利用染色质免疫沉淀分析c-KIT配体启动子

摘要

DNA-蛋白质相互作用对多种生物学过程至关重要。在评估细胞功能时，分析DNA-蛋白质相互作用对于理解基因调控不可或缺。染色质免疫沉淀（ChIP）是分析此类相互作用的有力工具。 体内

摘要

多种细胞过程，包括DNA复制与修复、DNA重组以及基因表达，均需要蛋白质与DNA之间的相互作用。因此，DNA-蛋白质相互作用调控着多种生理、病理生理及生物学功能，例如细胞分化、细胞增殖、细胞周期调控、染色体稳定性、表观遗传性基因调控以及细胞转化。在真核细胞中，DNA与组蛋白和非组蛋白相互作用，并被压缩形成染色质。目前已有多种技术可用于分析DNA-蛋白质相互作用，例如电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNase I足迹法。然而，这些技术是在体外（in vitro）条件下分析蛋白质-DNA相互作用，而非在细胞生理环境中进行。染色质免疫沉淀（ChIP）技术能够捕获蛋白质在其特异性DNA结合位点上的结合状态，从而实现对染色质环境中的DNA-蛋白质相互作用的鉴定。该方法首先通过交联 固定DNA-蛋白质相互作用，随后对目标蛋白进行 免疫沉淀。接着，对蛋白质所结合的基因组位点进行鉴定。本文将描述并讨论ChIP技术，并展示其在鉴定转化生长因子-β（TGF-β）诱导的转录因子SMAD2与干细胞因子（SCF）受体c-KIT启动子区域内的SMAD结合元件（SBE）结合过程中的分析价值。

引言

在真核生物的细胞核中，DNA 与组蛋白和非组蛋白相互作用，并被压缩形成染色质。在生理、病理生理及细胞生物学背景下，细胞功能通过染色质协调的基因表达实现空间和时间上的调控。DNA-蛋白质相互作用在调控细胞过程（如 DNA 复制、重组和修复，以及蛋白质表达）中起着至关重要的作用。因此，分析 DNA-蛋白质相互作用是评估基因表达和细胞功能不可或缺的工具。

评估 DNA-蛋白质相互作用的多种技术 体外，例如电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNase I 足迹法^1,2然而，这些技术无法在染色质和细胞环境中分析蛋白质与DNA的相互作用。染色质免疫沉淀（ChIP）技术能够捕获与特定DNA结合位点结合的蛋白质，从而促进在染色质背景下DNA-蛋白质相互作用的鉴定。该技术最初由Gimour和Lis开发，用于评估RNA聚合酶II在特定基因上的结合情况 大肠杆菌 和 黑腹果蝇^3,4通过固定DNA-蛋白质复合物，随后进行染色质提取并将DNA剪切为约200个碱基对（bp）的片段。接着，利用免疫沉淀法分离与DNA结合的目标蛋白质。在解除DNA与蛋白质的交联后，纯化DNA并进行分析。针对目标基因内蛋白质结合位点的分析可采用....

方案

1. 溶液的配制

1. 每次实验均需新鲜配制以下溶液。
   1. 对于固定液，配制37%的甲醛并室温保存。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至终浓度为1.42%。
      注意：甲醛被归类为刺激性、腐蚀性、致突变性、致畸性和致癌性物质。切勿吞食。避免吸入气体/烟雾/蒸气/喷雾。若通风不足，请佩戴适当的呼吸防护设备。避免与皮肤和眼睛接触。远离不相容物质，如氧化剂、还原剂、酸、碱和湿气。
   2. 对于甘氨酸终止固定液，将0.125 M甘氨酸溶于1×PBS溶液中，并在室温下保存。
   3. 对于细胞刮取液，将1×PBS溶液溶于dH₂O中并置于冰上。使用前立即加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为0.5 mM。
      注意：PMSF被归类为腐蚀性和有毒物质；请穿戴防护服，并在通风良好的区域使用。
   4. 使用细胞裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl; pH 8.0, 85 mM KCl, 和0.5% NP40）前，立即加入1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC；100×储存液溶于二甲基亚砜（DMSO）：104 mM盐酸-4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟（AEBSF），80 µM抑肽酶，4 mM亮抑蛋白酶肽，1.4 mM E-64，2 mM亮肽素，和1.5 mM胃蛋白酶抑制剂A）和0.5 mM PMSF。
   5. 使用细胞核....

结果

TGF-β1 配体与其同源受体复合物的结合导致 SMAD2/3 转录因子的丝氨酸磷酸化，随后它们与共同介导分子 SMAD4 结合。SMAD 复合物转位至细胞核。TGF-β 可通过两种方式调控基因转录：一种是 SMAD 直接结合靶基因调控区内的 SBE（SMAD 结合元件），另一种是通过 SMAD 调控转录激活因子或抑制因子的表达，进而间接调控目的基因的表达¹⁰。为了验证 c-KIT 配体 SCF 是否受到 TGF-β1 诱导的 SMAD2 直接结合其启动子而进行的转录调控，我们分析了 SCF 基因中包含 SCF 启动子的 2.4 kb 5' 侧翼区域中的 SMAD2 结合基序 5'-AGAC-3'（SBE）^13,14。我们在 SCF 起始密码子上游鉴定出 7 个潜在的 SBE 位点（图 1A）。为确认 TGF-β1 诱导 SMAD2 与 SCF 启动.......

讨论

在本报告中，我们展示了TGF-β1诱导SMAD2与c-KIT配体启动子内的SBE序列结合，以及TGF-β1诱导STAT3与其自身配体基因内识别序列的结合。我们通过染色质免疫沉淀实验验证了这两种转录因子在细胞因子诱导下的结合活性。

染色质免疫沉淀是一种强大的技术，可用于证明目标蛋白与DNA的直接结合，表征诱导蛋白与DNA结合的刺激因素，并确定蛋白结合的DNA序列。后者的信息有助于鉴定由特定目标蛋白调控的基因，可通过ChIP-on-chip、ChIP-seq或克隆策略实现^7,8,9。与EMSA或DNase I足迹法等其他证明DNA-蛋白结合的方法相比，ChIP的主要优势之一在于，ChIP技术可在体内（in vivo）捕获结合事件，而其他方法则在体外（in vitro）进行。因此，ChIP能够揭示细胞环境中的DNA-蛋白相互作用，而其他技术仅代表一种孤立的系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HepG2 细胞	ATCC	HB-8065
Hep3B 细胞	ATCC	HB-8064
TGF-β1	R&D Systems	101-B1	使用浓度为 10 ng/mL
抗 SMAD2 抗体	Cell Signalling Technology	5339	使用量/IP：3 µg
抗 STAT3 抗体	Cell Signalling Technology	4904	使用量/IP：3 µg
ChIP-IT Protein G 磁珠	Active Motif	53033
蛋白酶抑制剂混合物	Active Motif	37490
微球菌核酸酶	Cell Signalling Technology	10011
PCR 正向引物：PAI-1			序列：5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR 反向引物：PAI-1			序列：5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR 正向引物：SCF			序列：5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’
PCR 反向引物：SCF			序列：5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR 正向引物：TGF-β1 (STB-1)			序列：5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’
PCR 反向引物：TGF-β1 (STB-1)			序列：5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’
PCR 正向引物：TGF-β1 (STB-2)			序列：5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’
PCR 反向引物：TGF-β1 (STB-2)			序列：5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’