利用荧光基因编码pH探针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）马氏管上皮细胞内pH进行光学定量

摘要

细胞离子转运通常可通过监测细胞内pH值(pH_i)来评估。基因编码的pH指示剂(GEpHIs) 可对完整细胞中的细胞内pH值进行光学定量。本实验方案详细描述了利用一种伪比率型基因编码pH指示剂pHerry，对黑腹果蝇Drosophila melanogaster马尔皮基氏小管进行细胞ex vivo活体成像，从而实现细胞内pH值的定量分析。

摘要

上皮离子转运对于全身离子稳态以及维持细胞必需的电化学梯度至关重要。细胞内pH（pH_i受多种离子转运蛋白的影响，因此监测pH_i 是评估转运蛋白活性的有用工具。现代基因编码的pH指示剂（GEpHIs）可对pH进行光学定量_i 在完整细胞的细胞级和亚细胞级水平上。本方案描述了细胞内pH的实时定量_i 马尔皮基管（MTs）中的调控 黑腹果蝇 通过 离体 pHerry 的活体成像，一种具有 p 值的伪比率型 GEpHIK_a 非常适合用于追踪细胞质中的pH变化。成年果蝇马尔皮基氏小管（MTs）由形态和功能上截然不同的单层上皮细胞区域组成，可作为研究上皮运输的便捷且遗传上易于操作的模型。与传统的pH敏感性荧光染料和离子选择性电极相比，GEpHIs具有多项优势。只要具备适当的启动子元件，GEpHIs即可特异性地标记不同的细胞群体。这种标记方式在 离体, 体内，以及 原位 制备物本身具有异质性。GEpHIs 还可用于量化 pH_i 在完整组织中长时间成像，无需反复染色或使组织外露。当前基因编码型质子指示剂（GEPHIs）的主要缺点是，在组织损伤或探针过表达情况下，易在细胞质包涵体中聚集。本实验方案通过评估基底侧质子（H⁺）流动，展示了GEPHIs的这些局限性、相应的解决方案及其固有优势。⁺在提取的果蝇马氏管的功能不同的主细胞和星状细胞中进行转运研究。所述技术和分析方法可轻松适用于多种脊椎动物和无脊椎动物样本，该检测方法的复杂程度可根据需求调整，既可用于教学实验，也可用于通过特定转运体进行离子流的精细测定。

引言

本实验方案的目的是描述细胞内pH（pH_i) 使用基因编码的pH指示剂（GEpHI）并演示如何利用该方法评估基底外侧H⁺ 在一种模式昆虫中的运输D. melanogaster肾脏结构，即马尔皮基管（Malpighian tubule, MT）。MT 是果蝇的排泄器官，在多个关键方面其功能类似于哺乳动物的肾单位¹马氏管在果蝇的胸部和腹部呈两对排列（前部和后部）。每根马氏管由单层上皮细胞构成的管状结构组成，其上皮细胞主要为代谢活跃的主细胞，具有明显的顶端（管腔侧）和基底外侧（血腔侧）极性，此外还含有散在的星状细胞。前部马氏管由三个在形态、功能及发育上均不同的区段组成，分别为起始膨大部分、过渡段以及与输尿管相连的分泌主段。²在细胞水平上，上皮细胞通过顶膜质膜上的V-ATPase将离子转运至管腔³ 和一种碱金属/H⁺ 交换器以及基底外侧的 Na⁺- K⁺-ATP酶⁴内向整流性K⁺ 通道⁵，Na⁺驱动的 Cl⁻/HCO₃⁻ 交换体（NDAE1）

方案

本方案中的所有步骤均符合梅奥诊所（明尼苏达州罗切斯特）动物使用指南。

1. 果蝇饲养

1. 按照标准饲养条件培养果蝇并设置杂交²⁹。
   注意：GAL4/UAS系统驱动的荧光报告基因表达水平与温度成正比，因此可通过调整培养温度来改变表达水平。虽然较高的表达水平通常可获得更好的信噪比，但在使用GFP与红色荧光蛋白（RFP）融合构建体（如pHerry）时，高表达也常伴随细胞质和细胞器内聚集物的增加^10,30,31。若无法避免聚集现象，仍可通过在每次实验中进行点校准并对数据进行归一化处理来实现定量分析，使荧光比值为1.0时对应细胞内pH值（pH_i）为7.0（参见步骤7.4下方关于校准的说明）。
2. 将纯合的capaR-GAL4³²雄蝇与纯合的UAS-pHerry¹⁰ virgin雌蝇杂交，以及将纯合的c724-GAL4²雄蝇与纯合的UAS-pHerry virgin雌蝇杂交，以....

结果

健康组织以及正确识别前段中肾管（MTs）对于本实验方案的成功至关重要。在解剖过程中，应避免直接接触中肾管，仅可通过输尿管进行操作，因为直接夹持中肾管会导致其断裂（图4A–B）。将中肾管平铺于载玻片时，应尽量减少对小管的触碰并避免过度移动，以免损伤单层上皮细胞（图4C）。正确解剖的前段中肾管应表现为上皮细胞胞质内红色和绿色荧光均匀分布，并具有形态上可区分的小管节段。因灌注不当或操作失误而受损的中肾管会表现出红色荧光聚集，且无对应的绿色荧光聚集；而误识别的后段中肾管则从前端盲端至远端输尿管呈现一致的形态特征（图4D）。

必须通过生理学评估和形态学检查来确认pHerry的正常功能。验证pH感应功能是否正常的最便捷方法是施加NH₄Cl梯度处理。

讨论

pH 定量的成功_i 在 果蝇 MTs 的质量完全取决于提取的 MTs 的健康状况以及封片和解剖的质量（图 A - C）。因此，必须严格按照所述方法小心处理组织。新涂有PLL的载玻片能显著促进微管（MT）的贴附，因为其黏附性明显优于曾接触过溶液的载玻片。精细的贴片操作也有助于识别微管的不同区段图 D健康的微管（MTs）通过减少mCherry的聚集，分别促进pHerry的校准和功能评估，从而实现对酸排出更为一致的定量。在某些情况下，由于实验条件本身可能损伤微管上皮或导致荧光报告基因显著过表达，因此无法避免mCherry的聚集。在此类情况下，可采用伪比率校准方法，将荧光比值归一化，使比值1.0对应于pH_i 7.0，并通过点校准实现定量（图 E进行点校准时应格外小心，避免将成像和灌流系统的永久性部件暴露于尼日霉素（nigericin）中，因为该离子载体易吸附于玻璃和塑料表面。若实验操作在实验过程中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-L-赖氨酸（PLL）溶液	Sigma-Aldrich	P4832	4 °C 保存，可重复使用。
尼日利亚菌素钠盐	Sigma-Aldrich	N7143	注意：需戴手套操作。用DMSO配制成20 mM储备液，分装后于4 °C保存。
带粘性边缘的灌流室盖玻片，粘性区域直径1 mm，腔室直径×厚度为9 mm × 0.9 mm，接口直径1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	可根据灌流系统需要替换。
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	多家供应商有售。
焊接辅助支架（Helping Hands Soldering Stands）	Harbor Freight Tools	60501	多家供应商有售。
开放式重力驱动灌流系统，带阀门控制器，8进1出分流管及储液槽	Bioscience Tools	PS-8S	可使用任何功能相当的灌流系统。
流速调节器	Warner Instruments	64-0221	可根据灌流系统需要替换。
Schneider培养基	Fisher Scientific	21720024	以无菌分装形式于4 °C保存。
#5 不锈钢镊子	Fine Science Tools	11252-20	可根据实验人员习惯替换。
35 × 10 mm 聚苯乙烯培养皿	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	品牌和尺寸无严格要求。
75 × 25 mm 显微镜载玻片	Corning Life Sciences	2949-75X25	只要与灌流槽兼容，品牌和尺寸可变动。
含细丝的硼硅酸盐毛细玻璃管，内径1.5 mm，外径0.86 mm，壁厚0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	细丝非必需，玻璃管可根据灌流管路和灌流槽进行替换。
Tygon 管路，内径1/16"，外径1/8"，壁厚1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	多家供应商有售，可根据灌流系统替换。
真空硅脂	Sigma-Aldrich	Z273554	多家供应商有售。
塑料流量控制夹	Fisher Scientific	05-869	多家供应商有售，无需无菌。
玻璃棒，直径5 mm	delphiglass.com	9198	尺寸依个人偏好而定，多家供应商可选。
PAP 疏水笔	Sigma-Aldrich	Z377821	多家供应商有售。
密封膜	Sigma-Aldrich	P7668	多家供应商有售。
15 mL Falcon 管	BD Falcon	352096	多家供应商有售。
50 mL Falcon 管	BD Falcon	352070	多家供应商有售。
HEPES；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸	Sigma-Aldrich	H3375	多家供应商有售。
MES；4-吗啉乙磺酸一水合物	Sigma-Aldrich	69892	多家供应商有售。
TAPS；N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸	Sigma-Aldrich	T5130	多家供应商有售。
10倍/0.45 数值孔径空气物镜	Zeiss	000000-1063-139	可使用功能相当的物镜。单细胞成像可使用40倍物镜。
解剖体视显微镜	Zeiss	Discovery.V8	可使用任何类型的解剖体视显微镜。
UAS-pHerry 转基因 Drosophila melagnogaster	可从Romero实验室获取		首次发表：引文10
capaR-GAL4 驱动品系 Drosophila melagnogaster	可从Romero实验室获取		首次发表：引文32
c724-GAL4 驱动品系 Drosophila melagnogaster	可从Romero实验室获取		首次发表：引文2
单色高灵敏度数码相机	Zeiss	Axiocam 506 mono	品牌和型号可变动，可用任何适用于活细胞成像的单色高灵敏度相机替代。
GFP/FITC滤光片组，激发470/40 nm，发射515 nm长通，二向色镜500 nm	Chroma	CZ909	可使用任何GFP/FITC滤光片组替代。
RFP/TRITC滤光片组，激发546/10 nm，发射590 nm长通，二向色镜565 nm	Chroma	CZ915	可使用任何GFP/FITC滤光片组替代。
倒置落射荧光显微镜	Zeiss	Axio Observer Z.1	可使用任何具备电动滤光片切换功能的类似显微镜。直立显微镜可配合开放式灌流槽和水浸物镜使用。
统计分析软件	Microcal	Origin 6.0	可使用功能相当的软件替代。
图像分析软件	美国国立卫生研究院	ImageJ 1.50i	可使用功能相当的软件替代。
图像采集软件	Zeiss	Zen 1.1.2.0	可使用功能相当的软件替代。
单刃碳钢剃刀片	Electron Microscopy Sciences	71960	多家供应商有售。
显微镜载玻片收纳盒	Fisher Scientific	16-04	多家供应商有售。
本生灯	Fisher Scientific	50-110-1231	多家供应商有售。
带棉塞的聚苯乙烯果蝇培养管	Genesee Scientific	32-109BF	可使用类似产品替代。
2.5 L 实验室冰桶	Fisher Scientific	07-210-129	多家供应商有售。
NMDG；N-甲基-D-葡糖胺	Sigma-Aldrich	M2004	多家供应商有售。
200 uL 防污染移液器吸头	MidSci	AV200	多家供应商有售。
200 μL 可调体积移液器	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	多家供应商有售。