我们展示了一种用于分析影响果蝇Drosophila melanogaster交配行为的环境与遗传因素的实验方法。
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本文内容
摘要
摘要
个体的性驱动力受基因型、经历和环境条件的影响。这些因素如何相互作用以调控性行为，目前仍知之甚少。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，环境线索（如食物的可获得性）会影响交配活动，这为研究调控性行为的机制提供了一个易于操作的系统。在黑腹果蝇（D. melanogaster）中，环境线索通常通过化学感受的味觉和嗅觉系统被感知。本文介绍了一种检测环境化学线索对交配行为影响的方法。该实验包含一个小型交配区域，其中含有培养基和一对交配个体，持续监测每对果蝇在24小时内的交配频率。本文展示了该实验方法的应用，既可通过加压空气系统引入外部来源的环境化合物，也可直接在交配区域内操控环境成分。使用加压空气系统特别适用于测试高挥发性化合物的影响，而直接在交配区域内操控成分则有助于确认化合物的存在效应。该实验方法可被调整用于探究遗传和环境线索对交配行为、繁殖力以及其他雄性和雌性生殖行为的影响。
引言
生殖行为通常具有较高的能量消耗，尤其是对于雌性个体而言，由于其产生的配子比雄性更大，且必须谨慎选择适宜的环境来抚育发育中的后代。由于存在能量消耗，生殖与营养状况密切相关也就不足为奇了。这一点在大多数（即使不是全部）动物中均成立，包括哺乳动物——其青春期可能因营养不良而延迟，性欲也可能受到食物限制的负面影响1。
遗传模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的繁殖也受到营养条件的影响。雄性在食物挥发物存在时求偶行为增强2，而雌性在酵母存在时性接受度更高，酵母是卵子产生和后代存活的主要营养来源3,4,5。这种在进化上保守的对食物的生殖响应，为在遗传上易于操作且实验周期短的生物体中研究环境食物可获得性与有性生殖之间联系的机制提供了机会。事实上，对黑腹果蝇（D. melanogaster）的研究已表明，胰岛素信号通路是食物与交配行为之间关联的重要调控因子6。研究还发现，交配行为本身会改变雌性的食物偏好及其相关的化学感受神经元7,<....
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方案
1. 环境可控的交配箱
- 为确保测试区域受控且易于清洁，按图1A所示设置一个尺寸为120 cm x 64 cm x 85 cm的不锈钢厨房柜。
- 在柜子后壁天花板正下方钻一个孔，在两侧壁上各钻四组孔，每组四个，孔径均为2 cm。在箱体两侧各钻第一组四孔，距箱底高度为7 cm，孔间距为12.5 cm。另两组四孔位于箱体两侧，距箱底高度为35 cm。
注意：四组四孔用于摄像头电源线和气泵管路进出柜体。后壁的孔用于灯板的电源线穿过。 - 制作一块灯板，共18行，每行40个交替排列的白色和红色发光二极管（LED），每个灯之间间距为2.5 cm。将白色和红色LED接入电路并连接电源。每个LED串联一个阻值为560 Ω、功率0.25 W、误差5%的电阻。
注意：红光发射波长范围为590–661 nm，在627 nm处有尖锐峰值。实验区域内的光照强度在两种光源全开时约为900 lux，仅红光开启时约为90 lux；该数值使用智能手机光照计应用程序测得。 - 将灯板固定在不锈钢柜顶部，并使电源线从后壁孔中穿过。
- 将白色LED的适配器连接至一个电源控制定时器，以便在实验的黑暗阶段关闭白色LED。将果蝇无法感知的红光光源适配器25连接至常规电源，使其在整个实验过程中持续开启。
- 在箱体内侧距底部50 cm高度处，安装一....
- 在柜子后壁天花板正下方钻一个孔，在两侧壁上各钻四组孔，每组四个，孔径均为2 cm。在箱体两侧各钻第一组四孔，距箱底高度为7 cm，孔间距为12.5 cm。另两组四孔位于箱体两侧，距箱底高度为35 cm。
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结果
利用这种连续测定方法，可在特定实验环境条件下测定交配行为及交配频率。为控制环境条件，我们将一个不锈钢厨房柜改造为测试区域，配备独立的光源和漫射装置，确保交配实验区顶部具有充足的光照并最大限度减少眩光（图1A）。内部测试区域完全由不锈钢和玻璃封闭，可使用有机溶剂（如正己烷或乙醇）进行清洁。此外，柜体上设有孔洞，作为管道入口，将加压空气系统中的挥发性信号导入测试区域（见图1A和图1B）。该加压空气系统经过调整以适配酵母气味，气流在进入测试区域前先通过液体酵母培养物，随后经4个带有10个出口的移液管分流器分配气流（图1C）。整个系统为密闭结构，并在气流进入和离开酵母培养物前后均配备多个颗粒过滤器，以最大限度减少干扰性气味的污染（图1B）。
为了演示本实验方法的应用，我们检测了酵母培养物释放的.......
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讨论
本方案描述了一种在24小时内检测交配行为的实验方法，同时持续控制交配对体被假定用于决定交配频率的环境线索。当培养基中含有酵母时，通过加压空气系统输送酵母气味可提高交配频率（图2B）。此外，在成分简化的食物培养基中，仅含有琼脂、蛋白胨以及直接添加于培养基中的乙酸气味时，也可观察到类似的交配频率响应（图3B）
通过此处展示的实验，仅能得出关于果蝇配偶整体交配行为的结论，因为雌雄个体均处于相同的环境条件下。然而，根据以往的研究可知，交配频率变异的47%由雌性决定，而雄性的贡献仅占变异的11%20。因此，观察到的交配频率的大部分变化很可能是由雌性性接受度所导致的。即使雄性求偶行为增加，交配是否发生仍取决于雌性是否接受或拒绝，因为成年黑腹果蝇（D. melanogaster）雌性能成功回避交配尝试29。为了得出确切结论，并将交配频率的差异明确归因于雌性性接受度，有必要进一步测试额外的交配组合，其中保持雄性基因型不.......
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披露
作者声明无竞争利益需要披露。
致谢
我们感谢布卢明顿 果蝇 果蝇品系保藏中心提供果蝇品系；C. Gahr、J. T. Alkema 和 S. van Hasselt 在开发加压空气检测方法初期所作的尝试；Jasper Bosman 在酵母培养方面的建议；Rezza Azanchi 和 Joel Levine 在最初开发延时监测技术方面的贡献 黑腹果蝇 交配行为。J.A. Gorter 获得了神经科学研究学院 BCN/NWO 研究生项目资助。本工作部分由荷兰科学研究组织（NWO）（编号：821.02.020）资助，项目负责人为 J.C. Billeter。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 机柜 | |||
| 不锈钢厨房柜 | Horecaworld | 7412.0105 | |
| 白色LED灯 | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | 冷白光，20 mAmp，2 V |
| 红色LED灯 | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | 波长625 nm，20 mAmp，6 V |
| 电阻器 | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 欧姆，0.25 W，250 V，5% 容差 |
| 智能手机光强计应用 | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE，版本 1.1.1 | |
| 电源定时器 | Alecto | TS-121 | |
| 金属支架 | 锐角 5×5 mm， 2 根长 5450 mm，1 根长 1100 mm | ||
| 磨砂玻璃板 | 1190 × 545 × 5 mm | ||
| 滤纸片 | LEE filters | 220 | 白色磨砂 |
| 小型风扇 | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm 超静音电脑风扇，1200 RPM |
| 大型风扇 | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm 超静音电脑风扇，650–1500 RPM |
| 网络摄像头 | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM，视角：78度，分辨率：500万像素 |
| 摄像头软件 | DeskShare | Security monitor pro | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 果蝇饲养 | |||
| 果蝇饲养瓶 | Flystuff | 32-130 | 6盎司果蝇品系瓶 |
| 果蝇培养皿（Flypad） | Flystuff | 59-114 | |
| 野生型果蝇 | Canton-S | ||
| 果蝇饲养管 | Dominique Dutscher | 789008 | 果蝇管，窄型，25×95 mm |
| 培养箱 | Sanyo | MIR-154 | |
| 磁力搅拌加热板 | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| 琼脂 | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| 葡萄糖 | Gezond&wel | 1019155 | 右旋糖/葡萄糖 |
| 蔗糖 | Van Gilse | 砂糖 | |
| 玉米粉 | Flystuff | 62-100 | |
| 小麦胚芽 | Gezond&wel | 1017683 | |
| 大豆粉 | Flystuff | 62-115 | |
| 糖蜜 | Flystuff | 62-117 | |
| 活性干酵母 | Red Star | ||
| 丙酸甲酯（Tegosept） | Flystuff | 20-258 | 100% |
| 蛋白胨（bacto） | BD | 211677 | |
| 乙酸 | Merck | 1000631000 | 冰醋酸，100% |
| 小型培养皿 | Greiner bio-one | 627102 | 35 × 10 mm，带通气孔 |
| 石蜡膜 | Bemis NA | Parafilm | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 酵母与加压空气装置 | |||
| 大型培养皿 | Gosselin | BP140-01 | 140 × 20.6 mm |
| 超纯水 | Millipore corporation | MiliQ | |
| 酵母提取物 | BD | 212750 | |
| 琼脂（纯） | BD | 214530 | bacto |
| 葡萄糖（0(+)-葡萄糖一水合物） | Merck | 18270000004 | |
| 开放式瓶盖 | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| 硅胶隔垫 | VWR | 548-0662 | |
| 带倒刺的穿板接头 | Nalgene | 6149-0002 | |
| 大口径PVC管 | 直径：外径1.2 cm，内径0.9 cm | ||
| 小口径PVC管 | 直径：外径0.8 cm，内径0.5 cm | ||
| 15 ml离心管 | Falcon | ||
| 水族泵 | Sera precision | Sera air 110 plus，交流 220–240 V，50/60 Hz，3 W，压力 >100 mbar | |
| 活性炭 | Superfish | A8040400 | Norit 活性炭 |
| 一次性滤器 | Whatman | 10462100 | |
| 移液管（血清学） | VWR | 612-1600 | |
| 注射器 | BD Plastipak | 300013 | |
| 热熔胶 | Pattex | ||
| 注射器滤器 | Whatman | FP 30/孔径 0.45 mm CA-S | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 分析 | |||
| 统计分析软件 | R | lme4 软件包 |
参考文献
- Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophi....
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重印与许可
