转染试剂。此处，每2 µg DNA加入4 µL商用转染试剂。
- 涡旋振荡含有DMEM、质粒和转染试剂的微量离心管，并在室温下孵育25分钟。
- 将每根微量离心管中的混合液加入对应的培养皿中，轻轻摇动培养皿以形成均匀溶液。将培养皿放回培养箱中继续培养48小时。
注意：由于shuttle-GFP应在所有细胞中表达，因此可在转染过夜后通过荧光显微镜部分观察并预测试shuttle-GFP的转染效率。对于非荧光表达蛋白的完整检测，可采用免疫印迹分析进行。
3. 显微镜检查
- 将含有转染NSC-34细胞的盖玻片固定至盖玻片架上，并用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤，以去除脱落的死亡细胞。
- 使用倒置显微镜配合绿色荧光滤光片，找到一个合适的细胞区域。
注意：合适的细胞区域是指在显微镜视野中包含大量细胞（每视野20–30个细胞），且细胞核清晰可辨的区域。细胞区域内的细胞核首先通过肉眼识别，并由成像软件手动标记。 - 在显微镜下，将含有10 ng/mL Leptomycin B（LMB）的200 µL输出蛋白1抑制剂LMB缓冲液滴加至盖玻片上。
注意：此时间点定义为时间零点。 - 以3秒为间隔，对已标记的细胞核荧光强度进行约400–500秒的定量检测。
- 在每次独立实验中，对每个转染组测试3至5个盖玻片。
4. 分析
注意：由于不同细胞表达的荧光穿梭蛋白-GFP水平不同，因此需要将每个细胞的核荧光强度归一化为其自身的初始荧光强度。
- 通过将每个细胞核的3秒荧光间隔强度除以该细胞核前六个间隔的平均值，对标记的细胞核荧光强度进行归一化处理。
- 在对每个细胞核进行归一化后，生成荧光强度曲线，以表示每个细胞区域中细胞核荧光随时间的变化。为此，计算每个细胞区域（每个区域包含约20-30个细胞）中所有细胞的平均值。
注意：细胞核荧光强度曲线类似于米氏饱和曲线，在较长的时间段内更易于观察。这是由于随着时间推移，穿梭蛋白-GFP通过核转运进入细胞核，导致胞质中穿梭蛋白-GFP的量逐渐减少，从而统计学上降低了穿梭蛋白-GFP进入细胞核的概率，最终使细胞核荧光达到饱和。从该曲线初始线性阶段的斜率可得出进入细胞核的Vmax速率。 - 利用作图软件分析来自三至五次独立实验的各个细胞区域的Vmax斜率，为每组实验生成一个代表性斜率，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行定量统计分析。
5. 蛋白质表达验证
- 将各实验组未用于上述实验的残留细胞置于冰上，放入60 mm培养皿中。
- 弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次，以稀释并去除残留的培养基。
- 加入200–400 µL裂解缓冲液（含PBS、0.5% Triton和蛋白酶抑制剂混合片剂（PI））处理细胞，并用细胞刮刀刮取细胞。
- 将裂解液中的细胞收集至微量离心管中，在冰上以4,000 rpm使用匀浆器匀浆1分钟。
- 将匀浆后的细胞样品在2,500 × g离心10分钟，收集上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度，并于-20 °C保存备用。
- 根据目标蛋白的不同，取30至70 µg总蛋白，加入SDS-PAGE凝胶中，通过免疫印迹法检测蛋白表达水平。
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结果
使用本文所述方法，将带有核定位信号和核输出信号序列的NLS-NES-GFP（穿梭-GFP）蛋白转染至运动神经元样NSC-34细胞中。该蛋白含有NLS和NES信号序列（图1），可在细胞核与细胞质之间穿梭。在缺乏任何定位信号标签的情况下，普通绿色荧光蛋白（GFP）仅能通过扩散方式进出细胞核，因此在细胞核与细胞质之间分布均匀（图2A）。相比之下，由于存在NES和NLS信号，穿梭蛋白-GFP主要分布在细胞质中s 影响其分散性（图2B）。因此，只有加入输出蛋白抑制剂莱普托霉素B（LMB）——其可抑制蛋白质输出——才能使穿梭型GFP在细胞核内积累，进而实现对穿梭型GFP入核速率的测定（图 2C）。利用荧光显微镜及软件对荧光变化进行实时定量，可量化穿梭型GFP核内荧光强度的逐渐变化。由此可获得荧光强度随时间变化的类似米氏饱和曲线图3)，可表示任意时刻的核穿梭-GFP 量。通过使用曲线的...
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讨论
本方案展示了一种高灵敏度、可定量的新检测方法，用于评估核质运输中的微小变化。利用该系统，不仅能够实时观察和测量导致蛋白质分布发生显著改变的重大缺陷，还能检测核质运输及其功能障碍的细微变化。该检测方法不仅具有更高的灵敏度优势，而且所需样品制备少、成本低廉，是一种操作简便且耗时较少的检测方法。
为了检测该系统的效率，采用了C9orf72蛋白、poly(GR)和poly(PR)二肽重复蛋白（DPRs）以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTD）的模型，这些模型此前已被证明可导致核质转运功能障碍5,7,8,10,12。利用该检测方法，可实时观察到表达DPRs的细胞其核输入速率较转染对照载体的细胞下降约50%。因此，该系统为便捷检测由ALS或FTD突变体或其他潜...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢人工智能实验室所有成员提出的宝贵意见和建议。我们感谢马克斯·普朗克生物化学研究所的Mark Hipp教授为我们提供了穿梭-GFP载体。本研究得到了以色列科学基金会（ISF #124/14）、以色列与美国双边科学基金会（BSF #2013325）、欧盟第七框架计划玛丽·居里职业整合资助（CIG #333794）以及以色列国家心理生物学研究所（NIPI #b133-14/15）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠运动神经元样杂交细胞系 (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A | |
| DMEM 4.5 g/L L-葡萄糖 | Biological Industries | 01-055-1A | |
| FBS 欧洲级 | Biological Industries | 04-007-1A | |
| SL 16R 离心机 | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Thermo Forma Series ii 水套式 CO2 培养箱 | Thermo Scientific | 3111 | |
| 盖玻片，直径 12 mm，厚度 0.13–0.17 mm | Bar Naor LTD | ||
| TurboFect 转染试剂 | Thermo Scientific | R0531 | |
| Axiovert 100 倒置显微镜 | Zeiss | ||
| Imaging Workbench 2 | Axon Instruments | ||
| Leptomycin B | Sigma | L2913 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| 匀浆器电机/控制器/卡盘/90度夹具 | Glas-Col | 099C K5424CE | |
| MicroCL 17R 冷冻离心机 | Thermo Scientific | 75002455 |
参考文献
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