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人诱导性多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案用于神经毒性检测

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DOI：

10.3791/55702

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2017年6月9日

 ,  ,  , 
1Directorate F - Health, Consumers and Reference Materials, Joint Research Centre

本文内容

摘要

人诱导多能干细胞（hiPSCs）被认为是药物和化学物质筛选以及新药开发的有力工具 体外 用于毒性测试（包括神经毒性）的模型。本文描述了一种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为神经元和胶质细胞的详细方案。

摘要

人类多能干细胞可分化为多种细胞类型，可用于基于人类细胞的体外毒性检测。其中一大优势在于，通过重编程体细胞获得人诱导多能干细胞（hiPSCs）可避免使用人胚胎干细胞（hESCs）所涉及的伦理和立法问题。hiPSCs能够扩增并高效分化为多种神经元和胶质细胞，可作为毒性测试的实验系统，尤其适用于评估参与神经毒性的不同信号通路。本研究描述了一种将hiPSCs分化为神经元与胶质细胞混合培养物的实验方案。文中明确了神经元分化过程中被调控和/或激活的信号通路。这些信息对于将该细胞模型应用于新的毒性测试范式至关重要，在该范式中，化学物质的评估依据是其干扰生物通路的能力。作为概念验证，使用线粒体呼吸链复合物I抑制剂鱼藤酮来评估Nrf2信号通路的激活情况，该通路是调控抗氧化反应元件（ARE）介导的细胞防御机制以抵抗氧化应激的关键因子。

引言

美国国家研究委员会报告1 设想了一种新的毒性测试范式，其中监管毒性测试将从依赖动物中观察到的表型变化的方法，转向关注作用机制的 体外 使用人类细胞的检测方法。多能干细胞（PSC）衍生物可能作为癌细胞模型的替代方案，因为所获得的细胞更接近人体组织的生理状态，可为研究化学物质诱导的不良效应提供更具相关性的工具。目前在基础研究和再生医学领域广泛应用的两种最有前景的用于毒性测试的PSC培养类型是人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs）。2,3这一专长如今可用于开发一类新型的毒理学方法 体外 旨在识别与不良效应发生相关的受干扰生理通路的检测方法 在体内然而，基于人胚胎干细胞（hESCs）的监管安全评估测试方法可能因涉及伦理问题以及各国对胚胎来源细胞使用的立法政策不同，而难以被所有欧盟成员国及全球各国所接受。

hiPSCs 具有与 hESCs 相似的特征4,5 并具有巨大的应用潜力 体外 方法，既可用于确定治疗靶点，也可用于安全性评估。此外，hiPSC技术克服了供体来源有限以及胚胎来源细胞所涉及的伦理问题。hiPSC面临的主要挑战在于证明这些细胞能够可重复地生成多种具有毒理学相关性的细胞衍生物，并表现出典型的人体组织特征与反应。通常采用预设水平的选定标志物来表征分化后细胞群体的特性，并评估分化过程的稳定性。

既往研究评估了hiPSCs生成神经元与胶质细胞混合培养物的适用性，并考察了线粒体呼吸链复合物I抑制剂鱼藤酮对Nrf2通路活化的影响，该通路是多种细胞类型中抗氧化防御机制的关键调控因子6,7。

本研究描述了一种将hiPSCs分化为神经元和胶质细胞混合培养物的实验方案，并提供了神经元/胶质细胞分化过程中被激活的信号通路（基因和蛋白水平）的详细信息。此外，本研究还展示了代表性结果，说明如何利用该hiPSC来源的神经元和胶质细胞模型评估急性（24小时）鱼藤酮处理所诱导的Nrf2信号通路激活，从而实现对氧化应激诱导的评估。

IMR90成纤维细胞由I-Stem（法国）通过使用pMIG载体病毒转导2种转录因子（Oct4和Sox2）重编程为hiPSCs6。类似的hiPSC模型也可应用。以下所述的方案总结了hiPSCs向神经干细胞（NSCs）分化，以及进一步向终末分化神经元和胶质细胞混合培养物分化的所有阶段（步骤1和2，有关该方案的详细描述请参见EURL ECVAM DBALM网站）8。

步骤3和4详细描述了另一种用于分离、扩增、冷冻保存以及进一步将神经干细胞（NSCs）分化为混合神经元和胶质细胞的方案（有关该方案的详细说明，请参见EURL ECVAM DBALM网站）9。步骤5描述了可在细胞承诺和分化各个阶段用于评估细胞表型特征的分析方法。

方案

1. 人诱导性多能干细胞（hiPSC）扩增

注意：可在含有 mTeSR1 培养基（含按制造商说明配制的 mTeSR1 5x 添加剂）的适宜蛋白混合物包被的基质上培养 hiPSCs（每 60 mm 培养皿接种约 100 个克隆片段）。当 hiPSC 克隆生长至适当大小时（参见图 2A中的克隆示例），按以下方法传代细胞（每周一次）。

  1. 使用符合 hESC 标准的基底膜基质（下文简称“合格基质”）或其他合适的蛋白基质包被培养皿。
    1. 将合格基质（参见材料表）以 200 µL 分装液的形式储存于 -80 °C，使用预冷的 1.5 mL 离心管以及预冷的 5 或 10 mL 移液器操作。
    2. 传代前，将 200 µL 合格基质置于冰上解冻。
    3. 将 200 µL 合格基质加入 20 mL DMEM/F12 培养基中稀释（1:100 稀释）。
    4. 用上述溶液包被 60 mm 培养皿（每皿 5 mL）。
    5. 将包被好的培养皿在 37 °C 下孵育至少 1 小时。
  2. hiPSC 克隆片段的冷冻保存与复苏
    1. 在切割 hiPSC 克隆后（hiPSC 克隆切割步骤见 1.3），轻柔缓慢地将 hiPSC 克隆片段重悬于干细胞冻存液中，约 100 个片段/250 µL（参见材料表）。
    2. 将克隆片段分装至适合冷冻保存的冻存管中（每管 250 µL）。
    3. 将冻存管放入装有 2-丙醇的容器中，并将容器置于 -80 °C 保存至少 2 小时，最长可达 2 周。
    4. 将冻存管转移至液氮罐的气相中保存。
    5. 恢复培养时，将一管冷冻样品在 37 °C 水浴中解冻。
    6. 使用 1、2 或 5 mL 移液器，将 hiPSC 克隆片段轻柔收集至含 7 mL 预热完全 hiPSC 培养基的 15 mL 离心管中（参见材料表）。
    7. 以 130 × g 离心 3 分钟，收集 hiPSC 克隆片段。
    8. 吸除上清液，使用 1、2 或 5 mL 移液器将 hiPSC 克隆片段轻柔重悬于 1 mL 完全 hiPSC 培养基中。
    9. 再用 3 或 4 mL 完全 hiPSC 培养基进一步稀释细胞悬液。
    10. 将 hiPSC 克隆片段接种至经合格基质包被的 60 mm 培养皿中（约 100 个片段/皿；培养皿包被方法见步骤 1.1）。
    11. 将 hiPSC 细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
    12. 每天进行完全换液。
  3. hiPSC 克隆的传代
    注意：未分化的 hiPSC 应呈圆形，具有较大的核仁且胞质不丰富。未分化的克隆应表现为扁平且紧密排列的形态。仅应选择未分化的克隆（直径约 1 mm）进行切割传代。
    1. 使用 1 mL 注射器连接 30G 针头或任何其他市售工具，在体视显微镜下（4 倍放大）于室温超净台中将干细胞克隆切割为约 200 µm × 200 µm 的小方块（参见材料表）。
    2. 使用 200 µL 移液器轻柔吹打培养基底部，使克隆片段从培养皿表面脱离。
    3. 将克隆片段（约 100 片）转移至已包被合格基质-DMEM/F12 的培养板中，该板内含 4 mL 完全 hiPSC 培养基（参见材料表；培养皿包被方法见步骤 1.1）。
    4. 将新培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
    5. 每天进行完全换液，并使用相差显微镜在 4 倍和 10 倍放大下观察克隆形态。

2. 将 HiPSC 分化为混合神经元和胶质细胞

注意：该实验流程大约需要28天完成，主要步骤如图1（上半部分）所示。

人诱导多能干细胞向神经元/胶质细胞分化；示意图；IMR90-人诱导多能干细胞向神经元分化过程的显微镜观察
图1：神经元分化方案的示意图 （上部分）可将 IMR90-hiPSC 克隆切割成片段以形成拟胚体（EBs）。2 天后 体外 （体外培养天数，DIV），可将拟胚体接种于层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿中，并在神经外胚层诱导（NRI）培养基中培养，以生成神经外胚层衍生物（类胚体样结构，即“神经球”，此处用巢蛋白（绿色）和 β-III-微管蛋白（红色）染色标记）。神经球可经消化解离、收集后重新接种于层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿中，在神经元分化（ND）培养基中进一步分化为成熟的神经元（NF200，红色）和胶质细胞（GFAP，绿色）。 （下图）由神经球获得的神经干细胞（NSCs，巢蛋白，红色）可在神经诱导（NI）培养基中扩增，或进行冻存，或在神经元分化（ND）培养基中进一步分化，形成包含神经元（NF200，绿色）和胶质细胞（GFAP，红色）的混合培养物。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 类胚体（EBs）的生成（第0天 → 第1天）
    注意：该操作需要良好的手动操作技能和精确性。为了在后续步骤中获得均一的胚胎体（EBs），人诱导多能干细胞（HiPSC）克隆碎片应大小一致。形态学上已分化的克隆（具有较大的细胞质区域和较小的核仁）应予以弃用。
    1. 在切割未分化的 hiPSC 克隆（直径约 1 mm，参见）之前，更换 hiPSC 培养基（每 60 mm 培养皿加入 3 mL） 图 2A在无菌条件下（如步骤1所述）。
    2. 切割未分化的克隆（如图所示） 图 2A 和 图2B) 切割成大小约 200 µm x 200 µm 使用1 mL注射器配30G针头，在室温下的超净工作台中，以体视显微镜4倍放大倍率进行操作。
    3. 使用200-µL 用移液管轻轻吸取下方培养基，使组织块悬浮。
    4. 使用1 mL、2 mL或5 mL移液器将所有脱落的碎片和培养基转移至15 mL离心管中。
    5. 用 2 mL 完全 hiPSC 培养基冲洗培养皿，以回收所有碎片。
    6. 以 112 × g 离心 1 分钟。
    7. 吸弃上清液，用 5 mL 完全 hiPSC EB 培养基轻柔重悬细胞团块（参见 材料表).
    8. 将菌落碎片接种于60 mm超低吸附培养皿中（每60 mm培养皿5 mL）。
    9. 将培养皿在37°C下孵育过夜 37 °C 和5% CO2.
    10. 第二天（第1天），使用1、2或5 mL移液器将EBs及其培养基收集至15 mL离心管中。
    11. 将EBs在112 x g下离心1分钟。
    12. 小心吸除上清液，并用1、2或5 mL移液器将EBs轻轻重悬于5 mL完全hiPSC EB培养基中。
    13. 将EBs重铺至新的60 mm超低吸附培养皿中（每60 mm培养皿加入5 mL）。
    14. 将培养皿在过夜孵育于 37 °C 和5% CO2.
  2. 第1天，用基底膜基质包被培养皿（例如， matrigel（下文简称为“标准基质”）或其他任何合适的蛋白质底物（例如层粘连蛋白
    1. 储存标准基质（参见 材料清单) 在 -80 °C 在200-µL 使用预冷的1.5 mL离心管和预冷的5或10 mL移液器分装样品。
    2. 解冻 200 µL 标准基质置于冰上。
    3. 稀释 200 µL 在20 mL DMEM/F12培养基中加入标准基质（1:100稀释）。
    4. 用该溶液包被60 mm培养皿（每皿5 mL）。
    5. 将包被好的培养皿置于培养箱中孵育 37 °C 过夜。
      注意：这些培养皿将用于接种胚胎体（约50个胚胎体/皿），以生成神经上皮团块（类玫瑰花结结构）；参见步骤2.3。
  3. 神经上皮聚集体（玫瑰花结）的生成（第2 → 7天）
    1. 第2天，从60 mm培养皿中移除标准基质包被溶液（无需冲洗培养皿），每皿加入5 mL完全型神经上皮诱导培养基（NRI）；参见 材料表.
    2. 将悬浮的EBs（来自步骤2.1.14）用移液器转移至包被的培养皿中（约50个EBs/皿） 200 µL 在体视显微镜下以4倍放大倍数进行移液操作，并置于超净工作台内。
      注意：必须选择大小均一、中等尺寸的拟胚体（EBs，约200-300 µm 直径）。过小的拟胚体在神经外胚层分化过程中可能存活率较低，而过大的拟胚体则容易发生中心坏死。
    3. 将培养皿置于培养箱中孵育 37 °C 和 5% CO2.
    4. 第二天（第3天），在10倍显微镜下检查培养皿，确保所有拟胚体均已贴壁。
    5. 轻柔地用完全NRI培养基进行全量换液。
    6. 每隔一天更换一次NRI培养基，直至第7天，此时应可见神经上皮细胞聚集体（玫瑰花环状结构）。
    7. 第7天，按照步骤2.2所述，将标准基质（或层粘连蛋白）包被到所需规格的培养板或培养皿上：96孔板（100 µL/well），24孔板（250 µL/well），12孔板（500 µL/well），MEA芯片（用于电活动检测，1 mL/单孔芯片），或60 mm培养皿（4 mL/皿）。
    8. 将包被的培养板/培养皿在37°C下孵育至少2小时 37 °C 和5% CO2.
  4. 莲状体解离与神经元分化（第8 → 28天）
    注意：该操作需要良好的手动操作技能和精确性。为避免收集到中胚层和内胚层细胞，仅应解离并收集外胚层类玫瑰花结结构。
    1. 第8天，在10倍放大倍数的体视显微镜下，于无菌条件下使用1 mL注射器配30G针头将玫瑰花环样结构切割成小片段。注意，当针头接触时，玫瑰花环样结构容易从培养皿上脱落。
    2. 使用200-µL 移液器
    3. 将培养皿转移至超净工作台，使用1、2或5 mL移液器将莲座状片段及其培养基收集至15 mL锥形管中。用2 mL NRI培养基冲洗培养皿，以回收所有片段。
    4. 以 112 × g 离心 2 分钟，使莲座叶碎片沉淀。
    5. 吸除上清液。
    6. 轻轻将沉淀重悬于1 mL 1×DPBS（不含钙和镁）中，并使用1,000-µL 用移液器部分解离。
    7. 加入4 mL完全NRI培养基，使用台盼蓝和自动细胞计数仪对细胞进行计数（参见 材料清单)
      注意：稀释 20 µL 细胞悬液的 20 µL 台盼蓝。如果细胞无法制成单细胞悬液，则可省略此步骤。如果类胚体聚集体尚未完全解离，可将约50个类胚体/60 mm培养皿来源的聚集体重新悬浮于50 mL完全NRI培养基中，并按所述方法接种。 表1.
    8. 吸出培养皿、培养板和/或MEA芯片中的标准基质（或层粘连蛋白）包被液（来自步骤2.3.7），切勿使其干燥。
    9. 根据研究计划，将细胞接种于完全NRI培养基中（约15,000个细胞/cm²）2；参见 表1 用于指示铺板体积）。
    10. 37 °C，过夜孵育培养板 37 °C 和5% CO2.
    11. 第10天，使用完全神经元分化培养基（ND）进行完全换液；参见材料表。
    12. 每周更换两次完全ND培养基，直至第28天。
    13. 表征神经元/胶质细胞衍生物，如步骤5所述（参见 表2 一般可接受标准）。

3. 由人诱导多能干细胞衍生的神经干细胞（NSC）扩增及其向混合神经元和胶质细胞的分化

注意：源自玫瑰花结片段的神经干细胞（NSCs）可按照下述步骤进行扩增和维持培养（图1，下部）。此方法可用于增加细胞数量，以用于分化及化学物质测试。

  1. 用 5 mL 标准基质 DMEM/F12 包被液包被一个 60 mm 培养皿（或 T-25 培养瓶），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 2 小时（如步骤 2.2 所述）。
  2. 将来自步骤 1–2 的类胚体片段（见步骤 2.4）在 15 mL 圆底离心管中以 112 × g 离心 2 分钟。
  3. 用 5 mL 神经诱导培养基（NI）轻柔重悬沉淀；参见材料表。
  4. 将细胞转移至已包被标准基质的 60 mm 培养皿（或 T-25 培养瓶）中。
  5. 在 NI 培养基中培养类胚体来源的神经干细胞（NSCs），每隔一天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。
  6. 当细胞汇合时，按以下步骤传代 NSCs。
    注意：NSCs 约每周传代一次；可根据实验计划考虑使用新近包被的培养皿、培养瓶或培养板。
  7. 吸除完全 NI 培养基，并用不含钙和镁的 DPBS 轻柔清洗 NSCs。
  8. 向含有细胞的 60 mm 培养皿（或 T-25 培养瓶）中加入 1.5 mL 预热至 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，放入培养箱中孵育 1 分钟。
  9. 轻敲培养皿（或培养瓶）使细胞脱落。
  10. 加入 1.5 mL 预热至 37 °C 的胰蛋白酶抑制剂，并将细胞转移至 15 mL 离心管中。
  11. 用等体积（1.5 mL）的完全 NI 培养基冲洗培养皿（或 T-25 培养瓶），并将冲洗液收集至同一 15 mL 离心管中。
  12. 以 130 × g 离心 3 分钟。
  13. 吸除上清液，使用 1,000-µL 移液器将细胞轻柔重悬于 1 mL 完全 NI 培养基中。
  14. 再用 3 或 4 mL 完全 NI 培养基稀释细胞悬液，使用台盼蓝染色和自动细胞计数仪进行细胞计数。
  15. 将 NSCs 以约 50,000 个细胞/cm2 的密度接种至步骤 3.1 中的 60 mm 培养皿（或 T-25 培养瓶）中。
  16. 每隔一天进行一次完全培养基更换。
  17. 按照步骤 5 所述方法对细胞进行神经元/胶质细胞衍生物的鉴定。
    注意：NSCs 可在完全神经分化培养基（ND 培养基）中分化为神经元与胶质细胞的混合培养物（如步骤 2.4.11–2.4.13 所述），每周更换两次完全 ND 培养基，持续 21 天。

4. 人诱导多能干细胞来源的神经干细胞冻存与复苏

注意：按照本方案操作后，可在传代时将神经干细胞（NSCs）冻存并重新解冻使用。

  1. 将传代的NSCs（来自步骤3.12）在130 × g下离心3分钟。
    注意：细胞应在步骤3.14中进行计数。
  2. 用冷冻保存培养基（见材料表）轻柔缓慢地重悬NSCs，使细胞密度为3 × 106/mL。
  3. 将细胞分装至适合冷冻保存的冻存管中（每管约0.5 mL，含1.5 × 106个细胞/管）。
  4. 将冻存管放入装有2-丙醇的容器中，并将容器置于-80 °C环境中，至少2小时，最长可达2周。
  5. 将冻存管转移至液氮罐的气相中长期保存。
  6. 恢复细胞培养时，将一管冷冻细胞在37 °C水浴中解冻。
  7. 使用1,000-µL移液器，将细胞轻柔收集至含有7 mL预热完全NI培养基的15-mL离心管中。
  8. 在130 × g下离心细胞3分钟。
  9. 吸除上清液，使用1,000-µL移液器将细胞轻柔重悬于1 mL完全NI培养基中。
  10. 将细胞悬液进一步用3或4 mL完全NI培养基稀释，使用台盼蓝染色和自动细胞计数仪进行细胞计数（注意：取20 µL细胞悬液与20 µL台盼蓝混合；解冻后细胞活力应≥ 80%）。
  11. 以约50,000个细胞/cm2的密度将NSCs接种于包被的60-mm培养皿（或T25培养瓶）中。

5. 人诱导多能干细胞分化神经元和胶质细胞的表征

注意：分化后，可使用多种技术对神经元和胶质细胞衍生物进行表征，例如下述各节中所述的方法。

  1. 定量实时 PCR（qPCR）分析10
    1. 以 130 × g 离心 hiPSC 克隆片段、拟胚体（EBs）和/或神经干细胞（NSCs）3 分钟。
    2. 用适量 RNA 提取试剂盒提供的冷 RNA 裂解缓冲液重悬细胞沉淀，体积为 100 µL。
    3. 或者，直接从培养板中收集神经元/胶质细胞衍生物：吸除培养基后，向孔中加入冷 RNA 裂解缓冲液以收集细胞。
    4. 按照试剂盒制造商的说明提取 RNA。
    5. 使用合适的 RNA 反转录为 cDNA 试剂盒，对 500 ng 总 RNA 进行反转录。
    6. 使用适当的预混液和引物组合进行 qPCR 反应，每个样本设两个复孔（参见材料表）。
    7. 实时记录荧光信号：共 45 个循环，引物退火温度为 60 °C。
    8. 以 GAPDH 和 β-actin 作为内参基因对 RNA 相对表达量进行归一化，并以未分化的 hiPSC 或未经处理的细胞作为校准样本（ΔΔCt 法）。也可采用其他合适的分析方法。
  2. 免疫细胞化学与高内涵成像（HCI）6,11
    1. 用冷的 4% 多聚甲醛在室温下固定 hiPSC 克隆、NSCs 和/或神经元/胶质细胞衍生物，孵育 15 分钟。
    2. 用 1× PBS 轻柔洗涤细胞，并将培养板在 4 °C 下保存，最长可保存 1 个月。
    3. 准备染色时，在通透缓冲液（含 0.1% Triton-X-100 和 3% BSA 的 1× DPBS）中室温孵育 15 分钟以通透细胞。
    4. 移除通透缓冲液，加入封闭缓冲液（3% BSA/1× DPBS）在室温下孵育 15 分钟，以阻断抗体的非特异性结合。
    5. 移除封闭缓冲液，加入含适当一抗的封闭缓冲液，在 4 °C 下过夜孵育（参见材料表）。
    6. 用 1× PBS 洗涤细胞 3 次。
    7. 在含荧光标记二抗的封闭缓冲液中室温孵育 45 分钟，同时用 DAPI 染色细胞核（参见材料表）。
    8. 若具备条件，使用合适的高内涵成像平台对平均荧光强度及各类细胞的相对百分比进行定量分析（参见材料表）。
      备注：为确定荧光背景强度，可将部分细胞/孔仅与二抗共同孵育。可对活体（未固定）未分化 hiPSC 进行流式细胞术分析，以评估 PSC 特异性标志物（如 SSEA4）的表达情况（参见材料表）。未分化的 hiPSC 克隆可使用市售的 BCIP/NBT 试剂盒检测碱性磷酸酶活性，操作按制造商说明进行（参见材料表）。此外，还可进行反向蛋白阵列（RPPA）检测与分析，方法见参考文献 12（所用抗体列表参见材料表）。
  3. 电生理学测量13
    1. 将解离的神经管样结构片段（接种后第 7 天）或由神经管样结构衍生的 NSCs 接种于包被过的多电极阵列（MEA）芯片上（参见材料表），使用完全神经分化培养基（每单孔 MEA 芯片接种约 1 × 105 个细胞）。
    2. 在完全神经分化培养基中分化培养 3 周，每周更换培养基两次。
    3. 分化结束后，在超净台中用半透膜密封 MEA 芯片，以保持培养物无菌，便于多次测量。
    4. 将其中一个电极替换为接地参考电极，以便从其余电极进行记录。
    5. 使用配备集成温度控制系统的 MEA 放大器，在 37 °C 和 5% CO2 条件下记录平均放电频率（MFR；每分钟脉冲数）。
    6. 根据阈值（-4.7σ）从 MEA 原始数据中检测信号峰（σ 表示基础噪声的标准差）。
    7. 使用合适的软件对记录后的数据进行处理。

结果

未分化人诱导多能干细胞的表征

为评估hiPSCs的表型，应进行集落/细胞形态学分析、多能干细胞特异性标志物检测，并检测基因表达和碱性磷酸酶活性。未分化的hiPSCs应呈圆形，具有较大的核仁，且胞质不丰富。大多数集落应表现为扁平且紧密排列的形态，提示处于未分化状态（图2A 和 图2B）。此外，超过80%的集落应呈碱性磷酸酶活性染色阳性（图2C）。

通过免疫细胞化学和流式细胞术检测，约80%的细胞应呈典型的多能性相关标志物阳性，如Oct4、SSEA3、SSEA4和Tra1-60（图2D-H），而nestin+和β-III-Tubulin+细胞的比例应显著较低（分别约为8%和3%，见图2H）。这些结果在连续传代中应可重复。

干细胞表征；Oct4、SSEA3、Tra1-60 染色的显微镜图像；流式细胞术和 DAPI 图表。
图2. 未分化 IMR90-hiPSCs 的表征。 (A 和 B) 未分化 IMR90-hiPSC 克隆的代表性相差显微图像（10X 和 20X 放大倍数）。 (C) 碱性磷酸酶染色克隆的代表性图像（4X 放大倍数）。 (D–F) 免疫细胞化学染色的代表性图像：(D) Oct4（红色）、(E) SSEA3（绿色）和 (F) Tra1-60（绿色）。 (G) 通过流式细胞术分析的 SSEA1（CD15）与 SSEA4 染色的代表性点图。 (H) 柱状图显示经 DAPI 复染并由高内涵成像（HCI）定量的 Oct4+（约 75–80%）、Tra1-60+（约 75–80%）、SSEA3+（约 75–80%）、nestin+（约 10–15%）和 β-III-tubulin+（约 3–7%）细胞的百分比，数据为 3 至 5 次生物学重复实验的均值 ± 标准误（SEM）（该图修改自参考文献6）。请点击此处查看该图的放大版本。

通过拟胚体形成评估多能性

人诱导多能干细胞（hiPSC）具有多能性，即在适当条件下能够表达与三个胚层相关的基因。为评估hiPSC的多能性，可采用一种基于自发形成拟胚体（EB）的常用方法，该方法可诱导三个胚层的形成14。对各胚层特异性基因的分析必须显示内胚层（甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白18（KRT18））、外胚层（Nestin、SRY框1（Sox1）和成对盒6（Pax6））以及中胚层（利钠肽A（NPPA）和Brachyury-T）相关基因表达随时间逐渐增强（图3A 和 图3B）；参见 材料表。

类胚体形成显微镜图像及显示分化阶段的 mRNA 表达柱状图。
图3. 通过类胚体（EB）形成评估多能性。 (A) 第1天类胚体的代表性相差显微图像。(B) 柱状图显示中胚层（NPPA 和 brachyury）、外胚层（Pax6、Sox1 和 nestin）以及内胚层（AFP 和 KRT18）基因的qPCR分析结果，数据经参考基因β-actin和GAPDH归一化，并以未分化细胞（第0天）为对照进行校准。采用ΔΔCt法，结果为5次独立实验的平均值±标准误（S.E.M.）。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；图表改编自参考文献6。请点击此处查看该图的高清版本。

诱导神经元和胶质细胞分化

IMR90-iPSCs 可根据 图1 所示步骤及方案部分中的说明，分化为由终末分化神经元和胶质细胞组成的混合培养物。将拟胚体接种至含完全NRI培养基的标准基质或层粘连蛋白包被培养皿中后5-8天，应开始出现类玫瑰花环样结构（图4A）。此类玫瑰花环结构的特征是存在巢蛋白+细胞（神经前体细胞，约90%），仅有少量β-III微管蛋白+细胞（已定向的神经元细胞，约5-10%），后者通常主要位于玫瑰花环结构的周边区域（图4B，第12天的玫瑰花环结构）。

将莲座状结构解离后，在含完全神经分化培养基的条件下，接种至层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿或板中，细胞开始分化为神经元和胶质细胞的混合培养物，并逐渐形成由神经突束连接的神经元胞体簇（图4C 和 图4D）。在分析由莲座状结构来源的神经干细胞扩增后分化为神经元和胶质细胞所获得的神经元群体时，应得到类似结果。由莲座状结构扩增的神经干细胞应呈巢蛋白+（图4E，插图显示巢蛋白+细胞）。

经过21天的分化后，细胞应表达β-III-微管蛋白、NF200、Tau以及树突晚期标志物MAP2。图4D，4F 和图 4H），至少有 10 - 15% 的细胞对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）呈阳性反应，GFAP 是一种星形胶质细胞标志物（图 4G 以及图4H）。此外，约20–30%的细胞在分化后应仍保持巢蛋白（nestin）的表达图 4H）。需要考虑到每种细胞类型的百分比（即， 神经元，星形胶质细胞，巢蛋白+ 细胞）的传代次数可能有所不同，且可能存在使用者依赖性的变异。

通过分析特定的神经元亚群，GABA能神经元约占总细胞数的15 - 20%，多巴胺能神经元约占13 - 20%，谷氨酸能神经元约占35 - 42%，这分别通过针对γ-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）和囊泡型谷氨酸转运蛋白1（VGlut1）的免疫染色结果所示（代表性定量结果见图4H）。分化诱导的效果还可通过多能性相关标志物（例如，Oct4、Tra1-60和SSEA3）的分析进行评估，这些标志物在分化细胞中相较于未分化的hiPSC应显著下调（未展示，参见参考文献6）。该结果也可通过qPCR检测基因表达加以验证，应显示Oct4和Nanog表达下降，而神经元相关基因如神经细胞黏附分子1（NCAM1）和微管相关蛋白2（MAP2）、突触前基因突触素（SYP）以及突触后基因微管相关蛋白tau（MAPT）表达上调，如图4I所示。此外，与未分化细胞相比，分化后的神经元细胞中多巴胺能（TH和NR4A1）、去甲肾上腺素能（PHOX2A和PHOX2B）、谷氨酸能（NARG2、GRIA1和GAP43）、GABA能（GABRA1和GABRA3）、运动神经元（ISL1和LHX3）以及胆碱能（SLC5A7和SLC18A13）相关基因均呈现上调（图4J）。

通过多电极阵列（MEA）分析自发性电活动是评估分化后人诱导多能干细胞（hiPSCs）神经元网络功能的重要检测指标。在分化周期结束时，神经元衍生物通常表现出至少每分钟60个脉冲的平均放电率（MFR）（参见代表性点阵图 图 4K然而，未观察到爆发事件。

神经元分化示意图，免疫荧光显示细胞标志物，柱状图，数据分析。
图4. IMR90-hiPSCs向神经元与胶质细胞混合培养物的分化 （A 和 B） 7 DIV 后类胚体的代表性图像 （A） 12天后（DIV） (B)，用巢蛋白（绿色）和 β-III 微管蛋白（红色）染色。 （C 和 D） 分化细胞在培养22天后的代表性图像 （C） 以及 28 天体外培养（DIV） (D)，经 β-III-微管蛋白（红色）和 NF200（绿色）染色。 (E) 由神经 rosette 解离与扩增获得的神经干细胞代表性图像（插图为 nestin）+ 细胞，红色。 （F 和 G） 神经元细胞的代表性图像（F，用NF200（红色）和Tau（绿色）染色）以及胶质细胞（G，经GFAP染色（红色）后由NSCs分化而来（培养21天后）。(H) 通过高内涵成像（HCI）对nestin、MAP2、GFAP、γ-氨基丁酸（GABA）、囊泡型谷氨酸转运蛋白1（VGlut1）和酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞进行定量分析，比较IMR90-hiPSC直接分化细胞与由IMR90-hiPSC来源的NSCs分化所得细胞（图表改编自参考文献7）。 （I 和 J） 显示多能性基因（Oct4 和 Nanog）及神经元基因（NCAM1、MAP2、SYP 和 MAPT）qPCR 分析结果的柱状图 （I） 以及多巴胺能（TH 和 NR4A1）、去甲肾上腺素能（PHOX2A 和 PHOX2B）、谷氨酸能（NARG2、GRIA1 和 GAP43）、GABA 能（GABRA1 和 GABRA3）、运动神经元（ISL1 和 LHX3）和胆碱能（SLC5A7 和 SLC18A13）相关基因 (J)所有分析均以参考基因 β-actin 和 GAPDH 进行标准化，并以未分化细胞（绿色柱状图）作为校准对照。采用 ΔΔCt 法进行计算，数据为 5 次独立分析的均值 ± 标准误（S.E.M.）* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001. 图 I 和 J 中的图表修改自参考文献 6。 (K) IMR90-NSC来源神经元的代表性点阵图（记录时间不少于600秒；垂直条代表单个动作电位）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

在分化的 IMR90-hiPSCs 中，神经元标志物的特定表达谱被上调

在新的毒性测试范式中，明确细胞在暴露于特定毒物后发生的分子和细胞事件至关重要。因此，有必要表征在所研究的细胞模型中哪些信号通路被激活和/或上调。

可用于分析蛋白激酶基因表达的商业化芯片可用于比较未分化的 hiPSC 与分化细胞。分化的 IMR90-hiPSC 中，参与神经营养因子受体调控、轴突导向调节、神经突生长调控、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）受体、骨形态发生蛋白（BMP）/TGF-β 通路以及血小板源性生长因子（PDGF）受体相关基因的表达上调（图 5A 和 图 5B）。

RPPA 分析显示，分化后的 IMR90-hiPSCs 中特定神经元特征标志物表达上调。具体而言，分化过程中 Erk/CREB、Akt/PDK1/mTOR 和 Notch1 信号通路被激活（图 5C）。

IMR90 神经元蛋白激酶和磷酸化蛋白阵列图；mRNA 表达、通路分析、分化
图 5. 分化的神经元细胞和胶质细胞表现出神经元相关通路的激活。 （A 和 B） 柱状图显示了神经元相关激酶 （A） 及其他激酶相关基因 （B） 的 qPCR 分析结果。基因表达数据经参考基因 18S 和 GAPDH（阵列中提供）归一化，并以未分化细胞为对照进行校准。在这些分析中，当基因表达量至少为未分化细胞的 2 倍时（2-ΔΔCt≥ 2），认为其显著上调（3 次独立分析的均值 ± 标准误）。（C） 柱状图显示通过 RPPA 分析测定的蛋白质绝对定量结果，比较了分化细胞（红色柱）与未分化细胞（绿色柱）。属于相同信号通路级联的蛋白质被归类如下：CREB/Erk/Akt、PDK1/mTOR/Erk/Akt、Notch1、Shh 和 Wnt、SAPK/JNK，以及 BMP/SMAD。数据为 4 次独立分析的均值 ± 标准误。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；该图经修改自参考文献 6。请点击此处查看此图的放大版本。

可利用IMR90-hiPSC分化得到的神经元/胶质细胞培养物评估鱼藤酮的作用

鱼藤酮是一种线粒体呼吸链复合体 I 的抑制剂，已知可通过激活 Nrf2 通路引发氧化应激。在静息状态下，Nrf2 由 Keap1（Kelch 样 ECH 相关蛋白 1）锚定在细胞质中，Keap1 作为一种 Nrf2 抑制蛋白，可促进 Nrf2 的泛素化和蛋白水解15。当发生氧化应激时，Nrf2 转位至细胞核内，并激活 Nrf2-ARE 靶基因的表达16。

可通过将IMR90-hiPSC来源的神经元和胶质细胞暴露于不同浓度的鱼藤酮（例如，1、10 和 100 nM）中24小时，来评估鱼藤酮对Nrf2激活的影响。这些浓度是根据先前的研究确定的17,18。

在这些浓度和暴露时间下，鱼藤酮未引起细胞毒性，这一点通过活细胞DAPI的定量结果得以证实+ 细胞核（图6A）。鱼藤酮诱导 Nrf2 的核转位，尤其是在细胞暴露于 100 nM 鱼藤酮后更为显著（图6B 和 图6E）。在相同浓度下，观察到细胞质中Keap1显著减少（图 6C)，以及两种Nrf2靶向酶——NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）和硫氧还蛋白还原酶1（SRXN1）的增加19,20 (图6D).

Rotenone 对细胞中 Nrf2/Keap1 通路的影响；柱状图与荧光显微镜结果
图6. 鱼藤酮对Nrf2核转位、Keap1、SRXN1和NQO1蛋白水平的影响。 （A） 活细胞DAPI染色定量+ 细胞（即， 经24小时1、10、100 nM鱼藤酮处理后非固缩性细胞核数量，相对于未处理细胞（对照，Ctr）进行归一化。 (B) Nrf2 蛋白的核转位（即， 经24小时鱼藤酮暴露后，通过高内涵成像（HCI）分析荧光强度测定细胞核/细胞质比值。 (C) 通过高内涵成像分析评估鱼藤酮处理后细胞质中Keap1蛋白水平的定量 (D) 通过免疫荧光和高内涵筛选（HCI）定量鱼藤酮处理24小时后的NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）和硫氧还蛋白还原酶1（SRXN1）。 (E) Nrf2 蛋白定位（绿色）的代表性图像。所有数值均表示为 3 次生物学重复的均值 ± 标准误。* p < 0.05，** p < 0.01；图改编自参考文献7。 请点击此处以查看此图的放大版本。

在这些浓度和处理时间下，鱼藤酮同样诱导了星形胶质细胞（GFAP）的浓度依赖性增加+细胞百分比 (图7A 和 图7B），而不影响NSCs（nestin+）和神经元（MAP2+) (图7B）。通过分析特定神经元亚型的比例，鱼藤酮处理（10 nM 和 100 nM）显著减少了多巴胺能神经元（TH+) (图7C 和 D），而GABA能（GABA+）和谷氨酸能（VGlut1+）神经元未发生变化（图7D）。类似地，先前的 体内 和 体外 已有研究描述了依赖于鱼藤酮的选择性多巴胺能神经元细胞死亡21,22,23.

鱼藤酮对神经细胞的毒性影响；显微镜图像（GFAP, TH）；柱状图（细胞标志物分析）
图7. 鱼藤酮对胶质细胞和多巴胺能神经元的影响。 (A) GFAP+细胞（红色）的代表性图像，插图为40倍放大倍数，分别为未处理组或经100 nM鱼藤酮处理24小时的样本。(B) nestin+、MAP2+和GFAP+细胞的定量分析，以未处理组细胞（对照组，Ctr）为基准进行标准化。(C) 多巴胺能TH+神经元（绿色）的代表性图像，插图为40倍放大倍数，分别为未处理组或经100 nM鱼藤酮处理24小时的样本。(D) GABA+、VGlut1+和TH+神经元细胞的定量分析，以未处理组细胞（Ctr）为基准进行标准化。所有数值均表示为3次生物学重复实验的均值±标准误（S.E.M.）。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；本图修改自参考文献7。 请点击此处查看本图的放大版本。

采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验作为事后检验（将所有组与对照组进行比较）24，或根据分析类型采用双尾非配对或配对t检验来评估统计学显著性。所有数据均表示至少三次生物学重复的平均值±均值标准误（S.E.M.）。柱状图上方的星号表示与对照组相比具有显著性差异。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

表1.
关于解离后类胚体集落接种密度的说明：如果类胚体集落未完全解离，在达到约15,000个细胞/cm2的接种密度时，可将来源于约50个拟胚体（EBs）/1个60 mm培养皿的解离后类胚体集落重悬于50 mL完全NRI培养基中，并按以下方式接种（根据培养板规格而定）：

多孔板 / 微电极阵列（MEA）生长面积（cm2/孔）每孔（或MEA芯片）接种的细胞悬液体积可接种的最大板数（使用50 ml细胞悬液）
96孔0.3100 µl5
48孔0.7220 µl4
24孔2625 µl3
12孔41.25 ml3
6孔103.125 ml2
单孔MEA芯片3.51.1 ml45

表2：可接受标准

标记物 / 抗体培养28天后 DAPI+（活细胞）中的百分比
B-III-微管蛋白 (Tuj1)35-45%
MAP250-60%
NF20045-55%
GFAP10-25%
Nestin15-25%

讨论

本研究描述了一种稳健且相对快速的将IMR90-hiPSCs分化为终末期神经元和胶质细胞的方案。以往基于hESCs和hiPSCs发表的神经元分化方案通常可获得高比例的神经前体细胞25,26，以及大量目标神经元细胞27,28,29,30,31,32,33。类似地，本文所述的分化方案适用于生成包含GABA能、谷氨酸能和多巴胺能神经元细胞的混合培养物，同时伴有胶质细胞及少量nestin+细胞。谷氨酸能神经细胞（约35–42%）和GABA能神经细胞（约15–20%）的存在提示该培养体系具有前脑、皮层样特征，而多巴胺能神经元的少量存在（约13–20%）也可能指示中脑特异性。此外，少量nestin+细胞的持续存在可能适用于研究神经发生过程，以及化学物质对神经干细胞（NSCs）的潜在影响，因为NSCs主要局限于前脑的海马区和侧脑室下区（SVZ）34。进一步的免疫细胞化学和基因表达分析将有助于更精确地界定分化后细胞产物的区域特异性。

本文件所述分化方案中最关键的两个步骤是：（i）将hiPSC集落切割为均一的片段（这对生成大小均一的拟胚体至关重要）；以及（ii）切割神经外胚层结构（即玫瑰花环样结构）以进行神经干细胞分化，该步骤需要较高的手动操作技巧和精确性，以避免混入中胚层和内胚层细胞，从而防止最终分化获得的神经元和胶质细胞比例降低。

在扩增过程（作为未分化集落或神经干细胞）以及所有分化阶段中，对细胞的表型进行表征至关重要。特别是，神经/胶质细胞衍生物的基因和蛋白质表达谱应显示神经元相关信号通路的上调和激活，而多能性标志物的表达则应降低。

拟胚体（EBs）和神经外胚层衍生物（神经样集落）的生成在手动操作中可能具有挑战性，且容易产生变异。因此，我们开发了一种从神经样集落来源的神经干细胞（NSCs）扩增并进一步分化为神经元/胶质细胞的实验方案。

该分化方案的可能局限性主要包括：（i）分化的胶质细胞衍生物比例相对较低，以及（ii）缺乏成熟的神经元网络功能（表现为无簇状放电现象）。此外，特定亚群的星形胶质细胞可作为主要前体细胞或神经干细胞（NSCs）35。尽管在此类分化细胞培养物中未观察到nestin/GFAP双阳性细胞（数据未显示），但推测这些混合培养物中的GFAP+细胞为星形胶质前体细胞和星形胶质细胞。延长分化时间可能会增加星形胶质细胞的数量，并使其形态更加成熟，这已在此前Zhang团队的研究中得到初步提示36,37。

在新的毒性测试范式中，了解化学物质对生物通路的干扰效应在评估化学物质有害性时至关重要。因此， 体外 根据不良结局通路（AOP）的概念，测试系统应能够将不良效应与信号通路的扰动相关联。作为概念验证，可使用鱼藤酮评估Nrf2通路的激活，该通路参与细胞防御氧化应激或亲电应激的过程38，氧化应激是多种与发育性和成人性神经毒性相关的不良结局路径（AOP）中重要且常见的关键事件39.

鱼藤酮应可引发 Nrf2 通路的激活，可通过 Nrf2 蛋白的核转位以及 Nrf2 靶酶（包括 NQO1 和 SRXN1）表达水平的升高予以证实。研究发现，鱼藤酮可诱导 GFAP 蛋白水平呈剂量依赖性升高，提示星形胶质细胞被激活。40,41. 鱼藤酮还会减少多巴胺能（TH+) 细胞，这与之前的研究结果一致 体外 和 在体内 显示鱼藤酮依赖性多巴胺能细胞死亡的研究，因为这类神经元对氧化应激特别敏感21,22,23.

总之，这种由hiPSC衍生的神经元和胶质细胞培养模型是评估引发氧化应激并导致Nrf2通路激活的化学物质神经毒性效应的有力工具。由于该分化方案能够生成包含多种神经元（GABA能、多巴胺能和谷氨酸能神经元）与星形胶质细胞的混合培养体系，因此可能适用于研究生理和病理条件下神经元与胶质细胞之间的相互作用，例如在神经退行性疾病中的相互作用。例如， 帕金森病）。此外，存在较大量的神经干细胞（NSCs）可能有助于评估化学物质对神经前体细胞的潜在影响，因为神经前体细胞已知是化学诱导突变或病毒感染的主要靶标。42.

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢法国埃夫里的I-Stem研究所Marc Peschanski博士提供了IMR90-hiPSCs；感谢意大利克雷莫纳Avantea srl公司的Giovanna Lazzari博士和Silvia Colleoni博士；感谢德国波恩大学Simone Haupt博士；感谢意大利罗马意大利技术研究院Tiziana Santini博士在免疫荧光染色评估方面提供的建议；感谢意大利帕多瓦大学Benedetta Accordi博士、Elena Rampazzo博士和Luca Persano博士在反相蛋白微阵列（RPPA）分析及抗体验证方面的贡献。经费支持：本研究由欧盟资助项目“SCR&Tox”（资助协议编号 N°. 266753).

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
完全hiPSC培养基：
mTeSR1 基础培养基干细胞技术05851（步骤 1.2.6）mTeSR1 完全培养基在 2 - 8 °C 长达 2 周。5x 补充剂可分装成工作 aliquots 并于 -20 °C在3个月内使用冷冻分装样品。
mTeSR1 5倍添加剂干细胞技术05852
Matrigel hESC-认证基质康宁3542771:100（步骤1.1）。将Matrigel置于冰上解冻，准备 200 μL 分装并储存于 -80 °C。用于包被，稀释 200 μL 分装至20 mL DMEM/F12培养基中。
CryoStem 冻存培养基Stemgent01-0013-50冻存约 100 个片段/250 μL/vial （步骤 1.2.1）
名称公司目录编号评论
hiPSC EB 培养基：
Knockout DMEMThermo-Fisher10829-018（步骤 2.1.7）
Knockout血清替代物（KOSR）Thermo-Fisher10828-02820% 最终浓度（步骤 2.1.7）
非必需氨基酸Thermo-Fisher11140-035（步骤 2.1.7）
青霉素/链霉素Thermo-Fisher15140-12250 U/mL 终浓度（步骤 2.1.7）
L-谷氨酰胺 200 mM 溶液Thermo-Fisher25030-0812 mM 终浓度（步骤 2.1.7）
β-巯基乙醇Thermo-Fisher31350-01050 µM 终浓度（步骤 2.1.7）
名称公司目录编号评论
完全神经上皮诱导培养基（NRI）：
DMEM/F12Thermo-Fisher3133-038（步骤 2.3.1）
非必需氨基酸Thermo-Fisher11140-035（步骤 2.3.1）
N2 补充剂Thermo-Fisher17502-048（步骤 2.3.1）
青霉素/链霉素Thermo-Fisher15140-12250 U/mL 终浓度（步骤 2.3.1）
肝素 I-A 型， ≥180 USP 单位/毫克Sigma-AldrichH3149-100KU2 µg/mL 终浓度（步骤 2.3.1）
bFGFThermo-Fisher13256-029使用前添加，终浓度为 20 ng/mL（步骤 2.3.1）
Matrigel 基底膜基质康宁3542341:100（步骤2.2）。将Matrigel置于冰上解冻，准备 200 μL 分装并储存于 -80 °C。用于包被，稀释 200 μL 分装至20 mL冷的DMEM/F12培养基中。
层粘连蛋白Sigma-AldrichL20201:100（步骤2.2）。用1×PBS稀释。
名称公司目录编号评论
完全神经元分化培养基（ND）：
Neurobasal 培养基Thermo-Fisher21103049（步骤 2.4.11）
B-27添加剂（50倍浓缩液）Thermo-Fisher17504044（步骤 2.4.11）
N2 补充剂Thermo-Fisher17502-048（步骤 2.4.11）
青霉素/链霉素Thermo-Fisher15140-12250 U/mL 终浓度（步骤 2.4.11）
GDNFThermo-FisherPHC7045终浓度为1 ng/mL。使用前添加。（步骤 2.4.11）
BDNFThermo-FisherPHC70742.5 ng/mL 终浓度。使用前添加。（步骤 2.4.11）
名称公司目录编号评论
神经诱导培养基（NI）：
DMEM/F12Thermo-Fisher3133-038（步骤 3.3）
非必需氨基酸Thermo-Fisher11140-035（步骤 3.3）
N2 补充剂Thermo-Fisher17502-048（步骤 3.3）
青霉素/链霉素Thermo-Fisher15140-12250 U/mL 终浓度（步骤 3.3）
肝素 I-A 型， ≥180 USP 单位/mgSigma-AldrichH3149-100KU2 µg/mL 终浓度（步骤 3.3）
B-27 补充剂（50倍浓度），不含维生素AThermo-Fisher12587010（步骤 3.3）
L-谷氨酰胺 200 mM 溶液Thermo-Fisher25030-0812 mM 终浓度（步骤 3.3）
bFGFThermo-Fisher13256-029终浓度为10 ng/mL。使用前添加（步骤3.3）
EGFThermo-FisherPHG6045终浓度为 10 ng/mL。使用前添加（步骤 3.3）
BDNFThermo-FisherPHC70742.5 ng/mL 终浓度。使用前添加（步骤 3.3）
定义的胰蛋白酶抑制剂（DTI）Thermo-FisherR007-100预热于 37 °C. 向胰蛋白酶-EDTA（步骤 3.10）中加入等量的 DTI
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红Thermo-Fisher154000541:10。用不含钙和镁的1×PBS稀释胰蛋白酶-EDTA，将溶液预热至 37 °C （步骤 3.8）
CryoStor 细胞冻存培养基Sigma-AldrichC2874-100ML（步骤 4.2）
台盼蓝（0.4%）Sigma-AldrichT8154-100ML多家制造商/供应商
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TaqMan 探针组和基因表达分析试剂：
RNAqueous-Micro 试剂盒Thermo-FisherAM1931（步骤 5.1.6）
高容量 cDNA 逆转录试剂盒Thermo-Fisher4368814
TaqMan基因表达主混合液Thermo-Fisher4369016
GFAPThermo-FisherHs00909233_m1
MAP2Thermo-FisherHs00258900_m1
NQO1Thermo-FisherHs02512143_s1
SRXN1Thermo-FisherHs00607800_m1
HMOX1Thermo-FisherHs01110250_m1
GSRThermo-FisherHs00167317_m1
PAX6Thermo-FisherHs01088112_m1
神经外胚层干细胞Thermo-FisherHs00707120_s1
GRIA1Thermo-FisherHs00181348_m1
GAP43Thermo-FisherHs00967138_m1
GABRA3Thermo-FisherHs00968132_m1
GABRA1Thermo-FisherHs00168058_m1
NR4A2Thermo-FisherHs00428691_m1
THThermo-FisherHs00165941_m1
GAPDHThermo-FisherHs02758991_g1
ACTBThermo-FisherHs99999903_m1
MAPTThermo-FisherHs00902194_m1
SYPThermo-FisherHs00300531_m1
NANOGThermo-FisherHs04260366_g1
POU5F1 (OCT4)Thermo-FisherHs04195369_s1
SOX1Thermo-FisherHs01057642_s1
甲胎蛋白Thermo-FisherHs00173490_m1
KRT18Thermo-FisherHs01941416_g1
NPPAThermo-FisherHs00383230_g1
TThermo-FisherHs00610080_m1
NCAM1Thermo-FisherHs00941821_m1
NR4A1Thermo-FisherHs00374226_m1
PHOX2AThermo-FisherHs00605931_mH
PHOX2BThermo-FisherHs00243679_m1
NARG2Thermo-FisherHs00973298_g1
SLC18A3Thermo-FisherHs00268179_s1
SLC5A7Thermo-FisherHs00222367_m1
ISL1Thermo-FisherHs00158126_m1
LHX3Thermo-FisherHs01033412_m1
TaqMan 人蛋白激酶阵列Thermo-Fisher4418721
名称公司目录编号评论
免疫染色用抗体和试剂：
B-III-微管蛋白（Tuj1）科文斯MMS-435P1:500（步骤 5.2.5）。也可使用其他抗体。
MAP2Sigma AldrichM44031:500
NF200Sigma AldrichN41421:1000
GFAPAcris Antibodies GmbHAP02002SU-N1:500
NestinSigma-AldrichN54131:200
突触素（SYN）AbcamAB146921:200
TauThermo-FisherMA5-128081:100
Nrf2AbcamAB623521:200
Keap1AbcamAB666201:200
硫氧还蛋白还原酶1（SRXN1）AbcamAB922981:200
NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）AbcamAB23461:200
OCT4MilliporeMAB44011:100
SSEA3默克密理博MAB43031:100
Tra1-60MilliporeMAB43601:250
酪氨酸羟化酶（TH）MilliporeAB1521:200
γ-氨基丁酸（GABA）Sigma-AldrichA03101:100
囊泡型谷氨酸转运蛋白1（VGlut1）AbcamAB723111:500
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148-500G4%（也可使用4%甲醛）
DPBS，无钙，无镁Thermo-Fisher14190144
Triton-X-100 溶液Sigma-Aldrich93443-100ML0.1%
BSA 35%Sigma-AldrichA7979-50ML3.5%
驴抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 594标记Thermo-FisherSA5-100401:500。（步骤 5.2.7）也可使用其他荧光染料标记的二抗。在此情况下，最终使用者应测试适当的稀释比例。
驴抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 488标记Thermo-FisherSA5-101661:500
驴抗山羊IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 488标记Thermo-FisherSA5-100861:500
DAPI溶液（1 mg/mL）Thermo-Fisher622481:1000（步骤 5.2.7）
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用于反相蛋白质微阵列（RPPA）的抗体：
4E-BP1（S65）AbcamAB812971:250（步骤 5.2.8 后注）
Akt（T308）细胞信号传导92751:100
Akt（S473）细胞信号传导92711:100
AMPKα（T172）细胞信号传导25311:100
AMPKβ1（S108）细胞信号传导41811:100
ATF-2（T71）细胞信号传导92211:100
c-Jun（S63）细胞信号传导92611:200
c-Jun（S73）细胞信号传导91641:200
c-Kit（Y719）细胞信号传导33911:250
CREB（S133）细胞信号传导91911:100
EGFR（Y1068）细胞信号传导22341:50
ErbB2/HER2（Y1248）细胞信号传导22471:100
ERK 1/2，p44/42（T202/Y204）细胞信号传导91011:2000
GSK-3α (S21)细胞信号传导93371:50
Jak1 (Y1022/1023)细胞信号传导33311:100
Lck (Y505)细胞信号传导27511:500
LKB1（S428）细胞信号传导30511:100
mTOR（S2448）细胞信号传导55361:100
NFκB p65 (S536)细胞信号传导30311:50
p70 S6激酶（T389）细胞信号传导92051:200
PDK1（S241）细胞信号传导30611:100
PKA C (T197)细胞信号传导47811:250
PRAS40（T246）BioSource44-11001:2000
PTEN（S380）细胞信号传导95511:500
Smad1（S463/465）、Smad5（S463/465）、Smad8（S426/428）细胞信号传导95111:500
Src（Y527）细胞信号传导21051:500
Src家族（Y416）细胞信号传导21011:200
Stat1（Y701）细胞信号传导91711:200
Stat3（S727）细胞信号传导91341:200
Zap-70 (Y319)EnogeneE0111591:100
β连环蛋白（S33/37/T41）细胞信号传导95611:250
CREBUpstate Biotechnologies06-8631:100
Fos B细胞信号传导22511:200
GRB2细胞信号传导39721:2000
HSP70StressgenSPA-8101:100
c-Jun细胞信号传导91651:100
Kip1/p27BD6102411:100
Lck细胞信号传导29841:250
Mcl-1细胞信号传导45721:80
Musashi细胞信号传导21541:100
NOTCH1细胞信号传导34391:100
PTEN细胞信号传导95521:500
SGK1AbnovaPAB45901:250
Zap-70细胞信号传导27051:250
β-连环蛋白AbcamAB325721:1000
Dll4AbcamAB72801:500
ShhAbcamAB532811:250
HIF-1αBD6109581:50
NUMB 全亚型Upstate Biotechnologies07-2071:400
NUMB-LChemiconAB151451:750
细胞周期蛋白BBD6102201:75
c-MycCalbiochemOP-101:100
BCIP/NBT 试剂盒Thermo-Fisher002209（步骤5.2.8后的说明）。用于检测碱性磷酸酶活性的试剂盒，类似试剂盒亦可使用。
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流式细胞术抗体：
SSEA1 抗体，Pacific Blue 标记Thermo-FisherMHCD15281:100（步骤 5.2.8 后注）
SSEA4 抗体（MC813-70），Alexa Fluor 647Thermo-FisherSSEA4211:100
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特定仪器、工具和软件：
Countess 自动细胞计数仪Thermo-FisherC10227可使用血细胞计数板或其他合适的玻璃血细胞计数器。
MEA1060-Inv-BC多通道系统MEA1060-Inv-BC（步骤 5.3）
MEA1060-BC 控制软件多通道系统MEA1060-BC（步骤 5.3）
NeuroExplorer多通道系统NeuroExplorer (NE)（步骤 5.3）用于MEA数据的后处理
多电极阵列（MEA）多通道系统60MEA100/10iR-Ti-gr（步骤 5.3）单孔微电极阵列芯片
ArrayScan XTI 高内涵分析平台Thermo-FisherASN00002P（步骤 5.2.8）可使用特定的 ArrayScan 算法（例如 Cytotoxicity V.4 和 NucTrans V.4 生物应用）对平均荧光强度进行定量。建议每孔至少采集 20 张图像，每种条件设置 7–8 个内部重复
7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统Thermo-Fisher4351405（步骤 5.1.6）
BD ULTRA-FINE 胰岛素注射器（带30G针头）BD328280（步骤 1.3.1、2.1.2 和 2.4.1）
StemPro EZPassage 一次性干细胞传代工具ThermoFisher23181010该集落切割工具可作为30G针头1 mL注射器（步骤1.3.1）的替代使用
超低吸附培养皿（60 mm）康宁10010582（步骤 2.1.8）也可使用其他品牌。
Mr. Frosty 冷冻容器Sigma-AldrichC1562-1EA

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