利用染色质免疫沉淀分析c-KIT配体启动子

摘要

DNA-蛋白质相互作用对多种生物学过程至关重要。在评估细胞功能时，分析DNA-蛋白质相互作用对于理解基因调控不可或缺。染色质免疫沉淀（ChIP）是分析此类相互作用的有力工具。 体内

摘要

多种细胞过程，包括DNA复制与修复、DNA重组以及基因表达，均需要蛋白质与DNA之间的相互作用。因此，DNA-蛋白质相互作用调控着多种生理、病理生理及生物学功能，例如细胞分化、细胞增殖、细胞周期调控、染色体稳定性、表观遗传性基因调控以及细胞转化。在真核细胞中，DNA与组蛋白和非组蛋白相互作用，并被压缩形成染色质。目前已有多种技术可用于分析DNA-蛋白质相互作用，例如电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNase I足迹法。然而，这些技术是在体外（in vitro）条件下分析蛋白质-DNA相互作用，而非在细胞生理环境中进行。染色质免疫沉淀（ChIP）技术能够捕获蛋白质在其特异性DNA结合位点上的结合状态，从而实现对染色质环境中的DNA-蛋白质相互作用的鉴定。该方法首先通过交联 固定DNA-蛋白质相互作用，随后对目标蛋白进行 免疫沉淀。接着，对蛋白质所结合的基因组位点进行鉴定。本文将描述并讨论ChIP技术，并展示其在鉴定转化生长因子-β（TGF-β）诱导的转录因子SMAD2与干细胞因子（SCF）受体c-KIT启动子区域内的SMAD结合元件（SBE）结合过程中的分析价值。

引言

在真核生物的细胞核中，DNA 与组蛋白和非组蛋白相互作用，并被压缩形成染色质。在生理、病理生理及细胞生物学背景下，细胞功能通过染色质协调的基因表达实现空间和时间上的调控。DNA-蛋白质相互作用在调控细胞过程（如 DNA 复制、重组和修复，以及蛋白质表达）中起着至关重要的作用。因此，分析 DNA-蛋白质相互作用是评估基因表达和细胞功能不可或缺的工具。

评估 DNA-蛋白质相互作用的多种技术 体外，例如电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNase I 足迹法^1,2然而，这些技术无法在染色质和细胞环境中分析蛋白质与DNA的相互作用。染色质免疫沉淀（ChIP）技术能够捕获与特定DNA结合位点结合的蛋白质，从而促进在染色质背景下DNA-蛋白质相互作用的鉴定。该技术最初由Gimour和Lis开发，用于评估RNA聚合酶II在特定基因上的结合情况 大肠杆菌 和 黑腹果蝇^3,4通过固定DNA-蛋白质复合物，随后进行染色质提取并将DNA剪切为约200个碱基对（bp）的片段。接着，利用免疫沉淀法分离与DNA结合的目标蛋白质。在解除DNA与蛋白质的交联后，纯化DNA并进行分析。针对目标基因内蛋白质结合位点的分析可采用多种方法，具体选择取决于该结合位点的核酸序列。⁵在已知DNA序列的情况下，可使用特异性引物对扩增已知结合位点两侧区域，进行标准聚合酶链式反应（PCR）。也可采用定量实时荧光PCR（qRT-PCR）。⁶在序列未知的情况下，染色质免疫沉淀（ChIP）可与DNA微阵列（ChIP-on-chip）、DNA测序（ChIP-seq）或克隆技术联用^7,8,9.

TGF-β 信号通路具有强大的肿瘤抑制功能，是细胞分化中的关键通路。该通路通过 TGF-β1 配体与其相应的受体复合物结合而被激活，导致 SMAD2/3 转录因子发生丝氨酸磷酸化。在与通用介导分子 SMAD4 结合后，SMAD 复合物转位至细胞核，并结合靶基因启动子区域内的 SBE，从而调控控制细胞周期、凋亡和细胞分化的基因表达。TGF-β 刺激引发的转录反应具有细胞类型和环境特异性¹⁰。最近，我们描述了 TGF-β 与 c-KIT 通路之间存在正反馈环路¹¹。在此模型中，TGF-β1 激活的 SMAD2 结合到 c-KIT 配体的启动子区域，诱导其表达与分泌。随后，c-KIT 配体以自分泌和旁分泌 方式激活 c-KIT 受体。c-KIT 受体的激活通过 JAK1/2 引起 STAT3 在 Tyr⁷⁰⁵ 位点的磷酸化。STAT3 激活并转入细胞核后，会结合 TGF-β1 配体基因并调控其表达。

在此，我们展示了染色质免疫沉淀（ChIP）分析在鉴定SMAD2与c-KIT受体配体启动子结合以及信号转导子和转录激活子3（STAT3）与TGF-β1基因结合中的关键作用。

方案

1. 溶液的配制

1. 每次实验均需新鲜配制以下溶液。
   1. 对于固定液，配制37%的甲醛并室温保存。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至终浓度为1.42%。
      注意：甲醛被归类为刺激性、腐蚀性、致突变性、致畸性和致癌性物质。切勿吞食。避免吸入气体/烟雾/蒸气/喷雾。若通风不足，请佩戴适当的呼吸防护设备。避免与皮肤和眼睛接触。远离不相容物质，如氧化剂、还原剂、酸、碱和湿气。
   2. 对于甘氨酸终止固定液，将0.125 M甘氨酸溶于1×PBS溶液中，并在室温下保存。
   3. 对于细胞刮取液，将1×PBS溶液溶于dH₂O中并置于冰上。使用前立即加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为0.5 mM。
      注意：PMSF被归类为腐蚀性和有毒物质；请穿戴防护服，并在通风良好的区域使用。
   4. 使用细胞裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl; pH 8.0, 85 mM KCl, 和0.5% NP40）前，立即加入1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC；100×储存液溶于二甲基亚砜（DMSO）：104 mM盐酸-4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟（AEBSF），80 µM抑肽酶，4 mM亮抑蛋白酶肽，1.4 mM E-64，2 mM亮肽素，和1.5 mM胃蛋白酶抑制剂A）和0.5 mM PMSF。
   5. 使用细胞核裂解缓冲液（50 mM Tris-Cl；pH 8.0，10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和1% SDS）前，立即加入1× PIC和0.5 mM PMSF。

2. 细胞固定与剪切

1. 将细胞在10 cm组织培养皿中培养至70-80%汇合度。根据实验目的对细胞进行刺激。
2. 移除组织培养液，加入5 mL固定液，在室温下于摇床上孵育10分钟 。
3. 移除固定液，用10 mL冰预冷的1× PBS洗涤细胞两次。
4. 移除1× PBS，加入5 mL甘氨酸终止-固定液，在摇床上室温孵育5分钟。
5. 移除甘氨酸终止-固定液，用10 mL冰预冷的1× PBS洗涤细胞两次。
6. 移除1× PBS，加入2 mL细胞刮取液，使用细胞刮刀收集细胞。将收集的细胞转移至冰上的锥形管中。
7. 在4 °C下以600 × g离心样品10分钟。
8. 移除上清液，将沉淀重悬于1 mL 1×细胞裂解缓冲液中，冰上孵育30分钟。或者，将沉淀在液氮中速冻后于-80 °C保存。
9. 待沉淀在细胞裂解缓冲液中重悬后，将细胞悬液转移至冰预冷的Dounce匀浆器中，使用B型研杵匀浆10次以破碎细胞。
10. 将细胞悬液转移至微量离心管中，在4 °C下以2,400 × g离心10分钟。
11. 弃去上清液，将沉淀重悬于350 µL核消化缓冲液中，37 °C孵育5分钟。
12. 加入微球菌核酸酶（1 U/µL），涡旋混匀。37 °C孵育5-20分钟；每2分钟轻轻颠倒混匀一次。
    注意：不同细胞系所需孵育时间和酶浓度可能不同，在酶切效果不理想时可能需要优化。
13. 也可使用市售超声破碎仪通过超声处理实现染色质剪切。
    注意：超声处理条件需进行优化。以下提供一个优化示例方案，使用300 µL样品体积和25%处理功率。
    1. 完成步骤2.10后，弃去上清液，将核沉淀重悬于1.0 mL商用剪切缓冲液中。
    2. 将重悬的核悬液分装300 µL至三个1.7 mL微量离心管中，置于冰上。
    3. 使用三种不同条件对3份固定染色质样品在25%功率下进行超声剪切，以确定最佳超声条件：
       每次20秒，共5次脉冲，每次间隔在冰上静置30秒。
       每次20秒，共10次脉冲，每次间隔在冰上静置30秒。
       每次20秒，共20次脉冲，每次间隔在冰上静置30秒。
    4. 按以下说明继续进行步骤2.15。
14. 微球菌核酸酶孵育结束后，加入7 µL冰预冷的0.5 M EDTA以终止反应。
15. 将含有剪切后DNA的样品在4 °C下以16,200 × g离心10分钟。
16. 将含有剪切DNA的上清液转移至新的微量离心管中。分装50 µL至另一微量离心管中用于确认DNA剪切效果（第3节）。剩余液体立即用于免疫沉淀（第4节）或于-80 °C保存。

3. 确认剪切效率

1. 向步骤 2.16 中剪切的染色质 50 µL 等分试样中加入 150 µL 无核酸酶的 dH₂O 和 10 µL 5 M NaCl。
2. 将样品在 65 °C 下孵育 4 小时，以逆转交联。
3. 加入 2 µL RNase A（10 µg/µL），并将样品在 37 °C 下孵育 15 分钟。
4. 加入 10 µL 蛋白酶 K（0.5 µg/µL），并将样品在 42 °C 下孵育 90 分钟。
5. 为纯化 DNA，进行苯酚/氯仿抽提¹²。
   1. 加入无核酸酶水至终体积为 200 µL。向样品中加入 200 µL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），涡旋振荡 20 秒。
   2. 在室温下以 16,000 x g 离心 5 分钟。小心移取上层水相并转移至新管中。移液时务必避免带入苯酚。
   3. 加入 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠（NH₄OAc），pH 5.2，用手指轻弹管壁数次混匀。加入 2.5 倍体积的冰冻 100% 乙醇，涡旋振荡 5 秒混匀。将样品在 -20 °C 过夜孵育，或在 -80 °C 孵育至少 1 小时。
   4. 在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 30 分钟，使 cDNA 沉淀成团。
   5. 小心移去上清液，避免扰动沉淀。加入 1 mL 室温 70% 乙醇，反复倒置混匀数次。
   6. 在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 2 分钟，小心移去上清液。
   7. 在室温下干燥沉淀 5–10 分钟，然后将沉淀重悬于 30 µL dH₂O 中。
6. 取 5 µL 和 10 µL 纯化后的 DNA 进行 1% TAE 琼脂糖凝胶电泳。
   注意：成功的染色质剪切应产生 200–1,500 bp 的 DNA 条带模式。若剪切不成功，可通过将剪切步骤（步骤 2.12）的孵育时间分别调整为 5、10 和 15 分钟，确定特定细胞的最佳剪切条件。
7. 使用剩余样品测定 DNA 浓度。反向计算剪切染色质样品（步骤 2.16）中的 DNA 浓度；在免疫沉淀实验（第 4 节）中，为每个处理组使用相同量的 DNA。

4. 免疫沉淀

1. 将10–25 µg剪切并交联的染色质（步骤2.16）与25 µL ChIP级蛋白G磁珠、10 µL免疫沉淀稀释缓冲液（储存液：0.01% SDS、1.1% Triton X-100、16.7 mM Tris-HCl；pH 8.0、1.2 mM EDTA和167 mM NaCl）以及1 µL PIC混合。
2. 孵育4小时后，向1.5 mL微量离心管中加入1–10 µg抗体（抗体浓度取决于抗体的亲和力；初始使用量应遵循生产商推荐，必要时通过实验优化），再加入dH₂O至终体积为100 µL。
   注意：除上述直接免疫沉淀法外，也可采用间接免疫沉淀法，即先将染色质与抗体混合，随后加入蛋白G磁珠。
3. 将样品置于4 °C下，在旋转摇床上以末端对末端方式孵育4–12小时。

5. 洗脱

1. 将离心管置于磁力架上。当磁珠在管壁一侧聚集后，小心移除并弃去上清液。
2. 用800 µL洗涤缓冲液1（0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA pH 8、20 mM Tris-HCl pH 8和150 mM NaCl）洗涤磁珠三次；通过反复倒置离心管混匀。将离心管置于磁力架上，待磁珠在管壁一侧聚集后，小心移除并弃去洗涤缓冲液。
3. 用800 µL洗涤缓冲液2（0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA pH 8、20 mM Tris-HCl pH 8和500 mM NaCl）洗涤磁珠一次；通过反复倒置离心管混匀。将离心管置于磁力架上，待磁珠在管壁一侧聚集后，小心移除并弃去洗涤缓冲液。
4. 将磁珠重悬于50 µL洗脱缓冲液（1% SDS和100 mM NaHCO₃）中，并在室温下于旋转摇床上孵育15分钟。
5. 将离心管置于磁力架上，待磁珠在管壁一侧聚集后，将上清液转移至新的离心管中。
6. 加入6 µL 5 M NaCl以逆转交联，并加入2 µL蛋白酶K（0.5 µg/µL）。混匀样品后，在65 °C下孵育2小时。
7. 为纯化DNA，进行酚/氯仿抽提¹²（步骤3.5），随后将沉淀重悬于30 µL dH₂O中。
   注意：样品可直接用于分析蛋白结合位点（第5节），或在-20 °C下保存。

6. 结合位点分析

1. 使用 PCR 或 qRT-PCR 对已知核酸序列中的特异性结合位点进行分析。引物设计应遵循常规的 PCR 或 qRT-PCR 方案，设计引物以扩增长度为 150–400 bp 的片段，该片段需跨越目标蛋白的结合位点（图 1）。
2. 采用四种不同的 DNA 模板进行 PCR，以确保特异性：i) 使用目标抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）后获得的 DNA；ii) 使用非特异性 IgG 抗体进行 ChIP 后获得的 DNA；iii) 输入 DNA（input DNA）；iv) 以 H₂O 作为 PCR 的阴性对照，以排除污染。在信号通路激活的情况下，可选用第五种模板，并使用另一对针对已知免疫沉淀蛋白结合位点的特异性引物。
   注意：在分析 c-KIT 配体启动子时，可采用常规 PCR 证明 TGF-β 诱导的 SMAD 蛋白在 c-KIT 配体启动子区 SBE 位点的结合。作为阳性对照，可对纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）进行 PCR 扩增，因其是已知的 TGF-β 诱导 SMAD 结合的靶基因。

结果

TGF-β1 配体与其同源受体复合物的结合导致 SMAD2/3 转录因子的丝氨酸磷酸化，随后它们与共同介导分子 SMAD4 结合。SMAD 复合物转位至细胞核。TGF-β 可通过两种方式调控基因转录：一种是 SMAD 直接结合靶基因调控区内的 SBE（SMAD 结合元件），另一种是通过 SMAD 调控转录激活因子或抑制因子的表达，进而间接调控目的基因的表达¹⁰。为了验证 c-KIT 配体 SCF 是否受到 TGF-β1 诱导的 SMAD2 直接结合其启动子而进行的转录调控，我们分析了 SCF 基因中包含 SCF 启动子的 2.4 kb 5' 侧翼区域中的 SMAD2 结合基序 5'-AGAC-3'（SBE）^13,14。我们在 SCF 起始密码子上游鉴定出 7 个潜在的 SBE 位点（图 1A）。为确认 TGF-β1 诱导 SMAD2 与 SCF 启动...

讨论

在本报告中，我们展示了TGF-β1诱导SMAD2与c-KIT配体启动子内的SBE序列结合，以及TGF-β1诱导STAT3与其自身配体基因内识别序列的结合。我们通过染色质免疫沉淀实验验证了这两种转录因子在细胞因子诱导下的结合活性。

染色质免疫沉淀是一种强大的技术，可用于证明目标蛋白与DNA的直接结合，表征诱导蛋白与DNA结合的刺激因素，并确定蛋白结合的DNA序列。后者的信息有助于鉴定由特定目标蛋白调控的基因，可通过ChIP-on-chip、ChIP-seq或克隆策略实现^7,8,9。与EMSA或DNase I足迹法等其他证明DNA-蛋白结合的方法相比，ChIP的主要优势之一在于，ChIP技术可在体内（in vivo）捕获结合事件，而其他方法则在体外（in vitro）进行。因此，ChIP能够揭示细胞环境中的DNA-蛋白相互作用，而其他技术仅代表一种孤立的系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HepG2 细胞	ATCC	HB-8065
Hep3B 细胞	ATCC	HB-8064
TGF-β1	R&D Systems	101-B1	使用浓度为 10 ng/mL
抗 SMAD2 抗体	Cell Signalling Technology	5339	使用量/IP：3 µg
抗 STAT3 抗体	Cell Signalling Technology	4904	使用量/IP：3 µg
ChIP-IT Protein G 磁珠	Active Motif	53033
蛋白酶抑制剂混合物	Active Motif	37490
微球菌核酸酶	Cell Signalling Technology	10011
PCR 正向引物：PAI-1			序列：5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR 反向引物：PAI-1			序列：5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR 正向引物：SCF			序列：5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’
PCR 反向引物：SCF			序列：5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR 正向引物：TGF-β1 (STB-1)			序列：5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’
PCR 反向引物：TGF-β1 (STB-1)			序列：5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’
PCR 正向引物：TGF-β1 (STB-2)			序列：5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’
PCR 反向引物：TGF-β1 (STB-2)			序列：5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’