利用荧光基因编码pH探针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）马氏管上皮细胞内pH进行光学定量

摘要

细胞离子转运通常可通过监测细胞内pH值(pH_i)来评估。基因编码的pH指示剂(GEpHIs) 可对完整细胞中的细胞内pH值进行光学定量。本实验方案详细描述了利用一种伪比率型基因编码pH指示剂pHerry，对黑腹果蝇Drosophila melanogaster马尔皮基氏小管进行细胞ex vivo活体成像，从而实现细胞内pH值的定量分析。

摘要

上皮离子转运对于全身离子稳态以及维持细胞必需的电化学梯度至关重要。细胞内pH（pH_i受多种离子转运蛋白的影响，因此监测pH_i 是评估转运蛋白活性的有用工具。现代基因编码的pH指示剂（GEpHIs）可对pH进行光学定量_i 在完整细胞的细胞级和亚细胞级水平上。本方案描述了细胞内pH的实时定量_i 马尔皮基管（MTs）中的调控 黑腹果蝇 通过 离体 pHerry 的活体成像，一种具有 p 值的伪比率型 GEpHIK_a 非常适合用于追踪细胞质中的pH变化。成年果蝇马尔皮基氏小管（MTs）由形态和功能上截然不同的单层上皮细胞区域组成，可作为研究上皮运输的便捷且遗传上易于操作的模型。与传统的pH敏感性荧光染料和离子选择性电极相比，GEpHIs具有多项优势。只要具备适当的启动子元件，GEpHIs即可特异性地标记不同的细胞群体。这种标记方式在 离体, 体内，以及 原位 制备物本身具有异质性。GEpHIs 还可用于量化 pH_i 在完整组织中长时间成像，无需反复染色或使组织外露。当前基因编码型质子指示剂（GEPHIs）的主要缺点是，在组织损伤或探针过表达情况下，易在细胞质包涵体中聚集。本实验方案通过评估基底侧质子（H⁺）流动，展示了GEPHIs的这些局限性、相应的解决方案及其固有优势。⁺在提取的果蝇马氏管的功能不同的主细胞和星状细胞中进行转运研究。所述技术和分析方法可轻松适用于多种脊椎动物和无脊椎动物样本，该检测方法的复杂程度可根据需求调整，既可用于教学实验，也可用于通过特定转运体进行离子流的精细测定。

引言

本实验方案的目的是描述细胞内pH（pH_i) 使用基因编码的pH指示剂（GEpHI）并演示如何利用该方法评估基底外侧H⁺ 在一种模式昆虫中的运输D. melanogaster肾脏结构，即马尔皮基管（Malpighian tubule, MT）。MT 是果蝇的排泄器官，在多个关键方面其功能类似于哺乳动物的肾单位¹马氏管在果蝇的胸部和腹部呈两对排列（前部和后部）。每根马氏管由单层上皮细胞构成的管状结构组成，其上皮细胞主要为代谢活跃的主细胞，具有明显的顶端（管腔侧）和基底外侧（血腔侧）极性，此外还含有散在的星状细胞。前部马氏管由三个在形态、功能及发育上均不同的区段组成，分别为起始膨大部分、过渡段以及与输尿管相连的分泌主段。²在细胞水平上，上皮细胞通过顶膜质膜上的V-ATPase将离子转运至管腔³ 和一种碱金属/H⁺ 交换器以及基底外侧的 Na⁺- K⁺-ATP酶⁴内向整流性K⁺ 通道⁵，Na⁺驱动的 Cl⁻/HCO₃⁻ 交换体（NDAE1）⁶和 Na⁺- K⁺-2Cl⁻ 共转运蛋白（NKCC；Ncc69）⁷，而星状细胞介导 Cl^- 和水分运输^8,9该复杂但易于研究的生理系统，结合多种遗传学和行为学研究工具，为内源性离子转运机制的探究提供了极佳的机会。 黑腹果蝇.

本实验方案的设计 rationale 在于建立一个遗传上易于操控的系统，用于研究上皮细胞离子转运，并具备从细胞水平到行为水平进行整合的潜力，且可将相关工具推广至其他模式系统。通过在马尔pHerry¹⁰（一种由绿色pH敏感的超级荧光蛋白 super-ecliptic pHluorin^11,12（SEpH）与红色pH不敏感的mCherry¹³融合而成的GEpHI）的表达，结合高K⁺/尼日里菌素（nigericin）校准技术¹⁴，可在单个马尔皮尼管细胞中定量测定H⁺转运。由于多种离子转运体均参与H⁺当量的转运，细胞内pH_i的定量可作为多种转运体介导离子运动的功能性指标。Drosophila马尔皮尼管这一模型系统还提供了强大的遗传工具，可用于组织特异性转基因¹⁵和RNA干扰（RNAi）¹⁶表达，并可与细胞成像及整体器官功能检测方法^17,18,19相结合，从而构建出一个从分子到行为实现纵向整合的强有力工具集。这与许多传统的上皮生物学研究方法形成鲜明对比，因为历史上此类测量往往依赖复杂且困难的显微解剖技术、精密的离子选择性电极^20,21，以及价格昂贵、加载条件苛刻、在异质组织中细胞特异性差的pH敏感性染料²²。GEpHIs已被广泛用于多种细胞类型中pH_i的测定²³。早期研究利用绿色荧光蛋白（GFP）固有的pH敏感性来监测培养的上皮细胞中的pH_i²⁴，但在过去二十年中，GEpHIs已应用于神经元²⁵、胶质细胞²⁶、真菌²⁷和植物细胞²⁸。结合GAL4/UAS表达系统¹⁵实现遗传构建体的细胞靶向表达，以及Drosophila马尔皮尼管在生理上的可及性，使该体系成为研究pH_i调控和上皮离子转运的理想模型。

细胞内pH（pH_i）的调节已研究数十年，对生命活动至关重要。Drosophila 马尔pighian小管（MT）制备物为教学提供了稳定的模型，可用于讲授pH_i调节的生理学机制，同时也适用于在离体（ex vivo）和在体（in vivo）条件下开展复杂的pH_i调节研究。本实验方案描述了利用NH₄Cl脉冲酸负荷技术定量测定果蝇MT上皮细胞基底侧膜H⁺转运的方法²¹。由于所用pH指示剂为基因编码，因此该方法及其理论框架可推广应用于任何适合转基因操作并能进行活体成像的研究体系。

方案

本方案中的所有步骤均符合梅奥诊所（明尼苏达州罗切斯特）的动物使用指南。

1. 果蝇饲养

1. 按照标准饲养方法培育果蝇并设置杂交组合²⁹。
   注：GAL4/UAS系统驱动的荧光报告基因表达水平与温度成正比，因此可通过调整培养温度来改变表达水平。虽然高表达水平通常可获得更好的信噪比，但在使用pHerry等GFP与红色荧光蛋白（RFP）融合构建体时，也常伴随细胞质和细胞器内聚集物的增加^10,30,31。若聚集无法避免，仍可通过在每次实验中进行点校准并对数据进行归一化处理来实现定量分析，使荧光比值为1.0时对应pH_i 7.0（见步骤7.4下方关于校准的注释）。
2. 将纯合的capaR-GAL4³²雄蝇与纯合的UAS-pHerry¹⁰ virgin雌蝇杂交，同时将纯合的c724-GAL4²雄蝇与纯合的UAS-pHerry virgin雌蝇杂交，以便分别对马氏管（MT）主细胞和星状细胞中的pH_i进行成像。将6只UAS-pHerry雌蝇与3只GAL4雄蝇放入装有新鲜培养基的新试管中，并在28 °C下交配。
   注：通常在4天内可见幼虫，成虫约在第10天开始羽化。
3. 在羽化后收集雌蝇，并在28 °C下饲养10天以达到所需年龄。
   注：实验时间可根据需与活细胞内pH成像相关联的行为学限制性实验（如Ramsay分泌实验^17,19）进行调整。雄蝇也可使用，但雌蝇的马氏管通常更大且更健壮。

2. 聚-L-赖氨酸载玻片的制备。

1. 使用疏水性PAP笔在标准75 x 25 mm载玻片顶部绘制一个40 x 20 mm的边框，并在室温下静置干燥15分钟。如果载玻片与成像光学系统不兼容，请使用较大的盖玻片。
2. 将2 mL储存液浓度为0.01%的多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液转移至每张载玻片上，并在室温下静置1小时。
3. 用移液器吸除多余的PLL溶液。将溶液保存在50 mL锥形管中以备后续使用。4 °C保存。
4. 用真空管线抽吸残留的任何溶液。将真空管线在载玻片整个表面移动，确保载玻片上无残留液体。
5. 使用前在室温下再静置1小时。可将载玻片干燥保存于标准载玻片盒中，室温下最多保存1个月。

3. 解剖皿和玻璃棒的准备

1. 在室温下，将0.5 mL弹性体固化剂加入4.5 mL弹性体基础液中，置于35 × 10 mm的聚苯乙烯培养皿中，使液体深度达到5 mm。使用一次性移液器吸头混合均匀。让弹性体在室温下过夜固化。
   注意：弹性体应透明且无气泡。浇注后将弹性体平板置于真空容器中10–15分钟，有助于去除气泡。
2. 用手握住一根直径为5 mm的玻璃棒，将其中部置于点燃的本生灯上加热熔化，同时向两端拉伸。当玻璃熔化时加快拉伸速度，以形成细长（0.1 mm）且呈锥形的杆部（图1）。
   注意：杆部形成约45°的倾斜角通常有助于操作微管。可通过在拉伸杆部时降低一只手的高度来实现（见图1）。
3. 使用单刃碳钢剃须刀片的钝边在细杆中部将其折断。在解剖显微镜下检查玻璃棒的细端，确保断裂面平整清洁。

图1：制备用于操作马氏管的玻璃棒。
A - E：加热并拉伸玻璃棒以形成适合操作马氏管（MTs）的锥形末端和角度的过程。箭头表示施加力的方向和大小。F：制作合适的玻璃工具的照片。比例尺 = 10 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 溶液与灌流系统的准备

注意：灌流系统的制造商不同，其设计也有所差异。本方案基于一种重力驱动的8通道开放式储液槽，配备输入流速调节器和真空驱动的流出装置，但此处所述的微管（MTs）安装方法可适用于任何灌流系统。

1. 配制以下溶液：
   1. 分装 Schneider 培养基（每 50 mL 锥形管中加入 40 mL），4 °C 保存。
   2. 配制溶液（即 昆虫磷酸盐缓冲液（iPBS）及含NH的iPBS₄根据需要在室温下用 Cl 处理 表1将溶液在实验当天使用前升温至室温。
      注意：iPBS 及含 40 mM NH₄Cl 的 iPBS₄Cl 可大量制备（1 L 或更多），并在 4 °C 下保存。
   3. 配制8份500 mL的校准溶液，pH值分别为5.0、6.0、6.5、7.0、7.3、7.6、8.0和9.0，具体如下所示 表1 4 °C下保存。使用N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）和HCl滴定调节各溶液的pH。
   4. 实验当天，将5 mL校准溶液 aliquots 升温至室温，加入贮存态尼日霉素溶液（20 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO）），使其终浓度为10 µM。
      警告：操作尼日利亚菌素时需佩戴手套。所有接触过尼日利亚菌素的设备均应视为一次性用品。尼日利亚菌素会残留在玻璃和塑料器皿上，若重复使用相关设备，将影响生物样品的完整性。
2. 灌注系统：
   1. 用ddH₂O填充所有储液器，以启动灌注系统₂O (图2）。依次打开各通道，使所有靠近流速调节器的管路充满液体。
      注意：可能需要打开堵塞的通道，并使用推杆推动储液池中的液体流动，以排除管路中的气泡。
   2. 打开2个通道并加入ddH₂O₂O以排空。当储液槽几乎排空时，将第一个储液槽加入iPBS，第二个储液槽加入NH₄Cl-脉冲iPBS。将流速调节器调至最大流速，使每种溶液流动1分钟以填充远端管路，然后停止流动。图2).
   3. 在成像显微镜载物台上放置两组焊台“辅助手”夹具，成像平台两侧各放一个夹具。
   4. 小心地将一段毛细玻璃管（内径1.5 mm，外径0.86 mm，长度100 mm）的远端0.5英寸在本生灯上加热。通过让远端在重力作用下自然弯曲，并在达到所需45°角度时将玻璃管移离火焰，形成弯折。对另一段毛细玻璃管重复此操作。
   5. 将弯曲的玻璃毛细管分别插入进液管路和连接真空的出液管路中，并固定于“辅助固定手”装置上，使其与显微镜成像平台对齐图3).

图2：灌注系统与成像配置。
通过同步活体荧光成像和快速溶液交换，评估肾小管基底外侧转运功能所需的生理学实验组件。图中所示气体管路为可选配置，可用于拓展实验以评估HCO₃^-的转运功能。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：用于NH₄Cl脉冲实验的灌注装置流路示意图。
箭头表示流体路径及阀门切换点。溶液依靠重力从储液池流向样品，再通过真空抽吸从样品室被引流至废液瓶。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 成年个体的解剖 黑腹果蝇 前部马氏管

1. 从第3节中取出解剖皿和拉制好的玻璃棒，从第2节中取出PLL包被的载玻片，以及粘性灌流小室分隔器、真空脂、一条4 × 2英寸的封口膜、两对#5精细镊子，还有40 mL冰上预冷的Schneider培养基和室温的iPBS。
2. 将真空脂涂抹在封口膜上，然后将粘性灌流小室分隔器压在封口膜上，使底部均匀涂上真空脂。取下灌流小室分隔器，将其涂有真空脂的一面朝下放置在PLL包被的载玻片上。移除分隔器，留下由疏水性真空脂勾勒出的独立样本小室。
3. 在PLL包被载玻片上由真空脂围成的小室内加入200 µL室温iPBS，并将载玻片置于体视显微镜下。
4. 将UAS-pHerry/capaR-GAL4果蝇放入空的果蝇管中，置于冰上麻醉10分钟。
   注意：与CO₂麻醉不同，此方法可确保果蝇不会脱水。
5. 将冰上预冷的Schneider培养基倒入解剖皿中，在解剖体视显微镜下用精细镊子将一只麻醉后的雌蝇转移至解剖皿中。
6. 用一对镊子夹住果蝇的胸部，另一对镊子轻轻夹住腹部后端。以短促而有控制的动作拉开果蝇的后腹部。当后肠可见时，夹住其远端，通过反复轻拉将后肠连同马氏管（MTs）从下方的气管组织中分离出来。
   注意：前、后马氏管在中肠与后肠连接处的输尿管部位可见。最先游离的一对通常是环绕后肠的后部马氏管，可忽略不计（图4A）。
7. 当第二对马氏管从腹部完全游离后，用精细镊子在输尿管处夹断前部马氏管。此举可将前部马氏管与肠道分离，并封闭输尿管。
8. 用拉制好的玻璃棒挑起游离的前部马氏管，将玻璃棒从输尿管下方滑入，使马氏管自然垂落于玻璃棒两侧，然后垂直向上将马氏管从溶液中提起。
9. 旋转玻璃棒，使马氏管和输尿管贴附于玻璃棒底面，再将输尿管垂直向下放置于载玻片上。通过将输尿管压在载玻片表面，固定输尿管并密封马氏管的远端。操作过程中应尽量减少对马氏管的扰动。最终马氏管应悬浮于溶液中，而输尿管则锚定在载玻片上（图4B）。
10. 使用玻璃棒的细端，轻轻将每根马氏管沿载玻片表面扫过。将玻璃棒抵住载玻片以避免压碎马氏管，从远端向近端方向推动玻璃棒，使其滑过马氏管上方，从而将整根马氏管牢固贴附于PLL包被的载玻片表面（图4C）。
11. 将粘性灌流小室分隔器重新放回载玻片上，形成一个覆盖固定马氏管的小型液体腔室。
12. 将样本置于显微镜载物台上。将灌流系统的进液和出液毛细管分别对准灌流腔室的进、出口。
    注意：若需使用开放式灌流腔室，可不使用小室分隔器。此时可将进液和出液毛细管分别置于成像腔室的相对两侧。

6. 成像方案与小管健康的验证

注意：本实验方案在倒置宽场落射荧光显微镜上进行，配备 GFP（SEpH）和 RFP（mCherry）滤光片组（470/40 nm 激发（ex），515 nm 长通发射（em），500 nm 二向色镜；以及 546/10 nm 激发，590 nm 长通发射，565 nm 二向色镜）、10X/0.45 数值孔径为 0.45 的干式物镜、用于活细胞成像的单色相机及成像软件。该方案可适配任何具备 GFP 与 RFP 光学通道自动切换功能和图像采集软件的正置或倒置显微镜，但最佳曝光时间、光照强度和像素合并参数会有所不同。在所有分析中，应在每个通道中选择无荧光背景区域作为背景对照，进行背景扣除后，以感兴趣区域（ROI）内的平均像素强度来分析荧光强度。

1. 打开显微镜、光源和成像系统。
2. 启动配套的成像软件。
3. 通过目镜观察，手动调节焦距，直至在透射光下清晰可见微管（MT）的管腔。
4. 在图像分析软件中点击“采集”选项卡，在“采集模式”部分的“Binning”下拉菜单中选择“2x2”。
5. 将5%中性密度滤光片插入光路，以降低照明光强并最小化光漂白。
6. 在“Channels”菜单中点击GFP（SEpH）通道，然后点击“Live”以通过相机观察荧光信号。
7. 调节“Time”滑块，设置曝光时间，使强度直方图中最亮像素值约为最大值的40%，然后点击“Stop”停止照明。
8. 在RFP（mCherry）通道中重复步骤6.6–6.7，并确认前段微管起始段扩张的存在，以及细胞质中无mCherry聚集体（后者提示组织损伤或过表达）（图4D）。
   注意：扩张段应清晰可见，因其为微管最靠近起始的部分，其内腔直径比相邻过渡段约大20 µm。2×2像素合并通常已足够，但可进一步增加以降低所需照明强度。典型曝光时间为每通道150–800 ms。应使用尽可能低的光照以最小化光漂白。最小化光漂白对于使用pHerry等双荧光探针至关重要，因为两种荧光团可独立漂白，从而破坏任何比值校准的准确性。
9. 通过点击“Time Series”复选框启用延时成像程序。
10. 在“Time Series”部分的下拉菜单中将“Duration”调整为10分钟，并将“Interval”滑块设为0，以设置总采集时间并实现最大图像采集速率。通常0.2 Hz的总采集速率已足够。
11. 在“Channels”部分同时勾选GFP（SEpH）和RFP（mCherry）通道。
12. 通过激活相应的阀门控制器打开灌流系统的iPBS通路，并点击“Start Experiment”开始成像程序。1分钟后，打开相应阀门并关闭iPBS通路，切换至NH₄Cl脉冲溶液20秒，随后关闭NH₄Cl通路并重新打开iPBS阀门，恢复iPBS灌流。在停止灌流系统前，确保完成整个成像程序。
    注意：延时分析应显示mCherry信号稳定，而SEpH信号在NH₄Cl存在时上升，洗脱后淬灭，并逐渐恢复。
13. 进行两点校准。
    1. 通过从载玻片上剥离移除小室分隔器，并从成像小室中移除灌流毛细管和夹具。
    2. 使用200 µL移液器向成像小室中加入200 µL校准用iPBS（pH 7.4，10 µM尼日霉素）。用移液器吸出溶液，再加入200 µL校准液。重复此过程4次，以确保溶液完全置换。
    3. 将样本在校准液中孵育30分钟后再进行成像。使用步骤6.6–6.11中确定的相同参数重复成像程序，仅将图像采集时间修改为1分钟。
       注意：本步骤无需使用灌流系统和毛细管，不应将其连接至成像小室，以避免毛细管接触尼日霉素。
    4. 使用200 µL移液器向成像小室中加入200 µL校准用iPBS（pH 9.0，10 µM尼日霉素）。用移液器吸出溶液，再加入200 µL校准液。重复此过程4次，以确保溶液完全置换。
    5. 将样本在第二种校准液中孵育10分钟后再进行成像。重复步骤6.13.3中的成像程序。
    6. 在图像分析软件中查看采集的图像序列，通过点击“Mean ROI”并使用“Frame”滑块滚动图像序列，确认任一通道均无像素饱和，同时观察强度直方图中报告的数值未达到最大可检测值。若任何帧中存在达到最大可检测强度的像素，则需降低曝光时间或照明强度，并重复第6节。
       注意：一旦确定成像参数，在不同实验或校准之间不得更改，除非每次样本均进行点校准（见步骤8.3）。
14. 分析图像序列，绘制荧光强度和荧光比值（SEpH/mCherry）随时间变化的曲线。
    1. 点击“Mean ROI”并选择自由绘制工具。按住左键沿微管绘制约50 µm长度。右键结束绘制选区，然后在微管邻近区域重复操作以定义背景选区（图5A）。
    2. 点击“Measurements”下的“Mean Intensity”。通过点击“Export > Data Table > Create”创建强度值数据表。
    3. 点击配置齿轮图标，仅保留“Time”和“Mean Intensity”参数，取消选择其他所有参数。右键新建数据表标签，选择“Save As”，并将数据导出为.csv文件。
       注意：也可使用ImageJ等免费软件进行类似测量。
    4. 打开电子表格程序，通过选择“Data”选项卡后点击“From Text”导入数据表。
    5. 使用电子表格函数，在每个时间点从SEpH信号强度中减去SEpH背景强度。对mCherry信号重复此过程。
    6. 选择包含时间和背景校正后强度数据的列，点击“Insert > Scatter (Charts) > Scatter with Straight Lines”，绘制各通道强度随时间变化的曲线（图5B）。
    7. 使用电子表格函数计算每个时间点的SEpH/mCherry荧光比值。
    8. 选择包含时间和比值数据的列，点击“Insert > Scatter (Charts) > Scatter with Straight Lines”，绘制荧光比值随时间变化的曲线（图5C）。

7. 马氏管中pHerry的完全校准 离体.

1. 按照第5节所述方法解剖并安装一套新鲜的前部中肾小管（MTs）。
2. 按照步骤6.13.2所述，将iPBS更换为校准用iPBS（pH 7.4，含10 µM尼日里菌素），孵育30分钟。
3. 定位中肾小管（MTs），并按照步骤6.1–6.11所述采集SEpH/mCherry成对图像。随后按照步骤6.13.4所述，将溶液更换为另一份校准用iPBS储备液，静置10分钟后再次成像。重复此过程，直至在所有溶液中均完成SEpH/mCherry比值的成像。最后获取pH 9.0条件下的图像，因为样本在高pH后通常难以恢复。
4. 按照步骤6.14.9所述，绘制8个样本中SEpH与mCherry荧光比值随设定pH_i变化的关系图。使用Boltzmann曲线拟合校准数据，获得完整的校准函数，如公式1所示（图5D）。若数据不一致，可将每个样本的校准数据集进行归一化处理，使荧光比值为1.0时对应pH_i为7.0，然后重新分析（图5E）。
   注意：若采用后一种方法，则每次独立实验需进行内部点校准³³（见下文定量分析步骤（步骤8.3））。
5. 公式1
   
   其中R为SEpH/mCherry比值，A₁、A₂、x_o和dx为曲线拟合参数，分别代表最小荧光比值、最大荧光比值、pK_a以及函数宽度。x_o为pHerry的表观pK_a，其值根据细胞类型和具体校准条件的不同，通常在7.1至7.4之间变化。

8. 基底外侧酸排出的定量分析 离体 马氏管上皮

1. 同时成像表达pHerry的星形细胞和表达pHerry的主要细胞。
   1. 从前方解剖MTs UAS-pHerry/capaR-GAL4 按第5节所述操作果蝇，但不要将MTs从解剖用Schneider培养基转移至成像孔中。
   2. 从前方解剖MTs UAS-pHerry/c724-GAL4 使用第5节所述步骤，在同一解剖培养皿中处理果蝇。
   3. 将两组MTs按照步骤5.8 - 5.11所述转移至同一成像孔中。
      注意：当将微管（MTs）的臂部扫向载玻片时，应将微管（MTs）的臂部 UAS-pHerry/c724-GAL4 以及 UAS-pHerry/capaR-GAL4 使小管彼此靠近，以便在同一视野中观察表达pHerry的主细胞和星状细胞（图6A).
2. 应用 NH₄Cl预脉冲，如步骤6.12所述。
   注意：如果需要保持一致的校准（图4B）无法实现时，通过设定pH进行单点校准_i 每次实验结束时，在移除粘附式灌流小室分隔器和灌流设备后，使用校准用iPBS（pH 7.0，10 µM 尼日霉素，孵育30分钟）将pH调至7.0。
3. 使用方程2对来自不同MT节段的星形细胞和主细胞的荧光信号轨迹进行校准（根据需要采用绝对比值或归一化比值），并分析NH₄Cl去除后的恢复相₄通过使用统计分析软件对指数衰减函数进行拟合，分析Cl⁻外流，并记录衰减常数（τ）图6B).
   公式 2
   
   其中 R = SEpH/mCherry 比值，A₁，A₂, x_o，以及 dx 是通过第7.4步校准确定的曲线拟合参数（公式 1).
   1. 计算酸外排速率（J_H+，参见 公式 3) 作为 pH 的函数_i 以校正静息 pH 值的差异_i 不同制备样品间的酸负荷³⁴. 使用步骤 8.3 中推导出的指数函数来计算 pH 的导数_i 关于每个时间间隔中的时间。
      公式 3
      
   2. 计算固有缓冲能力（β）_i; 方程 4细胞质在该pH下的)_i 根据先前文献（参见 公式 4).
      注意：在 黑腹果蝇，对β最全面的表征_i 来自幼虫运动神经末梢³⁵ 在缺乏其他可用数据的情况下，可认为这些数据适用于MT细胞。
      公式 4
      
   3. 计算 β 的乘积_T （从步骤 8.3.2 开始）_和 dpH_i/dt （从步骤 8.3.1 开始）以确定 J_H+ (公式 3).
      注意：在本方案所述的名义上无碳酸氢盐的溶液中，碳酸氢盐衍生的缓冲能力（β_b) 假定约为 0 mM。总缓冲能力（β_T) 是 β 的总和_i 和_βb，因此β_{i =} β_T 在缺乏 HCO 的情况下₃^-/CO₂³⁶.
   4. 绘制 J 图_H+ 作为 pH 的函数_i 在步骤6.14.9所述的每个时间间隔开始时。
   5. 对所有数据集中重叠的 pH 区域部分应用指数衰减函数_i 使用统计分析软件。比较所得函数的变化率，以比较细胞与微管节段之间的酸排出速率。图6C).
      注意：用于曲线拟合的最适函数并不总是单指数函数。如果其他函数能改善拟合优度，可替换使用。
   6. 计算酸通量（参见 公式 5) 作为 pH 的函数_i 以校正细胞大小和形状的差异。
      公式 5
      
      注意：细胞尺寸可直接在图像中测量，或进行近似估算。主细胞可表示为中空管状结构的一半，其尺寸如下：内径 24 µm，外径 48 µm，高 50 µm。过渡型星状细胞形态多变，但大致可表示为高 50 µm、直径 10 µm 的圆柱体。参见最后一段 代表性结果 如下。
   7. 对所有数据集中重叠的 pH 范围部分应用指数衰减函数_i 使用统计分析软件。比较所得函数的变化率，以比较细胞与MT节段之间的酸通量图6D).

结果

健康的组织以及正确识别前段中肾管（MTs）对于本方案的成功至关重要。在解剖过程中，应避免直接接触MTs，仅可通过输尿管进行操作，因为直接夹持MTs会导致其断裂（图4A - B）。当将MTs轻轻展平于载玻片上时，应尽量减少对小管的触碰，并避免过度移动，否则会损伤单层上皮细胞层（图4C）。正确解剖的前段MTs在上皮细胞胞质中会显示出均匀分布的红色和绿色荧光，并具有形态上可区分的小管节段。因灌注不当或操作失误而受损的小管会表现出红色荧光聚集，且无对应的绿色荧光聚集；而误识别的后段MTs则从近端盲端到远端输尿管呈现出均一的形态（图4D）。

必须通过生理学评估和形态学来确认 pHerry 的正常功能。验证其正确 pH ...

讨论

pH 定量的成功_i 在 果蝇 MTs 的质量完全取决于提取的 MTs 的健康状况以及封片和解剖的质量（图 A - C）。因此，必须严格按照所述方法小心处理组织。新涂有PLL的载玻片能显著促进微管（MT）的贴附，因为其黏附性明显优于曾接触过溶液的载玻片。精细的贴片操作也有助于识别微管的不同区段图 D健康的微管（MTs）通过减少mCherry的聚集，分别促进pHerry的校准和功能评估，从而实现对酸排出更为一致的定量。在某些情况下，由于实验条件本身可能损伤微管上皮或导致荧光报告基因显著过表达，因此无法避免mCherry的聚集。在此类情况下，可采用伪比率校准方法，将荧光比值归一化，使比值1.0对应于pH_i 7.0，并通过点校准实现定量（图 E进行点校准时应格外小心，避免将成像和灌流系统的永久性部件暴露于尼日霉素（nigericin）中，因为该离子载体易吸附于玻璃和塑料表面。若实验操作在实验过程中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-L-赖氨酸（PLL）溶液	Sigma-Aldrich	P4832	4 °C 保存，可重复使用。
尼日利亚菌素钠盐	Sigma-Aldrich	N7143	注意：需戴手套操作。用DMSO配制成20 mM储备液，分装后于4 °C保存。
带粘性边缘的灌流室盖玻片，粘性区域直径1 mm，腔室直径×厚度为9 mm × 0.9 mm，接口直径1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	可根据灌流系统需要替换。
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	多家供应商有售。
焊接辅助支架（Helping Hands Soldering Stands）	Harbor Freight Tools	60501	多家供应商有售。
开放式重力驱动灌流系统，带阀门控制器，8进1出分流管及储液槽	Bioscience Tools	PS-8S	可使用任何功能相当的灌流系统。
流速调节器	Warner Instruments	64-0221	可根据灌流系统需要替换。
Schneider培养基	Fisher Scientific	21720024	以无菌分装形式于4 °C保存。
#5 不锈钢镊子	Fine Science Tools	11252-20	可根据实验人员习惯替换。
35 × 10 mm 聚苯乙烯培养皿	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	品牌和尺寸无严格要求。
75 × 25 mm 显微镜载玻片	Corning Life Sciences	2949-75X25	只要与灌流槽兼容，品牌和尺寸可变动。
含细丝的硼硅酸盐毛细玻璃管，内径1.5 mm，外径0.86 mm，壁厚0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	细丝非必需，玻璃管可根据灌流管路和灌流槽进行替换。
Tygon 管路，内径1/16"，外径1/8"，壁厚1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	多家供应商有售，可根据灌流系统替换。
真空硅脂	Sigma-Aldrich	Z273554	多家供应商有售。
塑料流量控制夹	Fisher Scientific	05-869	多家供应商有售，无需无菌。
玻璃棒，直径5 mm	delphiglass.com	9198	尺寸依个人偏好而定，多家供应商可选。
PAP 疏水笔	Sigma-Aldrich	Z377821	多家供应商有售。
密封膜	Sigma-Aldrich	P7668	多家供应商有售。
15 mL Falcon 管	BD Falcon	352096	多家供应商有售。
50 mL Falcon 管	BD Falcon	352070	多家供应商有售。
HEPES；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸	Sigma-Aldrich	H3375	多家供应商有售。
MES；4-吗啉乙磺酸一水合物	Sigma-Aldrich	69892	多家供应商有售。
TAPS；N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸	Sigma-Aldrich	T5130	多家供应商有售。
10倍/0.45 数值孔径空气物镜	Zeiss	000000-1063-139	可使用功能相当的物镜。单细胞成像可使用40倍物镜。
解剖体视显微镜	Zeiss	Discovery.V8	可使用任何类型的解剖体视显微镜。
UAS-pHerry 转基因 Drosophila melagnogaster	可从Romero实验室获取		首次发表：引文10
capaR-GAL4 驱动品系 Drosophila melagnogaster	可从Romero实验室获取		首次发表：引文32
c724-GAL4 驱动品系 Drosophila melagnogaster	可从Romero实验室获取		首次发表：引文2
单色高灵敏度数码相机	Zeiss	Axiocam 506 mono	品牌和型号可变动，可用任何适用于活细胞成像的单色高灵敏度相机替代。
GFP/FITC滤光片组，激发470/40 nm，发射515 nm长通，二向色镜500 nm	Chroma	CZ909	可使用任何GFP/FITC滤光片组替代。
RFP/TRITC滤光片组，激发546/10 nm，发射590 nm长通，二向色镜565 nm	Chroma	CZ915	可使用任何GFP/FITC滤光片组替代。
倒置落射荧光显微镜	Zeiss	Axio Observer Z.1	可使用任何具备电动滤光片切换功能的类似显微镜。直立显微镜可配合开放式灌流槽和水浸物镜使用。
统计分析软件	Microcal	Origin 6.0	可使用功能相当的软件替代。
图像分析软件	美国国立卫生研究院	ImageJ 1.50i	可使用功能相当的软件替代。
图像采集软件	Zeiss	Zen 1.1.2.0	可使用功能相当的软件替代。
单刃碳钢剃刀片	Electron Microscopy Sciences	71960	多家供应商有售。
显微镜载玻片收纳盒	Fisher Scientific	16-04	多家供应商有售。
本生灯	Fisher Scientific	50-110-1231	多家供应商有售。
带棉塞的聚苯乙烯果蝇培养管	Genesee Scientific	32-109BF	可使用类似产品替代。
2.5 L 实验室冰桶	Fisher Scientific	07-210-129	多家供应商有售。
NMDG；N-甲基-D-葡糖胺	Sigma-Aldrich	M2004	多家供应商有售。
200 uL 防污染移液器吸头	MidSci	AV200	多家供应商有售。
200 μL 可调体积移液器	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	多家供应商有售。