重连神经元回路：一种实现快速神经突延伸与功能性神经元连接的新方法

摘要

本实验方案描述了如何利用固定在微移液管上、经多聚-D-赖氨酸包被的微珠，引导神经突生长，从而在微流控腔室中快速启动、延伸并连接神经突。

摘要

脑和脊髓损伤可能导致永久性残疾和死亡，因为目前仍无法实现神经元的长距离再生以及与适当靶点的精确重新连接。本文描述了一种可快速启动、延伸并精确建立长距离新功能性神经环路的方法。所达到的延伸速率超过1.2 mm/h，是传统再生速度的30至60倍。 体内 周围神经系统中生长速度最快的轴突的生长速率（0.02 至 0.04 mm/h）²⁸ 比此前报道的同一神经元类型在更早发育阶段的速度快10倍⁴首先，在微流控装置中培养分离的SD大鼠海马神经元群体2至3周，以精确定位细胞位置，便于进行显微操作并确保实验的可重复性。随后，将包被多聚-D-赖氨酸（PDL）的微珠置于神经突上形成黏附接触，通过移液器显微操作移动微珠-神经突复合物。在移动微珠的过程中，可牵拉出新的神经突，其长度可延伸数百微米，并在不到1小时内与靶细胞建立功能性连接。该方法避免了诱导神经突生长的传统化学策略中较慢的局限，实现了实验的可重复性与操作的便捷性。本文展示的初步测量结果显示，神经元生长速率远超生理条件下的水平。上述技术创新相结合，使得在体外培养中以前所未有的精确度构建神经元网络成为可能。该方法为研究神经元网络内的信号传递与通讯机制提供了全新途径，也为探索神经元生长的极限提供了理想的实验平台。其潜在应用与实验前景广泛，对旨在创伤后或神经退行性疾病中重建神经环路的治疗策略具有直接意义。 关键词：微流控装置，海马神经元，多聚-D-赖氨酸，微珠，神经突生长，神经元网络，显微操作，功能性连接，神经再生

引言

成年中枢神经系统（CNS）损伤可能导致永久性残疾，其原因包括多种限制轴突再生的机制¹。损伤后，许多中枢神经系统的轴突无法形成新的生长锥，因而不能启动有效的再生反应²。此外，损伤部位周围组织的破坏及瘢痕组织会显著抑制轴突生长^1,2,3。目前促进损伤后中枢神经系统再生的治疗方法主要集中在增强受损神经元的内在生长能力，以及屏蔽与髓鞘碎片和胶质瘢痕相关的轴突延伸抑制因子^1,3。尽管如此，轴突长距离再生至远端靶区并形成适当功能突触的能力仍然极为有限^4,5,6,7。

在本研究中，利用微珠、移液管显微操作技术和微流控装置，能够快速启动、延伸并精确地在长距离上连接新的功能性神经元回路。先前的研究表明，经多聚-D-赖氨酸包被的微珠（PDL-微珠）....

方案

以下所述的所有操作程序均经麦吉尔大学动物护理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会的指导方针。

1. 使用微流控装置标准化神经元培养：装置组装

1. 为所需实验选择合适的微流控装置。若需连接同一细胞群内的神经元，请使用神经元装置（图1）；若需连接不同细胞群中的神经元，请使用共培养装置（图6）。
2. 清洗并准备所需数量的无菌盖玻片或玻璃底培养皿。为获得最佳效果，在塑料表面使用35 mm培养皿，在玻璃表面使用25 mm盖玻片或35 mm玻璃底培养皿。根据成像系统选择玻璃厚度，例如0.15 mm。
3. 用0.5–1 mL浓度为100 µg/mL的PDL在室温下孵育2小时或过夜，以包被培养皿或盖玻片。
   注意：此处可暂停实验流程，次日继续操作。此外，也可使用硼酸盐缓冲液稀释的PDL、多聚-L-赖氨酸（PLL）、层粘连蛋白或其他任何细胞黏附分子对培养皿进行包被。
4. 用去离子水清洗培养皿两次（请勿使用磷酸盐缓冲液（PBS），因为盐结晶可能堵塞通道），彻底去除液体后，在无菌环境（如生物安全柜）中干燥5–10分钟，直至表面完全干燥。
   注意：务必确保盖玻片完全干燥，残留液体将影响微流控系统的贴附。
5. 将微流控装置图案面朝上置于无菌环境（生物安全柜）中，在紫外光下照射....

结果

胚胎大鼠海马神经元在微流控装置中培养，以实现细胞、聚-D-赖氨酸包被微珠及微操作器的精确定位。第一步是将微流控装置正确组装在玻璃盖玻片或培养皿上。必须确保微流控装置牢固地附着于基底，以防止细胞从腔室逸出并移动至装置中本应密封的部分下方图1a）。为了维持数周的健康培养，重要的是通过每2-3天检查一次培养基，并保持培养基的正弯月面，以防止培养基蒸发（图 2a）。通过将细胞和一个敞口的水皿共同置于一个较大的培养皿内，还可避免培养基蒸发。图 2b）。微流控装置可在任意时间移除。为获得最佳效果，应在移除装置前至少1 d向细胞-装置系统中添加NBM。这样可最大限度地减少细胞应激，因为移除装置时，神经元始终处于理想温度和pH的培养基环境中。当微流控装置被缓慢地从培养皿上剥离时（图 2c 和 2d

讨论

利用标准的显微操作技术与创新的微流控装置，开发出一种新技术，可快速启动、延伸并精确连接远距离的新功能性神经环路。移液器显微操作是大多数神经科学研究实验室中常用的工具。^4,13实现实验结果可重复且可靠的主要挑战在于，如何在整个实验周期（可能持续数周）内，通过开发微流控装置实现对健康且精确定位神经元培养物的标准化。高质量的细胞培养是数据验证的基石，有助于更简便、快速地进行显微成像，并促进培养体系与实验结果的标准化。微流控装置的设计旨在实现细胞培养的精确控制 体外 组织结构相似 体内单一群体装置可支持长神经突的生长，并便于轴突、神经突和胞体的识别。微流控腔室中接种的细胞数量决定了神经元密度。因此，通过在每个装置中接种较少的细胞，可轻松识别靠近通道的单个神经元。单个神经元的轴突和多个树突在同一条通道内生长，其中树突的生长速度至少比轴突慢5倍。^6,17 2至3周后 体外<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
共培养装置	Ananda Devices		可从 http://www.anandadevices.com 商业购买
神经装置	Ananda Devices		可从 http://www.anandadevices.com 商业购买
1 号圆形玻璃盖玻片，直径 25 mm	Warner Instruments	64-0705
35 mm 玻璃底培养皿，0 号，未包被，经伽马辐照	MatTex Incorporation	P35G-0-20-C
35 mm 细胞培养皿，无热原，无菌	Corning Inc	430165
95 mm × 15 mm 培养皿，可滑动盖，无菌聚苯乙烯	Fisherbrand	FB0875714G
50 mL 离心管，带印刷刻度和平盖	VWR	89039-656
15 mL 聚丙烯锥形管，17 × 120 mm 型，无热原，无菌	Falcon	352097
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049	细胞外溶液
B-27 添加剂（50倍浓度），无血清	B-27 Supplement (50X), serum free	17504044	细胞外溶液
青霉素、链霉素、谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	11995-065	细胞外溶液
200 μL 移液器	VWR	89079-458
2 – 20 μL 移液器	Aerosol Resistant Tips	2149P
BD Falcon 3 mL 转移移液管［非无菌］	BD Falcon	357524
葡萄糖	Gibco	15023-021	细胞外溶液
HEPES	Sigma	7365-45-9	细胞外溶液/微珠
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	细胞外溶液
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7	细胞外溶液
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	细胞外溶液
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3	细胞外溶液
#5 Dumont Dumostar 镊子，11 cm	World Precision Instruments	500233
解剖工具	Braun, Aesculap
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P6407
基于聚苯乙烯的微粒，10 μm	Sigma-Aldrich	72986
硼硅酸盐玻璃管	King Precision Glass, Inc.	14696-2
水平移液管拉制仪	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
显微操作器，PCS-5000 系列	SD Instruments	MC7600R
1 mL 注射器	BD Luer-Lok	309628
倒置显微镜	Olympus	IX71
物镜	Olympus	UIS2, LUCPLFLN 40X
CCD 相机	Photometrics	Cascade II: 512
Leibovitz (1x) L-15 培养基	Life Technologies	11415-064	大鼠解剖
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Life Technologies	25300054	大鼠解剖
DMEM (1x) 改良 Eagle 培养基［含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、110 mg/L 丙酮酸钠］	Life Technologies	11995-065	大鼠解剖
HBSS (1x) Hank's 平衡盐溶液［不含氯化钙、氯化镁、硫酸镁］	Life Technologies	14170-112	大鼠解剖