由于啮齿类疟原虫在生命周期和生物学特性上与人类疟原虫具有显著相似性，啮齿类疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的工具。本文中，我们对野生型和转基因啮齿类疟原虫进行表型分析时所使用的一些最重要技术进行了标准化。
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摘要
摘要
近年来，遗传学和系统生物学技术的进步加深了我们在分子水平上对疟原虫生物学的理解。然而，可用于疫苗和化学治疗开发的有效疟原虫靶点仍然有限。这主要归因于缺乏相关且实用的 体内 人类感染模型 疟原虫 物种，尤其是对于 P. 恶性疟原虫 和 P. vivax因此，啮齿类疟原虫种类被广泛用作疟疾疫苗、药物靶向、免疫反应以及保守基因功能表征研究中实用的替代体内模型 疟原虫属 基因。事实上，啮齿类动物疟疾模型已被证明具有不可估量的价值，尤其在研究蚊媒传播和肝期生物学方面，对免疫学研究也至关重要。然而，在评估转基因与野生型无性期及有性期血液阶段寄生虫表型的方法上仍存在差异。 这些差异的实例包括静脉注射的选择 与 啮齿类动物腹腔感染红内期寄生虫及雄性配子出丝现象的评估。本文详细阐述了用于评估表达报告基因或野生型啮齿类疟原虫物种的无性与有性红内期表型的标准化实验方法。同时，我们也详细描述了在蚊体内评估疟原虫各蚊期阶段（配子、动合子、卵囊和子孢子）表型的方法。 按蚊属 蚊媒。本文针对致死性和非致死性菌株，对这些方法进行了详细说明和简化。 P. berghei 和 P. yoelii 但经过一些调整后也可应用于 P. chabaudi 和 P. vinckei 啮齿类疟原虫物种
引言
疟原虫在全球范围内导致数亿人感染疟疾，每年造成超过60万人死亡1。人类感染由五种疟原虫引起，即 P. falciparum，P. vivax，P. ovale，P. malariae，和 P. knowlesi. 大多数临床疟疾病例死亡由 P. falciparum 在撒哈拉以南非洲1. 另一种在撒哈拉以南非洲以外地区引起广泛全球发病率的人类疟原虫物种是 P. vivax2. 其余三个物种的地理分布均较为局限，通常引起良性疟疾感染，但致命的除外 P. knowlesi3相关且实用的非人感染体内模型的缺乏一直是也是疟疾疫苗和药物研发的障碍。早期的疟疾药物靶向和代谢研究在很大程度上依赖于禽类疟疾模型，例如 P. gallinaceum 和 P. lophurae分别感染鸡和鸭4此后，啮齿类疟原虫种类逐渐被引入多种疫苗和药物靶向研究中，作为体内模型使用。多年来，关于啮齿类疟原虫模型在生活史各阶段的生物学特性及宿主-寄生虫相互作用与人类疟原虫相似的证据不断积累。
特别是，啮齿类动物疟疾模型对于探索和表征蚊....
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方案
本文所述所有动物实验均按照杜兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及贝兹米亚勒姆·瓦基夫大学动物伦理委员会批准的方案进行。所有其他实验方案以及重组DNA的使用均按照杜兰大学机构生物安全委员会（IBC）批准的方案进行。
1. 用于寄生虫血症分析和蚊虫感染实验的小鼠红内期寄生虫感染
- 第 -3 天：可选向受体小鼠注射苯肼
- 经腹腔注射（IP）将100注入异品系SW或CD1受体小鼠（用于蚊虫感染及蚊虫感染检测的小鼠） µ5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中含50 mg苯肼的苯肼溶液，使用26 G针头注射器。
注意： 为了获得稳定的蚊虫感染 P. berghei 以及 P. yoelii，使用苯肼诱导受体小鼠产生网织红细胞增多症，可提高寄生虫血症水平，进而增加配子细胞的比例，并显著增强雄性配子的出丝现象（图5），这将有助于提高两种疟原虫在蚊媒阶段的感染效果 P. berghei 和 P. yoelii 品系15,16,17<....
- 经腹腔注射（IP）将100注入异品系SW或CD1受体小鼠（用于蚊虫感染及蚊虫感染检测的小鼠） µ5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中含50 mg苯肼的苯肼溶液，使用26 G针头注射器。
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结果
将反向遗传学工具和技术成功应用于疟原虫，彻底改变了疟疾研究领域，使其能够添加、删除或修饰多种疟原虫的特定基因组片段 疟原虫 物种39重要的是，已鉴定出可缺失的基因组位点，并通过双同源重组技术成功用于在啮齿类和人类疟原虫中引入荧光蛋白标记，以确保在所有生活周期阶段中的稳定表达40,41,42一种此类野生型样转基因寄生虫的实例是 Py230p(-) 寄生虫，由本实验室构建，其血液阶段和蚊媒生命周期阶段的发育均未表现出明显缺陷15,16,17这些转基因报告子寄生虫在强且组成型启动子的调控下表达 eGFP， PyHSP7.......
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讨论
尽管小鼠疟疾模型的生活周期总体生物学特性与人类疟疾寄生虫相似，但其与人类Plasmodium物种之间仍存在诸多差异，这些差异限制了其作为可靠的in vivo模型的应用。例如，除减毒活疫苗外，所有基于亚单位疫苗、DNA疫苗及其他类型疫苗的研究在小鼠模型中均取得了良好效果，但在疟疾流行地区的人群中，这些疫苗的效果却远未达到令人满意的程度。
另一个问题是，不同小鼠品系之间，甚至同一小鼠品系来自不同供应商时，其生活周期阶段的感染性存在差异。此外，目前广泛用作首选的两种主要啮齿类疟原虫物种 体内 疟疾模型， P. berghei 和 P. yoelii，不表现出同步的红细胞期周期，这与任何人疟原虫完全不同。然而，使用小鼠疟原虫作为研究模型具有以下优势： 体内 模型的优势远远超过这些差异，而这些差异也可通过更深入地分析这些局限性的分子驱动因素加以克服。然而，这些局限性主要体现在啮齿类疟原虫的红内期寄生虫中，而在疟原虫的其他生活周期阶段中则不甚明显。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Ahmed Aly 获得了土耳其发展部资助贝兹米亚勒姆瓦基夫大学的项目（项目编号：2015BSV036）、杜兰大学公共卫生与热带医学学院提供的资金，以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所（NIH-NIAID）R21 项目（项目编号：1R21AI111058-01A1）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肝素 | Sigma | 375095-100KU | |
| 黄尿酸 | Sigma | D120804-5G | |
| 次黄嘌呤 | Sigma | H9377-25G | |
| 阿尔塞弗溶液 | Sigma | A3551-500ML | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761-500G | |
| 苯肼 | Sigma | P26252-5G | |
| 甘油 | Sigma | G5516-500ML | |
| 吉姆萨染液 | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 精密滑动针 | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL 结核菌素注射器，26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc 胰岛素注射器，U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| 异氟烷，USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS，pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 10378016 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10082147 | |
| 玻璃纤维棉 | Corning | 3950 |
参考文献
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J.
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重印与许可
