重连神经元回路：一种实现快速神经突延伸与功能性神经元连接的新方法

摘要

本实验方案描述了如何利用固定在微移液管上、经多聚-D-赖氨酸包被的微珠，引导神经突生长，从而在微流控腔室中快速启动、延伸并连接神经突。

摘要

脑和脊髓损伤可能导致永久性残疾和死亡，因为目前仍无法实现神经元的长距离再生以及与适当靶点的精确重新连接。本文描述了一种可快速启动、延伸并精确建立长距离新功能性神经环路的方法。所达到的延伸速率超过1.2 mm/h，是传统再生速度的30至60倍。 体内 周围神经系统中生长速度最快的轴突的生长速率（0.02 至 0.04 mm/h）²⁸ 比此前报道的同一神经元类型在更早发育阶段的速度快10倍⁴首先，在微流控装置中培养分离的SD大鼠海马神经元群体2至3周，以精确定位细胞位置，便于进行显微操作并确保实验的可重复性。随后，将包被多聚-D-赖氨酸（PDL）的微珠置于神经突上形成黏附接触，通过移液器显微操作移动微珠-神经突复合物。在移动微珠的过程中，可牵拉出新的神经突，其长度可延伸数百微米，并在不到1小时内与靶细胞建立功能性连接。该方法避免了诱导神经突生长的传统化学策略中较慢的局限，实现了实验的可重复性与操作的便捷性。本文展示的初步测量结果显示，神经元生长速率远超生理条件下的水平。上述技术创新相结合，使得在体外培养中以前所未有的精确度构建神经元网络成为可能。该方法为研究神经元网络内的信号传递与通讯机制提供了全新途径，也为探索神经元生长的极限提供了理想的实验平台。其潜在应用与实验前景广泛，对旨在创伤后或神经退行性疾病中重建神经环路的治疗策略具有直接意义。 关键词：微流控装置，海马神经元，多聚-D-赖氨酸，微珠，神经突生长，神经元网络，显微操作，功能性连接，神经再生

引言

成年中枢神经系统（CNS）损伤可能导致永久性残疾，其原因包括多种限制轴突再生的机制¹。损伤后，许多中枢神经系统的轴突无法形成新的生长锥，因而不能启动有效的再生反应²。此外，损伤部位周围组织的破坏及瘢痕组织会显著抑制轴突生长^1,2,3。目前促进损伤后中枢神经系统再生的治疗方法主要集中在增强受损神经元的内在生长能力，以及屏蔽与髓鞘碎片和胶质瘢痕相关的轴突延伸抑制因子^1,3。尽管如此，轴突长距离再生至远端靶区并形成适当功能突触的能力仍然极为有限^4,5,6,7。

在本研究中，利用微珠、移液管显微操作技术和微流控装置，能够快速启动、延伸并精确地在长距离上连接新的功能性神经元回路。先前的研究表明，经多聚-D-赖氨酸包被的微珠（PDL-微珠）可诱导细胞膜黏附，继而引发突触囊泡复合物的聚集以及功能性突触前终扣的形成⁸。研究还发现，当在突触前分化完成后机械性地将PDL-微珠拉离时，突触蛋白簇会随微珠移动，从而启动一条新的神经突起⁹。以下实验流程正是利用这一现象，并结合使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置，将大鼠胚胎海马神经元培养在盖玻片上特定有序区域的能力，实现对神经元回路的精确重构。

这些PDMS微流控装置无毒、光学透明，由通过微通道系统连接的两个腔室组成。当组装在盖玻片上后，每个装置可作为模板引导神经元生长，并在精确的图案上维持健康的神经元培养超过4周。 体外.

在此，提出了一种用于研究新生神经突延伸极限及其功能性的框架。通过该框架可生成新的功能性神经突，并实现神经元网络的可控（重新）连接。在毫米级距离上，神经突的延伸速率超过20 µm/min，并成功建立了功能性连接。这些结果出乎意料地表明，这些神经突在内在伸长能力上远比此前认为的更为迅速。该机械方法绕过了传统的缓慢化学策略，实现了向特定靶点的可控连接。该技术为神经工程和神经修复领域开辟了新的研究途径 体外 研究损伤后恢复神经元连接性的新型疗法。它还可用于操控和重构神经网络，以探究神经元信号处理和神经元功能的基本机制 体外.

方案

以下所述的所有操作程序均经麦吉尔大学动物护理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会的指导方针。

1. 使用微流控装置标准化神经元培养：装置组装

1. 为所需实验选择合适的微流控装置。若需连接同一细胞群内的神经元，请使用神经元装置（图1）；若需连接不同细胞群中的神经元，请使用共培养装置（图6）。
2. 清洗并准备所需数量的无菌盖玻片或玻璃底培养皿。为获得最佳效果，在塑料表面使用35 mm培养皿，在玻璃表面使用25 mm盖玻片或35 mm玻璃底培养皿。根据成像系统选择玻璃厚度，例如0.15 mm。
3. 用0.5–1 mL浓度为100 µg/mL的PDL在室温下孵育2小时或过夜，以包被培养皿或盖玻片。
   注意：此处可暂停实验流程，次日继续操作。此外，也可使用硼酸盐缓冲液稀释的PDL、多聚-L-赖氨酸（PLL）、层粘连蛋白或其他任何细胞黏附分子对培养皿进行包被。
4. 用去离子水清洗培养皿两次（请勿使用磷酸盐缓冲液（PBS），因为盐结晶可能堵塞通道），彻底去除液体后，在无菌环境（如生物安全柜）中干燥5–10分钟，直至表面完全干燥。
   注意：务必确保盖玻片完全干燥，残留液体将影响微流控系统的贴附。
5. 将微流控装置图案面朝上置于无菌环境（生物安全柜）中，在紫外光下照射10分钟。在生物安全柜内操作时，请严格遵守无菌操作规程¹⁰。
6. 使用镊子将微流控装置图案面朝下放置于洁净的盖玻片/培养皿上。用镊子轻轻按压装置，使其牢固贴附于玻璃表面。
   注意：在透光下观察时，贴附区域的透明度可见。请确保所有角落均与玻璃接触。对所有微流控装置重复此操作。参见 图1a。
7. 向单一群体装置中加入培养基时，将移液枪头对准通道，向右上侧孔中加入50 µL含无血清B-27（体积比1:50）和500 µg/mL青霉素/链霉素/谷氨酰胺（统称为NBM）的完全培养基，然后向其对角线方向的孔中再加入50 µL。对所有装置重复此操作，并确保培养基在各孔之间流动。随后，向其余2个孔各加入50 µL培养基。参见 图2a。
   1. 向多群体装置中加入培养基时，将移液枪头对准通道，向右侧各孔中加入30 µL完全NBM，参见 图6a。对所有装置重复此操作，并确保培养基在各孔之间流动。随后，向其余4个孔各加入50 µL培养基。
8. 将装置放入较大的培养板中，并放置一个盛有高压灭菌水的开放培养皿（湿室），然后置于培养箱中（37 °C、5% CO₂ 和95%湿度）孵育1–2小时，同时准备细胞培养。参见 图2b。

2. 在微流控系统中接种神经元

1. 按照参考文献⁸中所述的方案，从Sprague Dawley大鼠胚胎（无论性别）中获取解离的海马或皮层神经元。
2. 将胚胎神经元重悬于NBM中，浓度为每毫升100万至200万个神经元。使用血细胞计数板在显微镜下验证细胞浓度，并参照参考文献⁸。根据所需的细胞密度调整细胞浓度。为提高每个通道获得单根海马轴突的概率，每台设备接种10,000个神经元；若希望在同一通道中存在多根轴突，则每台设备接种60,000个神经元。
   注意：这些数值会因所使用的神经元类型不同而有所变化。
3. 从微流控装置中移除培养基，但不要抽干储液池，每个储液池中保留约5 µL。
4. 对于单一群体装置，向右下储液池加入50 µL NBM。此时培养基会自动流动并填充另一个下部储液池。然后按照图1b所示，向微流控装置的右上储液池中加入20 µL浓缩的细胞悬液。
   1. 对于多群体装置，按照图6a所示，向每个右侧储液池中各加入20 µL浓缩的细胞悬液。
5. 在显微镜下检查细胞是否已进入腔室，并将装置放入培养箱中孵育15–30分钟，以促进细胞贴附于基质。
6. 在显微镜下检查腔室内细胞数量是否充足。若细胞不足，重复步骤2.4和2.5。
7. 向单一群体装置的两个上部储液池各加入50 µL NBM，向多群体装置中接种细胞的同一储液池加入20 µL NBM。此时液面会略微凸起，形成正弯月面，使储液池呈现类似松饼顶部的外观。具体可参见图2a。
8. 将细胞置于37 °C、5% CO₂和95%湿度的环境中培养。

3. 维持神经元培养

1. 在细胞接种至装置后的第二天（即步骤2后的第1天），用移液器吸出约30 µL的NBM培养基，并加入预热的新鲜NBM培养基。
2. 每2天检查一次每个通道中的培养基是否充足。若“muffin top”（液面凸起）较低，只需向顶部孔中补充更多培养基即可。
3. 在移除微流控装置前，至少培养细胞7天。细胞可在这些装置中存活数周。在对样品进行实验前1-2天移除装置。

4. 微流控装置的移除

1. 在移除微流控装置前 1 至 2 天，向每个样品培养皿中加入 2 mL 预热至 37 °C 的 NBM，淹没各腔室，并将装置继续置于培养箱中维持培养。
2. 使用无菌镊子和一个移液枪头，将微流控装置从盖玻片上移除，从而留下神经元的图案化排列。操作时用枪头固定盖玻片，用镊子夹住装置左下角边缘，轻柔施加扭转力，用镊子将装置缓缓提起，使其从盖玻片上剥离。参见 图 2c-2d。
3. 每 2 至 3 天更换一半 NBM，直至样品用于实验。
4. 在对样品进行神经回路重连实验前，需在显微镜下检查单一群体装置通道中的神经突以及多群体装置中各神经元群体之间的间隙，确认其相互隔离，确保无任何纤维连接不同神经元群体。

5. 准备PDL包被的微珠

1. 向1 mL PDL（100 µg/mL）中加入两滴50 µL的4、10或20 µm聚苯乙烯微球水溶液（按1:500稀释）。室温孵育至少2小时。
   注意：此处可暂停实验流程，次日继续操作。
2. 以8,820 × g离心1分钟。小心移除上清液，避免扰动容器底部聚集的微球。
3. 用1 mL无菌HEPES溶液（10 mM，pH 8.4）洗涤微球两次。
4. 将PDL包被的微球重悬于200 µL的10 mM HEPES溶液（pH 8.4）中。

6. 制备微量移液器

1. 使用水平电极拉制仪从玻璃毛细管（内径1 mm，外径1.5 mm）制备移液管。调节仪器参数，使拉制后的微移液管外端尖端直径约为2–5 µm。拉制前，确保玻璃管清洁。
2. 将移液管固定于载玻片上以储存，并确保尖端不接触载玻片表面，因为尖端易碎。在室温下置于带盖容器中保存，以防灰尘污染。移液管应在拉制当天使用。

7. PDL-微珠与神经元的黏附

1. 将步骤5中制备的40–60 µL多聚-D-赖氨酸包被的微珠加入步骤4中制备的细胞培养物中。将移液器吸头对准盖玻片上隐约可见的神经元中心，加入微珠（见图3）。
2. 将样品放回培养箱中孵育1小时，以促进突触连接的形成^8,9。
3. 孵育结束后，用预热的神经元基础培养基（NBM）轻轻洗涤培养物，去除未黏附的微珠。

8. 生理盐水溶液的配制（用于室温实验）

1. 通过混合参考文献中列出的成分来制备生理盐水溶液^7,8以调节细胞环境 外部 培养箱
2. 按照参考文献中所述，检测渗透压和pH值^7,8.
3. 持续用 O 溶液灌注₂ 以尽量减少实验过程中的pH波动。
4. 加热至室温。
5. 通过将一段塑料管的一端（可选尺寸）插入 O 中，建立灌流系统₂灌注生理溶液并将另一端固定在插入样品架中的针头上。将导管和溶液置于样品上方（参见 图4).
   1. 将管路从针头断开，并连接至注射器。使用注射器施加压力并抽吸液体，使管路充满。用滚轮夹封闭管路，重新连接针头。

9. 磁珠微操作

1. 将样品安装在实验装置中，使得细胞可以从上方通过安装在显微操作器上的两根微移液管接触，并从下方进行光学观察，例如使用倒置光学显微镜的40倍相位物镜（数值孔径为0.6）。在此配置下，将CCD相机连接至显微镜的侧端口以捕获图像。通过塑料管将每根移液管连接至1 mL注射器。在此步骤中，用生理盐水溶液（1–2 mL）替换NBM（见图4）。
2. 实验过程中，以0.5–1 mL/min的流速持续灌注第8步配制的生理盐水溶液。
3. 在视野中选择一个未与神经元连接的PDL微珠。通过先聚焦于微珠再上移至微移液管尖端的方式，使微珠与微移液管尖端对齐。通过显微镜监测，将移液管尖端尽可能下移至接近微珠的位置。
4. 使用连接移液管的1 mL注射器施加负压，以吸附微珠。在整个实验过程中保持负压状态。

10. 拉出神经突

1. 在视野中选择一个连接到神经元的PDL微珠，并使用负压将其吸附到第二根微移液管上，操作方法如步骤9.3-9.4所述。
2. 通过缓慢移动（约0.5 µm/min）显微操作仪或样品台1 µm，牵拉PDL微珠-神经元复合物，随后暂停5分钟，以允许神经突起始形成。
3. 重复步骤10.2两次。
   注意：前3 µm的牵拉必须非常缓慢，以确保实验成功，成功率可超过95%。
4. 通过缓慢移动（约0.5 µm/min）显微操作仪或样品台2 µm，牵拉PDL微珠-神经元复合物，随后暂停5分钟，以促进神经突延伸。
5. 在成功完成前5 µm的起始与神经突延伸后，以20 µm/min的速度在毫米级距离上继续牵拉神经突。
   注意：牵拉过程可连续进行，也可分步进行，并可采用不同速率。参见图5b-5c。

11. 连接神经元

1. 选择一个富含神经突的区域，降低PDL-微珠-神经突复合物，使其与目标区域发生物理接触。使用其他微珠来判断探针尖端相对于盖玻片表面的高度。参见图5d。
2. 在操作第二根微移液管时，保持PDL-微珠-神经突复合物与目标神经突接触。将带有第二个PDL-微珠的第二根移液管下降至新形成的神经突上方，距离第一个微珠约20 µm处。利用第二个PDL-微珠将新生的神经突纤维推向目标细胞。
3. 将两个微珠固定至少1小时。通过显微镜检查确认无局灶性肿胀，即与微珠接触的神经突未出现增粗现象¹⁶。
4. 在此期间，通过灌流缓慢将样品的生理盐水更换为预热且已与CO₂平衡的NBM培养基。
5. 通过释放负压使第二根移液管释放微珠。若新生神经突仍保持连接，则同样释放第一个微珠。参见图5e。
6. 轻柔地移除生理盐水溶液，并替换为NBM（约2 mL）。
7. 小心地将样品放回培养箱中，以增强神经元连接，为后续实验做准备。该连接可稳定维持>24小时⁷。

12. 验证新连接的功能性 通过 全细胞配对膜片钳记录

1. 参照参考文献^7,18,19搭建电生理实验装置。
2. 参照参考文献⁷制备突触前和突触后电极。
3. 采集膜片钳数据，方法同样参照参考文献^18,19。
4. 将结果与天然发生的信号⁷进行比较，以确定连接类型。

结果

胚胎大鼠海马神经元在微流控装置中培养，以实现细胞、聚-D-赖氨酸包被的微珠及显微操作工具的精确定位。第一步是将微流控装置正确组装到玻璃盖玻片或培养皿上。必须确保微流控装置牢固地附着于基底表面，以防止细胞从腔室中逸出并移至装置中本应密封的部分下方图1a）。为了维持数周的健康培养，重要的是防止培养基蒸发，应每隔2-3天检查一次细胞培养基，并保持培养基的正弯月面。图2a）。通过将细胞和一个盛有水的敞口培养皿一同置于较大的培养皿内，也可避免培养基蒸发。图2b）。微流控装置可在任意时间移除。为获得最佳效果，建议在移除装置前至少1天将NBM添加至细胞-装置系统中。这样可最大限度地减少细胞应激，因为在移除装置时，神经元已处于适宜温度和pH的培养基环境中。当缓慢地将微流控装置从培养皿上剥离时（图2c 和...

讨论

利用标准的显微操作技术与创新的微流控装置，开发出一种新技术，可快速启动、延伸并精确连接远距离的新功能性神经环路。移液器显微操作是大多数神经科学研究实验室中常用的工具。^4,13实现实验结果可重复且可靠的主要挑战在于，如何在整个实验周期（可能持续数周）内，通过开发微流控装置实现对健康且精确定位神经元培养物的标准化。高质量的细胞培养是数据验证的基石，有助于更简便、快速地进行显微成像，并促进培养体系与实验结果的标准化。微流控装置的设计旨在实现细胞培养的精确控制 体外 组织结构相似 体内单一群体装置可支持长神经突的生长，并便于轴突、神经突和胞体的识别。微流控腔室中接种的细胞数量决定了神经元密度。因此，通过在每个装置中接种较少的细胞，可轻松识别靠近通道的单个神经元。单个神经元的轴突和多个树突在同一条通道内生长，其中树突的生长速度至少比轴突慢5倍。^6,17 2至3周后 体外<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
共培养装置	Ananda Devices		可从 http://www.anandadevices.com 商业购买
神经装置	Ananda Devices		可从 http://www.anandadevices.com 商业购买
1 号圆形玻璃盖玻片，直径 25 mm	Warner Instruments	64-0705
35 mm 玻璃底培养皿，0 号，未包被，经伽马辐照	MatTex Incorporation	P35G-0-20-C
35 mm 细胞培养皿，无热原，无菌	Corning Inc	430165
95 mm × 15 mm 培养皿，可滑动盖，无菌聚苯乙烯	Fisherbrand	FB0875714G
50 mL 离心管，带印刷刻度和平盖	VWR	89039-656
15 mL 聚丙烯锥形管，17 × 120 mm 型，无热原，无菌	Falcon	352097
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049	细胞外溶液
B-27 添加剂（50倍浓度），无血清	B-27 Supplement (50X), serum free	17504044	细胞外溶液
青霉素、链霉素、谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	11995-065	细胞外溶液
200 μL 移液器	VWR	89079-458
2 – 20 μL 移液器	Aerosol Resistant Tips	2149P
BD Falcon 3 mL 转移移液管［非无菌］	BD Falcon	357524
葡萄糖	Gibco	15023-021	细胞外溶液
HEPES	Sigma	7365-45-9	细胞外溶液/微珠
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	细胞外溶液
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7	细胞外溶液
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	细胞外溶液
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3	细胞外溶液
#5 Dumont Dumostar 镊子，11 cm	World Precision Instruments	500233
解剖工具	Braun, Aesculap
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P6407
基于聚苯乙烯的微粒，10 μm	Sigma-Aldrich	72986
硼硅酸盐玻璃管	King Precision Glass, Inc.	14696-2
水平移液管拉制仪	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
显微操作器，PCS-5000 系列	SD Instruments	MC7600R
1 mL 注射器	BD Luer-Lok	309628
倒置显微镜	Olympus	IX71
物镜	Olympus	UIS2, LUCPLFLN 40X
CCD 相机	Photometrics	Cascade II: 512
Leibovitz (1x) L-15 培养基	Life Technologies	11415-064	大鼠解剖
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Life Technologies	25300054	大鼠解剖
DMEM (1x) 改良 Eagle 培养基［含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、110 mg/L 丙酮酸钠］	Life Technologies	11995-065	大鼠解剖
HBSS (1x) Hank's 平衡盐溶液［不含氯化钙、氯化镁、硫酸镁］	Life Technologies	14170-112	大鼠解剖