利用高尔基-考克斯法评估老龄小鼠海马树突复杂性

摘要

本文详细介绍了高尔基-考克斯染色法的完整实验方案。这种可靠的组织染色方法可对海马体以及全脑的细胞构筑进行高质量的评估，且几乎无需故障排查。

摘要

树突棘是神经元树突干上含有 兴奋性突触的突起结构。海马体内神经元树突的形态学特征及分支变化与认知和记忆形成密切相关。目前已有多种高尔基染色方法，均可有效显示树突树的形态学特征，并产生清晰的背景。本研究所采用的高尔基-考克斯（Golgi-Cox）法是对商业高尔基染色试剂盒所提供方案的轻微改良，旨在评估相对低剂量的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）对海马体中树突形态、树突棘数量以及树突分支复杂性的影响。结果显示，5-Fu以区域特异性的方式显著调节了树突的复杂性，并降低了整个海马体内的树突棘密度。实验数据表明，该高尔基染色法能够有效地对海马体CA1区、CA3区以及齿状回（DG）中的成熟神经元进行染色。本方案详细记录了每一步操作步骤，以便其他研究人员能够可靠地对全脑组织进行高质量染色，并最大限度减少实验问题。

引言

树突是神经元中接收和处理突触前输入的最大部分¹。树突具有复杂的几何结构，其近端分支的直径大于远端分支。随着树突的发育，它们会与其他神经元形成多个连接，这一过程称为树突分支形成。这种分支的程度和模式决定了树突能够有效处理的突触输入数量²。

树突分支化是神经元回路的活动依赖性可塑性和正常发育所必需的过程。树突的延伸、回缩、分支及突触形成是复杂的生物学过程，涉及内在的遗传程序以及外在因素的影响。海马区神经元树突在形态和分支模式上的差异与认知功能和记忆形成密切相关^3,4。树突复杂性的改变与多种病理生理和行为变化相关⁵。树突异常与多种疾病状态有关，包括脆性X综合征和唐氏综合征⁶。

树突棘是树突分支中特化的亚细胞区室，在中枢神经系统内接收兴奋性输入。树突棘在形态上可分为三类，每类的名称基于其大小和形状：1）蘑菇状棘，具有复杂的突触后密度，所含谷氨酸受体数量多于其他类型的棘⁷；2）短棘，无明显柄部；3）细棘，由细长狭窄的柄和球状头部组成⁸。树突棘的体积部分用于其分类，通常细棘体积较小（0.01 µm³），而蘑菇状棘体积较大（0.8 µm³）^9,10。随着成熟，树突棘逐渐趋于稳定。例如，细棘在数天后可能回缩，也可能发育为蘑菇状棘；而蘑菇状棘相对稳定，可长期存留。神经元连接的强度被认为与树突棘的数量和（或）其体积有关^11,12,13。

经典的高尔基染色法及其多种现代改良方法均被用于研究树突棘的形态和密度。高尔基染色法的一个独特之处在于，它能够随机地染色约5%的神经元，从而便于对单个神经元进行追踪^14,15。尽管高尔基染色法对单个神经元染色的确切机制尚不明确，但该方法的原理基于铬酸银（Ag₂CrO₄）的结晶过程^16,17。目前主要有三种高尔基染色方法：快速高尔基法、高尔基-考克斯法（Golgi-Cox）和高尔基-科普施法（Golgi-Kopsch）^18,19。这三种方法均需首先在铬盐溶液中孵育数天至数月，但彼此之间存在若干关键差异。快速高尔基法在第一步使用四氧化锇，而高尔基-科普施法则包含多聚甲醛。快速高尔基法和高尔基-科普施法的染色过程随后均需在1-2%的硝酸银溶液中孵育约7天。高尔基-考克斯法则使用氯化汞和重铬酸钾代替硝酸银，浸渍时间为2-4周。组织随后被切片，并迅速置于稀释的氨水中，接着使用摄影定影剂以去除盐类沉淀。在这三种方法中，高尔基-考克斯法被认为在实现树突分支清晰染色的同时背景干扰最小，部分原因在于其不会在组织表面产生晶体假象（而快速高尔基法则容易出现此类问题）^17,20,21。

本方法是对商业高尔基染色试剂盒所提供方案的轻微改进，旨在评估相对低剂量的5-Fu对树突形态特征及树突棘密度的影响。所获得的任何数据均可进一步揭示化疗处理对神经元环路的作用。

方案

实验均按照美国医科大学机构动物护理和使用委员会批准的伦理标准进行。

1. 动物与 5-Fu 注射方案

1. 购买6月龄雄性C57Bl6/J野生型小鼠，并在恒定的12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，直至其达到1岁年龄。
2. 将5-Fu溶于0.9%无菌生理盐水中。每只小鼠的给药剂量为60 mg/kg。
3. 对小鼠进行腹腔注射5-Fu（每周一次，连续三周）。
   1. 每天在同一时间段内进行腹腔注射，例如0900–1200时之间。
4. 在末次注射后30天处死动物并取出脑组织。

2. 安乐死操作与脑组织提取

1. 固定啮齿类动物，抓住其尾根部。另一只手将拇指或食指置于动物颈部基部，迅速对其颈部施加压力并向前推动，同时握住尾巴的手向后拉。
2. 一手握住动物，另一手持大型手术剪。将动物颈部置于剪刀双刃之间，迅速剪断头部。
3. 取下分离的鼠头，用精细剪刀修剪颅骨上方至眼部的毛发。随后将剪刀尖端插入两侧眼眶，稍用力闭合剪刀。
4. 使用弹簧剪沿小脑左右两侧剪开颅骨。
5. 用镊子将围绕小脑的颅骨部分直接向上提起并移除。
6. 使用弹簧剪沿颅骨正中矢状线剪开。
7. 用镊子将剩余的颅骨部分从脑组织上提起并移除。
8. 用刮勺和探针将脑组织取出至所需容器中。使用不锈钢刀片沿正中矢状面将每个脑组织切开。对右侧半脑进行后续的高尔基-考克斯染色法处理。

3. 高尔基染色与组织制备

1. 将新鲜收获的半脑浸入含有氯化汞的溶液（试剂盒中的溶液A）5 mL中，置于10 mL锥形管内。氯化汞溶液对光敏感，请用铝箔包裹锥形管。将样品在室温下避光保存。
   注意：溶液A来自材料表中列出的试剂盒。注意！溶液A（也称氯化汞溶液）含有重铬酸钾、氯化汞和铬酸钾等有毒试剂。操作时需佩戴防护手套，并在通风橱中进行。
2. 1天后，将溶液缓慢倾倒至临时容器（如大型称量舟）中，并将其放入生物危害废物容器中处理。将脑组织（仍保留在原始的10 mL锥形管中）用5 mL氯化汞溶液重新浸没，然后将样品继续在室温下避光保存13天。
3. 将30 g浸渍后缓冲液加入90 mL蒸馏水或去离子水（dH₂O）中。每个6孔板的孔中加入6.5 mL浸渍后缓冲液，每孔放置一个脑组织
   注意：浸渍后缓冲液来自材料表中列出的试剂盒。
   1. 在氯化汞溶液中处理总共14天后，用dH₂O冲洗组织，然后将其转移至含有浸渍后缓冲液的6孔板中。用铝箔覆盖板子，并在室温下避光保存。
4. 浸渍后缓冲液浸泡1天后，用移液器吸出缓冲液，并更换为新鲜的浸渍后缓冲液；继续在室温下避光保存1天。如有需要，可在4 °C保存长达1个月²²。

4. 切片

1. 将12孔板的盖子从左到右、从上到下按升序编号。
2. 如果对整个脑组织进行切片，每个脑样本准备两到三个12孔板。
   1. 在每个12孔板盖子的顶部标注所切脑组织的编号。
   2. 用移液器向每块板的每个孔中加入2 mL的1×PBS。
3. 设置好切片台并打开振动切片机；确保容器中有足够的1×PBS以浸没组织。
   1. 剪下两片塑料石蜡膜并各自对折两次，覆盖在标本夹持器旋钮的孔洞上，以防止1×PBS泄漏到台面上。
   2. 在标本夹持器的组织块上贴上胶带，然后在其上涂抹氰基丙烯酸酯胶水（参见材料表）。
4. 将脑组织从6孔板中取出，放置在塑料或玻璃培养皿上。使用不锈钢双刃刀片切除约一半的小脑组织。
   1. 从小脑尾侧开始切割，确保剩余的小脑部分平整均匀。
5. 立即将剩余小脑的平整切面贴附于胶水上。
   注意：组织的背侧（即大脑皮层）应相对于刀片朝左或朝右；原先连接嗅球的头端应朝上。
   1. 等待至少几分钟，确保胶水完全干燥。
6. 在固定脑组织的胶水干燥期间，向标本槽中倒入1×PBS。待胶水完全干燥后，将带有组织的标本夹持器放入标本槽中。
   1. 若组织样本未被完全浸没，可向标本槽中补充更多1×PBS。
7. 将刀片安装至振动切片机的刀片夹上，并缓慢将其降入标本槽，直至完全浸入1×PBS中。继续降低刀片位置，使其略低于组织顶部。
8. 将振动切片机的切速设为7，振幅设为6，切削角度设为12°（振动切片机型号参见材料表）。启动振动，开始切割200 µm厚的组织切片²³。
   1. 使用大号画笔将组织切片从标本槽转移至12孔板中对应的孔内。
9. 持续切片，直至获得所需数量的组织切片。

5. 染色后处理

1. 以下每个染色步骤及洗涤步骤中，每孔使用 2 mL 指定溶液。使用电动移液器（见材料表）将溶液加入孔中。使用移液管（见材料表）将溶液从孔中转移至适当的废液容器中。
2. 用 0.01 M PBS-T 进行一次 30 分钟的洗涤以冲洗切片（将 3.0 mL 去垢剂（见材料表）加入 1,000 mL 0.01 M PBS 中）。
3. 使用前立即用 dH₂O 将氢氧化铵溶液（注意）按体积比 3:5 稀释。将切片置于稀释后的氢氧化铵溶液中染色 19–21 分钟。
   1. 用铝箔包裹以保护对光敏感的氢氧化铵溶液。
      注：溶液中的氢氧化铵浓度约为 10%，被归类为"危险品"。氢氧化铵溶液接触皮肤可能引起灼伤，吸入后可能引起呼吸道刺激。操作时应佩戴防护手套，并在通风橱中进行。
4. 将切片置于复染缓冲液中染色 19–21 分钟（将 90 g 试剂 D 溶于 500 mL dH₂O 中）。复染缓冲液对光敏感，需用铝箔包裹保护²²。
5. 用 0.01 M PBS-T 分三次洗涤切片，每次 5–10 分钟。

6. 封片、清洗与加盖盖玻片

1. 用大号画笔将切片贴附于1%明胶包被的载玻片上。室温下干燥20-30分钟，然后将其放入Coplin染色缸中过夜。
2. 戴手套将载玻片从Coplin染色缸中取出，放入塑料染色架中（见材料表）。将塑料染色架置于含有100%乙醇的染色缸中（见材料表），进行三次、每次5分钟的脱水处理。
3. 用99%二甲苯洗涤载玻片，每次5分钟，共洗两次。将载玻片放入玻璃染色架中，并用带金属柄的玻璃染色缸（见材料表）盛装二甲苯，将染色架浸入其中。
   注意：二甲苯吸入有害，接触皮肤可引起刺激，液体和蒸气均高度易燃。操作时需佩戴防护手套，并在通风橱中进行。
4. 从二甲苯中逐个取出载玻片，迅速在组织上滴加约0.25 mL封片介质（见材料表）。然后取盖玻片覆盖于封片介质上。
   1. 使用钝头物体（如画笔末端）将盖玻片下 trapped 的气泡推至边缘。
5. 将载玻片置于避光处，干燥2-3天。
6. 使用显微镜采集图像，并用相应的软件进行分析。

7. 获取图像序列

1. 打开成像程序（参见 材料表）。将玻片放置于显微镜载物台上。在程序顶部菜单中，点击 "采集" 然后点击 "活体成像。"
2. 将显微镜设置为10倍物镜。找到目标神经元，然后将光标（呈红色X形）移至胞体中心。单击鼠标左键以设定参考点。
3. 将显微镜调至40倍。点击 "移动" 从程序顶部的菜单中选择，然后单击 "参考点"
4. 通过手动调节细准焦螺旋，使物镜在组织上方缓慢移动，直至组织图像略微失焦，开始创建图像序列。
   1. 点击 "置顶" 在程序右下角标题下方 "图像采集"
   2. 稍微滚动至组织下方，直至其略微失焦，然后点击 "设置底部" 在……下方 "图像采集" 接下来，单击 "获取图像堆栈。"
5. 图像堆栈采集完成后，在弹出的窗口中输入图像文件的期望名称。另存为 "MBF Ascii 文件"
   1. 当系统提示时，选择文件类型为 "MBF JPEG2000 图像序列文件" 然后点击 "保存。"

8. 神经元示踪

1. 在菜单下方的工具栏中，点击标题为"Contour Name"的框，然后从下拉菜单中选择"Soma"。
2. 手动描记细胞体，描记完成后右键单击并选择"Finish Cell Body"。
3. 选择"AutoNeuron"，以打开另一个标题为"AutoNeuron Workflow"的新标签页。
4. 在"Configuration Type"下，选择"New"。设置参数后，点击"Next Step"，以显示"Soma Detection"子标题。
   1. 设置参数时，选择"Brightfield"。接着，在"Max Process Diameter"下，点击"Start Measuring"。使用光标移至树突基部，手动设定直径。
5. 当弹出窗口提示用户描记整张图像时，点击"Yes"。手动描记细胞体，取消选中后点击"Next step"，以显示"Seed Placement"子标题。
6. 点击"Validate Seeds"，然后点击"Next Step"，以显示"Neuron Reconstruction"子标题。
7. 在"Neuron"下，点击"Interactive"。根据程序指示的树突方向进行交互式描记，并通过右键单击完成程序高亮显示的描记区域。完成所有树突描记后，点击"Next Step"。
8. 新窗口出现后，使用所需的名称保存新配置，然后点击"Save"。

9. 分析

1. 打开分析程序（参见材料表）。
2. 点击顶部菜单中的 "文件"，然后点击 "打开数据文件"，选择目标文件。
3. 在分析子标题下，选择 "Sholl 分析"。
4. 在 "Sholl 分析" 窗口中，将起始半径设置为 10 µm。在 "分析" 下，勾选 "树突" 和 "分支级数" 选项。
5. 右键单击新打开的窗口，点击 "导出至 Excel"，然后点击 "保存"。
6. 在分析选项下，点击 "分支结构分析"，选择 "所有可能的分析"。
7. 右键单击新打开的窗口，点击 "导出至 Excel"²⁴。

结果

使用一种市售成像软件，对Golgi染色脑切片中海马区经5-Fu处理后的树突分支及复杂性进行定量分析和追踪。追踪完成后，采用Sholl分析法和树突复杂性指数（DCI）对树突分支、树突棘密度以及树突棘形态进行分析。Sholl分析是一种可用于确定树突分支形态的定量分析方法²⁵。该方法以胞体为起点，每隔10 µm绘制同心圆覆盖树突追踪图像，树突长度由其穿过的圆圈数量决定。分支点分析是一种评估树突分支复杂性的方法，其依据是分支点的总数及其分级次序。

分支点定义为一个分支分裂成两个子分支的位置。分支级次是基于分支分裂次数来衡量复杂性的指标。例如，一级分支点是指从胞体延伸出的原始树突，而二级分支点则是指该分支分裂成两个子分支的位置。通过分析分支点和分支级次，可以确定树突树的复杂性（基于分支点的数量）以及分支发生的位置（较小的分支级次更靠近胞体，较大的分支级次则远离胞体）。这些参数被应用于DCI的分析中。CA1和CA3区...

讨论

与更现代的技术相比，Golgi-Cox 方法在观察树突棘形态方面具有若干优势，使其成为首选方法：1）该染色法几乎适用于任何组织；2）仅需基本的光学显微镜装置即可获取基于 Golgi 的图像；3）Golgi-Cox 成像速度比共聚焦成像更快；4）Golgi 染色切片的可保存时间比荧光标记样本长数月甚至数年。尽管具备这些优势，Golgi-Cox 方法仍存在某些局限性。首先，整个流程耗时极长，需要数周的染色时间，随后还需进行图像分析。如本实验方案所示，在切片开始前，组织需在溶液 A 中浸泡 14 天，再在溶液 B 中浸泡 1 天。此外，切片、染后处理及封片步骤每只脑组织需耗时 2 至 3 小时。每张切片在清洗和封片前必须干燥 1 天。此后，成像与分析所需时间则因人而异。其次，由于不同分析人员在树突棘分类标准上可能存在差异，导致数据一致性问题³⁰。因此，建议每个实验的成像与分析部分由同一人完成，但这将进一步延长项目完成所需的总时间。

Golgi-Cox 染色法中有若干关键步骤需要精确控制时间和操作细节。使用氢氧化铵溶液染色切片时，切片在溶液中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
superGolgi试剂盒	Bioenno Lifesciences	30100	含有危险物质。
PBS 10x 粉末浓缩液	Fisher	BP665-1
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
佩尔蒙特	Fisher	SP 15-100
盖玻片	Fisher	12-546-14
7 mL 移液管	Globe Scientific	135030
10 mL Falcon 管	BD 生物科学	352099
箔	Fisher	01-213-105
12孔板	BD 生物科学	353043
200 proof 乙醇	Pharmco-AAPER	111000200
二甲苯	Acros Organics	1330-20-7	危险。
Permabond 200	Permabond LLC	GF2492
25 mL 血清移液管	Sigma	SIAL1489
Parafilm	Midsci	HS234526C
振动切片机	世界精密仪器公司	NVSLM1
C57Bl/6雄性小鼠	杰克逊实验室	000664
Axio Imager 2	ZEISS	多个组分，详情请见网站
AxioCam MRc 相机	ZEISS	426508-9902-000
染色皿，绿色	Tissue-Tek	62541-12
染色皿套装	电子显微镜科学公司	70312-20
电动移液器填充器	Fisher	03-692-168
Neurolucida	mbf Bioscience
Neurolucida Explorer	mbf Bioscience
Prism	GraphPad